專利名稱：高效雙啟動子PLEGFP-N1-spMyoD1綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物基因工程及動物分子育種工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的不斷提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，市場對畜產(chǎn)品的需求逐漸由數(shù) 量向質(zhì)量轉(zhuǎn)變，傳統(tǒng)的常規(guī)育種方法已經(jīng)不能適應發(fā)展的需求。關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物的培育日 益引起世界諸多國家的高度重視并已投入了大量人力物力進行開發(fā)研究。從Hammer等 (1985)成功獲得第1批轉(zhuǎn)基因豬到現(xiàn)存，關(guān)于轉(zhuǎn)基因豬的研究已經(jīng)歷20多年的歷史，其 中，從對豬生產(chǎn)性能的遺傳改良到用豬作為異種器官移植的供者等方面，均取得了一系列 突破性進展。1990年，我國首批轉(zhuǎn)生長激素基因豬在湖北省農(nóng)業(yè)科學院誕生。此后，多種 轉(zhuǎn)基因豬相繼問世。1991年美國DNA公司成功獲得了能生產(chǎn)人血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因豬。通 過這些能高效表達的轉(zhuǎn)基因豬來提供大量安全、廉價的血紅蛋白，既可節(jié)約醫(yī)藥費，又能避 免使用過期、有傳染性(如肝炎、艾滋病等)的血液。1993年，Suetlali等將含有編碼小鼠 Mxl蛋白的cDNA的3種基因構(gòu)件分別轉(zhuǎn)移到豬中，獲得Mxl轉(zhuǎn)基因豬。湖北省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧研究所與中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所合作，將抗豬瘟病毒(HCV)的核酶基因?qū)?豬中，獲得抗豬瘟病毒的轉(zhuǎn)基因豬。1994年，德國成功培育出轉(zhuǎn)入生長激素(GH)的轉(zhuǎn)基因 豬，使世界上出現(xiàn)了壯如小牛的“超級豬”。2001年，加拿大的科學家培育出的攜帶大腸桿 菌phytase基因的轉(zhuǎn)基因豬.這種豬可以在唾液中分泌phytase.從而提高對飼料中磷的 消化率.使豬糞中的磷含量比正常豬降低75%。2004年日本近畿大學Saeki K等將菠菜 Δ-12去飽和酶基因轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)，培育出不飽和脂肪酸含量高的轉(zhuǎn)基因豬。2006年底，東北 農(nóng)業(yè)大學教授劉忠華帶領(lǐng)的團隊研制出中國首只轉(zhuǎn)基因“熒光豬”。這種“熒光豬”在紫外 線的照射下，身體上會發(fā)散出晶瑩的綠光。2006年3月，美國科學家培育出了體內(nèi)含有大 量ω-3脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)基因健康豬。2009年，湖北省農(nóng)業(yè)科學院與國內(nèi)科研機構(gòu)合 作，也培育出了含有ω-3脂肪酸去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因保健豬，這種基因能在豬體內(nèi)合成 大量的ω-3脂肪酸；可降低膽固醇和血壓，有助于預防人類的心血管疾病。在此過程中，動 物轉(zhuǎn)基因技術(shù)也同時得到了多方面的改進和創(chuàng)新。目前，優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因豬等的培育已經(jīng)成為 國內(nèi)外研究的熱點之一。優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因豬培育的目的在于提高豬肉的品質(zhì)、嫩度和風味等，在 轉(zhuǎn)基因育種上游技術(shù)開發(fā)方面，具有重要育種價值的功能基因篩選和組織特異高效表達載 體的構(gòu)建，一直被視為優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因豬培育的核心技術(shù)競爭焦點之一。在具有重要育種價值的功能基因篩選方面，人們通過不同的技術(shù)手段篩選了 許多與豬肉的品質(zhì)、嫩度等密切相關(guān)的侯選基因或重要功能基因，其中，生肌決定因子 (MyoD)基因家族控制著肌細胞的增殖和分化，與肌纖維的數(shù)量、大小有著密切的關(guān)系，因 而對肉質(zhì)和風味有非常重要的作用，MyoD基因家族可編碼4種不同的轉(zhuǎn)錄因子，分別為 MyoDl (Myf 3)、Myogenin (MyoG)、Myf5、Myf6 (MRF4)，它們各自或協(xié)同控制著骨骼肌生成方面 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
生肌因子I(MyoDl)是生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族 四成員(MyoD、MRF5、MyoG、MRF4)之一，1987年首次被克隆。MyoDl基因不僅可促使靜止期 的肌衛(wèi)星細胞向成肌細胞轉(zhuǎn)化，而且能把許多種類型細胞(如成纖維細胞、脂肪細胞等)轉(zhuǎn) 化為成肌細胞，并可促進成肌細胞進一步融合、分化為成熟的肌纖維。在肌肉特異性基因轉(zhuǎn) 錄調(diào)控中起著總開關(guān)的作用。MyoDl可激活肌肉基因轉(zhuǎn)錄，使非肌細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〖毎?，因?骼肌細胞和心肌細胞具有基本相同的收縮裝置，通過外源MyoDl誘導心肌成纖維細胞向骨 骼肌細胞轉(zhuǎn)變。肌纖維早在胚胎發(fā)育早期就已經(jīng)形成，并通過成肌細胞的增生和分化得以 生長。胎兒出生后，肌肉細胞的生長是基于成肌細胞和衛(wèi)星細胞的增生和分化。肌衛(wèi)星細 胞的增殖和分化可以影響個體的肌肉生長速度和產(chǎn)量，MyoDl基因的變異可能會影響一些 與肌肉相關(guān)的生產(chǎn)性狀，在畜牧生產(chǎn)中具有潛在的應用價值。Knoll報道，豬的MyoDl內(nèi)含 子1有1個Dde I PCR-RFLPs位點，MyoDl的A突變基因具有使肌纖維生長更充分，肌纖維 變粗，面積增大的作用。A基因還具有增加胴體瘦肉率和眼肌面積，降低皮脂含量，提高腿臀 比例，增加胴體長度等提高胴體品質(zhì)的效應，但A基因也會導致肉質(zhì)的劣變。2005年，朱礪 等對MyoDl基因在不同豬種中的PCR-RFLP遺傳多態(tài)性及其遺傳效應研究中，得到了相似的 結(jié)果。這些效應可能與MyoD基因在肌肉生成的早期表達，參與早期肌肉分化的作用有關(guān)。 但Jolanta等的研究表明，MyoDl基因?qū)﹄伢w性狀的遺傳效應依賴于所研究的品系。對此， 還需要進一步的研究。Cieslak等對波蘭2個種豬場內(nèi)7個品種共229頭豬進行了 MyoD基 因型與胴體等級性狀間的相關(guān)性分析，結(jié)果表明MyoDl基因型會對胴體的分割肉產(chǎn)生顯著 影響，但是在兩次重復試驗間的試驗結(jié)果卻完全相反。據(jù)此，他們推斷可能還存在一個未知 的連鎖位點在影響相關(guān)性狀的表型。TePas等的研究表明豬高水平的MyoG、Myf5和MyoDl 的mRNA表達，可以作為選擇較高水平的增長率的一個指標。另外，在對瘦肉率進行選擇的 過程中，MyoG與MyoDl的比率也可以作為肉色與肌纖維組成比率的指標。MyoDl是生肌調(diào) 節(jié)因子家族的一個重要的基因，在特異肌基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著總開關(guān)的作用。MyoDl介導 的肌分化機制作為研究細胞分化的最佳模型，已成為當前研究的焦點。隨著現(xiàn)代分子生物 學的不斷發(fā)展，人們越來越認識到MyoDl在成肌作用中的重要作用。有鑒于此，本研究對豬 MyoDl基因(pMyoDl)全長⑶S序列進行了克隆、骨骼肌組織特異性高效表達啟動子(SP)合 成、SP與pMyoDl融合基因的重疊PCR擴增及逆轉(zhuǎn)錄病毒PLEGFP-Nl_spMyoDl表達載體構(gòu) 建與真核表達鑒定等，為今后進一步用于轉(zhuǎn)基因(PMyoDl基因)動物的制作奠定了基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建方面，目前用于轉(zhuǎn)基因目的真核表達載體種類較多，但概括起 來，可用于外源性基因真核表達研究的載體分為病毒和非病毒載體兩大類。病毒載體具有 轉(zhuǎn)染效率高，表達穩(wěn)定等特點，但因其易整合到靶細胞染色體內(nèi)，故安全性差。非病毒載體 大部分為各種質(zhì)粒，進入靶細胞后，以附加體的形式存在，具有安全性好，容量大等特點。此 外，報告基因的選擇也真核表達載體構(gòu)建的關(guān)鍵之一。近幾年來，報告基因已普通應用于分 子生物學的研究中，常用的有β半乳糖苷酶(LacZ)、β _葡萄糖苷酸酶(⑶S)、分泌型胎盤 磷酸脂酶(SSEAP)、螢火蟲熒光素酶(LUC)等。1994年一種新的報告基因增強型綠色熒光 蛋白(EGFP)基因引起了許多學者的注意，該蛋白能夠自身催化形成發(fā)光結(jié)構(gòu)，并在藍色激 光下發(fā)出綠色熒光。綠色熒光蛋白最初是在多管水母中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)?，F(xiàn)已證實EGFP 基因能夠在多種生物，如細菌、粘菌、酵母、植物和哺乳動物中表達并發(fā)出熒光。EGFP之所以 能夠作為報告基因是因為它具有以下幾個特性(1)種屬不依賴性，能夠在多種生物中表達；(2)熒光強度高，可在普通熒光顯微鏡下觀測；(3)不需要反應底物與輔助因子，因此不 同于以往常用的LacZ、LUC、CAT、GUS等報告基因；(4)相對較小的分子和單體蛋白使之易于 融合；(5)EGFP肽鏈中一些特定氨基酸的替代可使之產(chǎn)生不同顏色的光。增強型綠色熒光 蛋白(EGFP)是將Ser65用Thr代替，Phe64用Leu代替，使EGFP的熒光強度提高了 35倍， 而且轉(zhuǎn)染16-24h后仍可穩(wěn)定表達。由于EGFP作為報告基因具有直觀、及時、應用范圍廣的 特點，因而在基因整合、細胞分選及轉(zhuǎn)基因動物的研究是其它報告基因所無法比擬的。PLEGFP-N1載體的結(jié)構(gòu)特點包括(l)PLEGFP-Nl載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一種。 因在多克隆位點旁插入一個能表達綠色熒光的融合蛋白，所以能直接在熒光顯微鏡下進行 目的基因轉(zhuǎn)染和感染效率的觀察，更有利于研究和應用。(2) LEGFP-NI是切除了 gag、pol、 env等病毒結(jié)構(gòu)基因的缺陷型病毒載體，不能形成子代病毒顆粒，必須借助包裝細胞提供的 病毒結(jié)構(gòu)蛋白完成包裝，產(chǎn)生具有感染性但無復制能力的偽病毒顆粒；故安全性高。(3)含 有人巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子。(4)MCS下游緊接EGFP，外源目的基因插入后與 EGFP形成融合基因；若EGFP有表達，則外源目的基因一定是插人片段正確且有表達；EGFP 起始點插有Kozak序列以提高在真核細胞的翻譯效率。(5)含有Amp、Neo基因，前者可用 氨芐青霉素篩選原核細胞；后者可用G418來篩選真核靶細胞?；诓煌难芯亢蛻媚康?，張勇等(2003)構(gòu)建鼠真核表達的雙順反子質(zhì)粒載 體pIRES2-EGFP-MyoD，為研究MyoD對肌損傷的修復作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。為研究MASHl在間 充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化中的作用，趙杰等(2006)構(gòu)建了含小鼠MASHl基因的綠色熒光蛋白表 達載體PEGFP2-C3-MASH-1。劉芳等(2006)進行了 pEGFP-植酸酶基因質(zhì)粒重組構(gòu)建及其在 C0S7細胞中表達分析。王國棟等(2007)構(gòu)建了 pEGFP-Nl-heNOS真核表達重組質(zhì)粒。為分 析ZNF580-EGFP融合蛋白在人胚腎HEK293細胞中的表達和亞細胞定位，張文成等(2008) 構(gòu)建了人ZNF580與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表達載體。唐小龍等(2008) 構(gòu)建了人胰腺十二指腸同源框蛋白 l(pancreatic and duodenal homeobox factorl,Pdxl) 轉(zhuǎn)錄因子真核表達質(zhì)粒，并檢測其在真核細胞中的表達能力及其生物活性。為腫瘤的診斷 及治療提供新的線索，張姍妮等(2009)構(gòu)建了人Caveolin-Ι基因PEGFP-Nl真核表達載 體。為研究PPl α對骨肉瘤細胞凋亡影響，崔笑等(2010)構(gòu)建了 pEGFP-Nl-PPla真核表 達載體。黎靜等(2010)克隆人類ZNF217基因cDNA全長，構(gòu)建ZNF217的真核表達載體，并 在真核細胞中表達。韋光輝等(2010)克隆牛生長激素BGH基因并構(gòu)建了 pEGFP-Nl-BGH真 核表達載體。綜合以上的國內(nèi)外研究資料可發(fā)現(xiàn)，綠色熒光PLEGFP-Nl-MyoDl轉(zhuǎn)基因載體仍不 夠完備，現(xiàn)有的檢測技術(shù)方法仍存在如下兩個方面的不足1并非專用于豬的骨骼肌組織特異高效表達。2本方法制備的綠色熒光PLEGFP-Nl-spMyoDl轉(zhuǎn)基因載體是已經(jīng)過包被處理的， 可直接用于轉(zhuǎn)染待轉(zhuǎn)的靶細胞或靶組織，陽性標本的確定試驗仍為綠色熒光觀察及目的基 因片段的PCR擴增方法檢測鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效雙啟動子PLEGFP-Nl-spMyoDl綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體構(gòu)建及使用方法，它旨在克隆豬的MyoDl基因，構(gòu)建含有CMV和骨骼肌特異啟動子SP (雙啟動子)、以真核綠色熒光EGFP為標記、以豬MyoDl (pMyoDl)為外源基因的高效表達 載體。在改進后的綠色熒光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl載體中，又增加了一個調(diào)控綠色熒光蛋 白(EGFP)或其融合蛋白表達的骨骼肌組織特異性高效表達啟動子(SP)，從而實現(xiàn)了對綠 色熒光蛋白(EGFP)或其融合蛋白雙啟動子(Pqw和SP啟動子)控制的骨骼肌組織特異性 表達目的。同過去的方法比較，不僅彌補了目的基因組織表達特異性的不足，而且提高了在 特異組織(骨骼肌)中的表達強度和敏感度，同時提高了對目的基因功能研究的針對性和 準確度。為進一步研究PMyoDl蛋白表達、重組蛋白活性鑒定和生物學功能奠定基礎(chǔ)；同時 為用于轉(zhuǎn)PMyoDl基因的模型動物制備創(chuàng)造了條件。本發(fā)明的技術(shù)方案是首先人工合成一骨骼肌特異啟動子SP序列、采用RT-PCR方法從豬的骨骼肌組織中擴增MyoDl基因全長CDs序列；設計融合引物、利用重疊PCR擴 增方法獲得啟動子SP和pMyoDl的融合基因序列，T/A克隆到pMD18_T載體中，雙酶切后 將融合基因亞克隆入以真核表達綠色熒光蛋白為標記的逆轉(zhuǎn)錄病毒PLEGFP-N1載體，構(gòu)建 PLEGFP-Nl-spMyoDl雙啟動子高效表達載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定并測序。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 293T細胞系包裝、擴增，對病毒滴度和感染效率進行監(jiān)測。本發(fā)明的具體技術(shù)方案是1引物設計根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬MyoDl基因mRNA序列(Accession No. ΝΜ_001002824)，應用 Primer Premier5. O, DNA Club 和 Oligo 6. O 設計特異性引物 Pl 和P2，預期擴增長度為960bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。上游引物Pl:5' -ATGGAGCTGCTGTCGCCACCGCTC-3‘；下游引物P2:5' -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3'；2PCR擴增的反應條件用引物Pl和P2從RT-PCR產(chǎn)物cDNA擴增長度為960bp (lbp 960bp)的編碼區(qū) 序列。反應程序95°C預變性5min，進入循環(huán)95°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸2min， 循環(huán)總數(shù):30circles ；最后延伸72°C 4min。3骨骼肌組織特異性高效表達啟動子(SP)的合成參考GenBank中已發(fā)表的老鼠染色體1和2基因組的部分5、側(cè)翼調(diào)控區(qū)的保守 序列(Accession No. NT_039170,NW_001030694,NW_001030671)和雞骨骼肌組織 α-actin 基因的順式作用調(diào)控與轉(zhuǎn)錄控制區(qū)核心序列(AccessionNo. M13631)，優(yōu)化并合成了骨骼肌 組織特異性高效表達啟動子(SP)序列，啟動子SP序列見附件2。在其;T末端人工接一長 為24bp的寡聚核苷酸接頭。接頭序列5'-TACCTCGACGACAGCGGTGGCGAG-3‘。4SP與pMyoDl融合基因的重疊PCR擴增根據(jù)已合成的帶接頭的SP啟動子序列和擴增到的pMyoDl基因cDNA序列，應用 PrimerPremier5. 0和Oligo 6. 0設計特異性融合引物P3和P4，預期擴增長度為1240bp。在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看選擇的酶切位點，在所要進行PCR的基因 序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互補；在應用Oligo 6.0引物設計時，上下游引物全長輸入；上游引物位點的確定為5’端模板第一個堿基前面的所有堿基(包括酶 切位點+保護堿基)的負數(shù)值+1下游引物位點的確定為下游引物-酶切位點-保護性堿 基=A，序列全長-A+1 =下游引物位點。引物設計時候要考慮到序列的起始堿基和末尾堿 基中是否包含起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，如果有，要考慮是否需要刪除或者保 留。引物長度的選擇要考慮到CG比例，酶切位點的選擇要兼顧廉價，常用，而且要兼顧其加 入后引物的GC比例變化；還要考慮到酶切位點的序列是否在PCR的全序列中出現(xiàn)，如果出 現(xiàn)要選擇其它酶切位點。前面適當加堿基調(diào)節(jié)GAC比例，5’端照抄；3’端反向互補；保護性 堿基和酶切位點加在引物前面。自身互補，二聚體(兩個引物之間)<6，負數(shù)值越大能量 越大，退火溫度越高，錯配幾率越小。上游融合引物P3:5' -GACCTCGAGCACCATTCCTCACGACACCCA-3‘；下游融合引物P4:5' -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3‘；為下一步克隆需要，分別在上、下游引物中引入Xho I和BamH I酶切位點。重疊PCR擴增重疊PCR反應體系(50. 0 μ 1)見表2。反應程序95°C預變性3min， 進入循環(huán)94°C變形30s，53°C退火45s，72°C延伸3min，循環(huán)總數(shù):30circles ；最后延伸 720C 5min。PCR反應產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，并照相記錄，最后切膠回收純化 含有SP啟動子的融合MyoDl基因cDNA(spMyoD11240bp)5spMyoDl融合基因的克隆spMyoDl基因連接到pMD18T-Simple載體。連接體系(20. 0 μ 1)見表3 ；連接條 件16°C，5h，然后涂板、挑克隆、培養(yǎng)(加Amp)。將spMyoDl基因連接到pMD18T-Simple載 體的菌種進行測序，菌種記作pMD-spMyoDl。6逆轉(zhuǎn)錄病毒PLEGFP-Nl-spMyoDl表達載體構(gòu)建用BamH I 禾Π Xho I 進行亞克隆。將 spMyoDl 基因從 pMD-spMyoDl 用 XhoI、 BamH I酶切下來，亞克隆到同樣用這兩種內(nèi)切酶切酶過的PLEGFP-N1載體上，記作為 PLEGFP-Nl-spMyoDl ο spMyoDl與PLEGFP-附片段載體連接體系見表5。7純質(zhì)粒的提取取Iul質(zhì)粒加入到9ul的無菌水中，把IOul的混合液加到IOOul的DH5 α感受態(tài) 中，DH5 α感受態(tài)從負80度冰箱取出，冰上溶解，加入后冰上放置30分鐘，42度水浴45秒 后放入冰上1分鐘，加入890ul的LB培養(yǎng)基，37度搖床200轉(zhuǎn)培養(yǎng)一個小時，取200ul培養(yǎng) 菌涂布到含抗生素的LB平板上，37度倒置培養(yǎng)16-18小時，挑取菌落到500ul含抗生素的 培養(yǎng)基中12小時以上培養(yǎng)，24小時后吸取培養(yǎng)液200ul到2ml的含抗生素的LB培養(yǎng)基中 繼續(xù)12小時以上培養(yǎng)，吸取2ml培養(yǎng)菌，按照超純質(zhì)粒提取試劑盒中方法進行質(zhì)粒提取。8細胞復蘇從液氮中取出一支凍存的293T細胞，快速的在37°C水浴鍋中溶解，把293T細胞吸 到裝有IOml的培養(yǎng)液的50ml的離心管中，1500rpm離心5分鐘，倒掉廢液，加入2ml的培養(yǎng) 基(DMEM+10%的胎牛血清+1%雙抗)，溫和晃均勻，把2ml的細胞懸液加到6孔板中的一個 孔里，放入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，根據(jù)細胞情況進行消化傳代。細胞長滿90%時可以傳代，用37°C預熱的PBS洗兩遍，加入200ul的0. 25%的胰酶消化，細胞變形后(一般是10秒)加入2ml的培養(yǎng)基，反復吹打，倒置顯微鏡下觀察細胞 成單個，停止吹打，把2ml懸液吸到50ml的離心管中，1500rpm離心5分鐘，倒掉廢液，加入 4ml的培養(yǎng)基，溫和晃均勻，把每2ml的細胞懸液加到6孔板中的一個孔里，放入37°C CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，根據(jù)細胞情況進行消化傳代。9細胞轉(zhuǎn)染方法貼壁細胞轉(zhuǎn)染前一天，每孔細胞長到50 %的時候，細胞加2ml的無抗生素 DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞長到80% -90%，可以開始轉(zhuǎn)染。取20ng/ul的質(zhì)粒DNA 30ul加到在Opti-MEM 220ul無血清培養(yǎng)基，總體積 250ul，輕輕混合。放置5分鐘。用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293T細胞(1)取脂質(zhì)體200010ul，加到在Opti-MEM 240ul無血清培養(yǎng)基，總體積250ul，輕
輕混合。放置5分鐘。(2)把脂質(zhì)體混合液加到DNA混合液中，輕輕混合；放置20分鐘。(3)每20分鐘內(nèi)細胞換液，加入1. 5ml的無抗生素的培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血 清)，把脂質(zhì)體和DNA的混合液共500ul，逐滴加到6孔板中的一個孔里，依次類推。輕輕混 合，放入37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293T細胞36小時、42小時和 48小時觀察培養(yǎng)效果。10重組蛋白MyoDl在293T細胞中的表達和檢測在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后，在37°C C02培養(yǎng)箱中已培養(yǎng)48小時的細胞293T陽 性結(jié)果。結(jié)果表明，PLEGFP-N1空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率可達80%，目的基因PLEGFP-Nl-spMyoDl 克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率平均可達24%，最高達33 %。11利用本發(fā)明的載體建立轉(zhuǎn)pMyoDl基因鼠①病毒包裝取上述脂質(zhì)體2000和DNA的混合液，用PT67細胞替代293T細胞，脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染后4天開始收集上清液。②病毒上清液Iml (6孔板一個孔)加到胚胎干細胞的培養(yǎng)基中，42小時熒光顯微 鏡下觀察，確定熒光克隆。③熒光陽性克隆篩選進行G418篩選，保留目的基因的細胞克隆，收集病毒，進行 保種。④取受孕老鼠，經(jīng)麻醉后，利用手術(shù)法從受孕的老鼠體內(nèi)取囊胚，用自制持卵器在 體式顯微鏡下進行微注射，把注射成功的囊胚再移植到受體老鼠子宮。⑤受體老鼠妊娠、分娩、轉(zhuǎn)基因老鼠診斷、哺育。⑥轉(zhuǎn)基因仔鼠斷乳、飼養(yǎng)。⑦轉(zhuǎn)基因老鼠骨骼肌組織中目的基因(pMyoDl)的RT-PCR擴增檢測分別取30日 齡轉(zhuǎn)基因老鼠的骨骼肌、心臟、肝臟、肺臟、腸道、皮膚組織，參照步驟2. 1. 2提這6種組織的 總RNA，并進行目的基因的RT-PCR擴增檢測。本發(fā)明的使用方法是采用發(fā)明制備的綠色熒光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體是已經(jīng)過包被處理的，可直接用于轉(zhuǎn)染待轉(zhuǎn)的靶細胞或靶組織，在365nm波長紫外 光激發(fā)下，陽性標本為綠色熒光觀察及目的基因片段的PCR擴增方法檢測鑒定。測定結(jié)果判斷⑴在波長為365nm紫外光下，陽性可觀察到綠色熒光；(2)PCR擴增后可檢測到目的基因片段的條帶。本發(fā)明的有益效果是1根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的豬MyoDl基因mRNA序列，應用Primer Premier5. O, DNA Club和Oligo 6.0自行設計出引物。2在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1中，除其5、病毒LTR區(qū)具有一個控制在真核細胞 中抗性選擇的新霉素抗性標記基因(NecZ)表達的病毒啟動子外，含有一個調(diào)控綠色熒光蛋 白(EGFP)或其融合蛋白表達的人類細胞性肥大病毒啟動子(Pqw), —旦含有目的基因的逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1在動物早期胚胎中成功轉(zhuǎn)染，則含目的基因編碼的EGFP融合蛋 白可在該轉(zhuǎn)基因動物的所有組織或器官中表達，不能實現(xiàn)目的基因的特異性組織或器官表 達。然而，綠色熒光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl逆轉(zhuǎn)錄病毒載體克服了過去PLEGFP-N1的目的 基因無法特異性組織表達的局限性。3在改進后的綠色熒光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl載體中，又增加了一個調(diào)控綠色熒 光蛋白(EGFP)或其融合蛋白表達的骨骼肌組織特異性高效表達啟動子(SP)，從而實現(xiàn)了 對綠色熒光蛋白(EGFP)或其融合蛋白雙啟動子(Paw和SP啟動子)控制的骨骼肌組織特 異性表達目的。同過去的方法比較，不僅彌補了目的基因組織表達特異性的不足，而且提高 了在特異組織(骨骼肌)中的表達強度和敏感度，同時提高了對目的基因功能研究的針對 性和準確度。4對綠色熒光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl載體在特異組織(骨骼肌)中的表達進行檢 測，同改進前比較，不但不會影響對其直接熒光觀察和EGFP的PCR法檢測，而且可從被檢動 物的骨骼肌組織中進行PCR法檢測，具有雙重PCR法檢測快速、便捷，可靠性強的優(yōu)點。


圖1是pMyoDl基因PCR產(chǎn)物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，其中M :DNA marker ； 泳道1,2,3 =PMyoDl基因的擴增產(chǎn)物；圖2是構(gòu)建的載體示意圖；圖3是用XhoI、BamH I進行雙酶切鑒定結(jié)果；其中M =DNA marker ；泳道1 (空) 載體PLEGFP-N1酶切后的片段(另一條帶僅47bp，圖中觀察不到):2 :PLEGFP-Nl-spMyoDl 酶切后的載體和spMyoDl片段(已含有SP序列)圖4是目的基因的PCR擴增檢測結(jié)果，其中M :DNA marker ；泳道1，2 :PMyoDl基因 的擴增產(chǎn)物；圖5是目的基因的測序峰圖譜；圖6是37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時的293T細胞；圖7是在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時的細胞293T陽性結(jié)果；其中(a) 細胞293T轉(zhuǎn)染的陰性對照、(b)PLEGFP-Nl空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照、(c) PLEGFP-Nl-spMyoDl質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染陽性結(jié)果；圖8是被轉(zhuǎn)染293T細胞RNA提取結(jié)果。圖9是被檢細胞或組織中的目的基因的RT-PCR擴增檢測結(jié)果；其中M IOObp ladder ；泳道1-2 被轉(zhuǎn)染的293T細胞；3 骨骼肌，4 心臟，5 肝臟，6 肺臟，7 腸道，8 皮 膚組織；9 陰性對照，10 陽性對照(315bp)；
圖10是在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時的細胞C2C12細胞陽性結(jié)果 (PLEGFP-Nl-spMyoDl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽性結(jié)果)
具體實施例方式工藝條件一雙啟動子綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl高效真核表達載體的構(gòu) 建及其真核表達主要器材藥品與試劑DH5a感受態(tài)菌種，LB培養(yǎng)基固體和液體1000ml PH7. 0 ；蛋白胨 10. 0g，酵母抽提 5. 0g, NaCl 100g，瓊脂粉 15. 0g, Amp 抗性工作濃度為 100ng/ml，0. Imo 1/ L的CaC12溶液。酶及相關(guān)試劑PLEGFP-N1載體質(zhì)粒(Clontech公司)、核酸內(nèi)切酶Xhol、 BamHI,T4 連接酶(Fermentas 公司)、ExTaq 聚合酶、pMD18T_simple 載體(TaKaRa) ,2XTaq PIusDNA聚合酶(大連寶生物工程有限公)、血液基因組提取試劑盒(離心柱型)TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN公司)、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒(大連寶生 物工程有限公司)、反轉(zhuǎn)錄按RT reagents試劑盒(TAKARA公司)。實驗方法(一).基因組DNA和骨骼肌組織mRNA的制備豬的血樣和骨骼肌組織樣分別采自吉林省農(nóng)科院畜牧分院和長春博星食品有限 公司養(yǎng)豬場。1. 1豬基因組DNA的提取取新鮮豬血(加肝素鈉及10% SDS液)20ul，加緩沖液GA180ul，加入20ul蛋白 酶K溶液，搖勻。加入200ul緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin，溶液應變清涼，短 暫離心后去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加200ul無水乙醇，充分振蕩混勻15s。將所得溶液和絮 狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管 中。在吸附柱CB3中加入500ul緩沖液⑶，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放 入收集管中。向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附 柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉洗 液。將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫 放置數(shù)分鐘，以去除吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向 吸附膜的中間部位懸空滴加IOOul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min， 將溶液收集到離心管中。DNA產(chǎn)物應保存在-20°C，以防DNA降解。1. 2豬骨骼肌組織mRNA的提取迅速取豬腿部骨骼肌，液氮冷凍，使用TRIzol RNA提取試劑盒(Gibco公司)提 取總RNA，參照RNA試劑盒操作說明用Trizol法進行豬骨骼肌組織總RNA的提取，_80°C保存。1. 3RT-PCR 與 cDNA 的合成反轉(zhuǎn)錄按RT reagents試劑盒說明書進行。(二)·豬 MyoDl 基因(pMyoDl)的擴增2. 1引物設計
根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬MyoDl基因mRNA序列(Accession No. ΝΜ_001002824)，應用 Primer Premier5. O, DNA Club 和 Oligo 6. O 設計特異性引物 Pl 和P2，預期擴增長度為960bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。上游引物Pl:5 ‘ -ATGGAGCTGCTGTCGCCACCGCTC-3‘；下游引物P2:5' -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3'；2. 2PCR 擴增用引物Pl和P2從RT-PCR產(chǎn)物cDNA擴增長度為960bp (lbp 960bp)的編碼區(qū) 序列。擴增反應體系(25ul)見表1。反應程序95°C預變性5min，進入循環(huán)95 °C變性30s，58 °C退火40s，72 °C延伸2min，循環(huán)總數(shù)30circles ；最后延伸 72 0C 4min。表1豬MyoDl基因cDNA的PCR擴增體系
權(quán)利要求
一種高效雙啟動子PLEGFP N1 spMyoD1綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建，其特征是首先人工合成一骨骼肌特異啟動子SP序列、采用RT PCR方法從豬的骨骼肌組織中擴增MyoD1基因全長CDs序列；設計融合引物、利用重疊PCR擴增方法獲得啟動子SP和pMyoD1的融合基因序列，T/A克隆到pMD18 T載體中，雙酶切后將融合基因亞克隆入以真核表達綠色熒光蛋白為標記的逆轉(zhuǎn)錄病毒PLEGFP N1載體，構(gòu)建PLEGFP N1 spMyoD1雙啟動子高效表達載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定并測序；用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細胞系包裝、擴增，對病毒滴度和感染效率進行監(jiān)測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效雙啟動子PLEGFP-Nl-spMyoDl綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體構(gòu)建，其特征是a、引物設計根據(jù)豬 MyoDl 基因 mRNA 序列 Accession No. NM_001002824,應用 Primer Premier5. 0， DNAClub和Oligo 6. 0設計特異性引物PI和P2，擴增長度為960bp ；上游引物PI(5 ‘ -ATGGAGCTGCTGTCGCCACCGCTC-3‘；下游引物P2(5 ‘ -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3‘；b、PCR擴增的反應條件用引物P1和P2從RT-PCR產(chǎn)物cDNA擴增長度為lbp 960bp的編碼區(qū)序列；反應程 序是95°C預變性5min，進入循環(huán)95°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸2min，循環(huán)總數(shù) 30circles ；最后延伸 72°C 4min ；c、骨骼肌組織特異性高效表達啟動子SP的合成老鼠染色體1和2基因組的部分5、側(cè)翼調(diào)控區(qū)的保守序列Accession No. NT_039170、 NW_001030694、NW_001030671和雞骨骼肌組織a -actin基因的順式作用調(diào)控與轉(zhuǎn)錄控制 區(qū)核心序列Accession No. M13631，優(yōu)化并合成了骨骼肌組織特異性高效表達啟動子SP序 列，啟動子SP序列；在其3、末端人工接一長為24bp的寡聚核苷酸接頭；接頭序列 5' -TACCTCGACGACAGCGGTGGCGAG-3 ‘；d、SP與pMyoDl融合基因的重疊PCR擴增根據(jù)已合成的帶接頭的SP啟動子序列和擴增到的pMyoD 1基因cDNA序列，應用 PrimerPremier5. 0和Oligo 6. 0設計特異性融合引物P3和P4，擴增長度為1240bp ；在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看選擇的酶切位點，在所要進行PCR的基因序列 中是否存在；用Primer primer5把序列反向互補；在應用Oligo 6. 0引物設計時，上下游引 物全長輸入；上游引物位點的確定為5’端模板第一個堿基前面的所有堿基的負數(shù)值+1下 游引物位點的確定為，下游引物-酶切位點-保護性堿基=A，序列全長-A+1 =下游引物位 點；引物設計時候要考慮到序列的起始堿基和末尾堿基中是否包含起始密碼子ATG和終止 密碼子TAA，如果有，要考慮是否需要刪除或者保留；引物長度的選擇要考慮到CG比例，前 面適當加堿基調(diào)節(jié)GAC比例，5’端照抄；3’端反向互補；保護性堿基和酶切位點加在引物前 面；自身互補，二聚體兩個引物之間<6，負數(shù)值越大能量越大，退火溫度越高，錯配幾率越上游融合引物P3(5 ‘ -GACCTCGAGCACCATTCCTCACGACACCCA-3‘； 下游融合引物P4(5 ‘ -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3‘；為下一步克隆需要，分別在上、下游引物中引入Xho I和BamH I酶切位點； 重疊PCR擴增重疊PCR反應體系；反應程序95°C預變性3min，進入循環(huán)94°C變形30s， 53°C退火45s，72°C延伸3min，循環(huán)總數(shù)30circles ；最后延伸72°C 5min ；PCR反應產(chǎn)物在 瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，并照相記錄，最后切膠回收純化含有SP啟動子的融合MyoDl 基因cDNA ；e、spMyoDl融合基因的克隆spMyoDl基因連接到pMD18T-Simple載體。連接體系；連接條件16°C，5h，然后涂板、挑 克隆、培養(yǎng)加Amp ；將spMyoDl基因連接到pMD18T-Simple載體的菌種進行測序，菌種記作 pMD-spMyoDl ；f、逆轉(zhuǎn)錄病毒PLEGFP-Nl-spMyoDl表達載體構(gòu)建用BamH I禾P Xho I進行亞克隆，將spMyoDl基因從pMD-spMyoDl用Xhol、 BamH I酶切下來，亞克隆到同樣用這兩種內(nèi)切酶切酶過的PLEGFP-N1載體上，記作為 PLEGFP-Nl-spMyoDl, spMyoDl 與 PLEGFP-N1 片段載體連接；g、純質(zhì)粒的提取取lul質(zhì)粒加入到9ul的無菌水中，把10ul的混合液加到lOOul的DH5 a感受態(tài)中， DH5 a感受態(tài)從負80度冰箱取出，冰上溶解，加入后冰上放置30分鐘，42度水浴45秒后放 入冰上1分鐘，加入890ul的LB培養(yǎng)基，37度搖床200轉(zhuǎn)培養(yǎng)一個小時，取200ul培養(yǎng)菌涂 布到含抗生素的LB平板上，37度倒置培養(yǎng)16-18小時，挑取菌落到500ul含抗生素的培養(yǎng) 基中12小時以上培養(yǎng)，24小時后吸取培養(yǎng)液200ul到2ml的含抗生素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù) 12小時以上培養(yǎng)，吸取2ml培養(yǎng)菌，按照超純質(zhì)粒提取試劑盒中方法進行質(zhì)粒提??；h、細胞復蘇從液氮中取出一支凍存的293T細胞，快速的在37°C水浴鍋中溶解，把293T細胞吸到裝 有10ml的培養(yǎng)液的50ml的離心管中，1500rpm離心5分鐘，倒掉廢液，加入2ml的培養(yǎng)基， 溫和晃均勻，把2ml的細胞懸液加到6孔板中的一個孔里，放入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48小時，根據(jù)細胞情況進行消化傳代；細胞長滿90%時可以傳代，用37°C預熱的PBS洗兩遍，加入200ul的0. 25%的胰酶消 化，細胞變形后10秒加入2ml的培養(yǎng)基，反復吹打，倒置顯微鏡下觀察細胞成單個，停止吹 打，把2ml懸液吸到50ml的離心管中，1500rpm離心5分鐘，倒掉廢液，加入4ml的培養(yǎng)基， 溫和晃均勻，把每2ml的細胞懸液加到6孔板中的一個孔里，放入37°C C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 小時，根據(jù)細胞情況進行消化傳代； j、細胞轉(zhuǎn)染方法貼壁細胞，轉(zhuǎn)染前一天，每孔細胞長到50%的時候，細胞加2ml的無抗生素DMEM+10% 胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞長到80% -90%，可以開始轉(zhuǎn)染；取20ng/ul的質(zhì)粒DNA 30ul加到在0pti_MEM 220ul無血清培養(yǎng)基，總體積250ul，輕 輕混合。放置5分鐘；用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293T細胞(1)取脂質(zhì)體200010ul，加到在Opti-MEM240ul無血清培養(yǎng)基，總體積250ul，輕輕混 合。放置5分鐘；(2)把脂質(zhì)體混合液加到DNA混合液中，輕輕混合；放置20分鐘；(3)每20分鐘內(nèi)細胞換液，加入1.5ml的無抗生素的培養(yǎng)基DMEM+10%胎牛血清，把脂 質(zhì)體和DNA的混合液共500ul，逐滴加到6孔板中的一個孔里，依次類推。輕輕混合，放入 37°C C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293T細胞36小時、42小時和48小時觀 察培養(yǎng)效果；k、重組蛋白MyoDl在293T細胞中的表達和檢測在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后，在37°C C02培養(yǎng)箱中已培養(yǎng)48小時的細胞293T陽性結(jié) 果。結(jié)果表明，PLEGFP-N1空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率可達80%，目的基因PLEGFP-Nl-spMyoDl克隆 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率平均可達24%，最高達33% ；.1、利用本發(fā)明的載體建立轉(zhuǎn)pMyoDl基因鼠①病毒包裝取上述脂質(zhì)體2000和DNA的混合液，用PT67細胞替代293T細胞，脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染后4天開始收集上清液；②病毒上清液1ml加到胚胎干細胞的培養(yǎng)基中，42小時熒光顯微鏡下觀察，確定熒光 克??；③熒光陽性克隆篩選進行G418篩選，保留目的基因的細胞克隆，收集病毒，進行保種；④取受孕老鼠，經(jīng)麻醉后，利用手術(shù)法從受孕的老鼠體內(nèi)取囊胚，用自制持卵器在體式 顯微鏡下進行微注射，把注射成功的囊胚再移植到受體老鼠子宮；⑤受體老鼠妊娠、分娩、轉(zhuǎn)基因老鼠診斷、哺育；⑥轉(zhuǎn)基因仔鼠斷乳、飼養(yǎng)；⑦轉(zhuǎn)基因老鼠骨骼肌組織中目的基因PMyoDl的RT-PCR擴增檢測分別取30日齡轉(zhuǎn)基 因老鼠的骨骼肌、心臟、肝臟、肺臟、腸道、皮膚組織，并進行目的基因的RT-PCR擴增檢測。
3. 一種高效雙啟動子PLEGFP-Nl-spMyoDl綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的使用方法， 其使用方法是綠色熒光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是已經(jīng)過包被處理的，可 直接用于轉(zhuǎn)染待轉(zhuǎn)的靶細胞或靶組織，在365nm波長紫外光激發(fā)下，陽性標本為綠色熒光 觀察及目的基因片段的PCR擴增方法檢測鑒定。
全文摘要
一種高效雙啟動子PLEGFP-N1-spMyoD1綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建，屬于動物基因工程及動物分子育種工程技術(shù)領(lǐng)域，其特征是人工合成一骨骼肌特異啟動子序列、采用RT-PCR方法從豬的骨骼肌組織中擴增基因全長序列；設計融合引物、利用重疊PCR擴增方法獲得啟動子和融合基因序列，T/A克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建PLEGFP-N1-spMyoD1雙啟動子高效表達載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定并測序；用脂質(zhì)體法包裝、擴增，對病毒滴度和感染效率進行監(jiān)測。有益效果是1.應用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0自行設計出引物。2.克服了過去的目的基因無法特異性組織表達的局限性。3.同時提高了對目的基因功能研究的針對性和準確度。4.具有檢測快速、便捷，可靠性強的優(yōu)點。
文檔編號C12N15/66GK101993895SQ201010506230
公開日2011年3月30日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者包艷波, 徐日福, 王志賢, 秦寧 申請人:徐日福;秦寧;王志賢;包艷波