一種引物對(duì)及其用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種引物對(duì)及其用于檢測(cè) Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前全世界糖尿病患者的數(shù)量已達(dá)3. 66億，全球每7秒種就有一人死于糖尿病。 糖尿病是指以血糖增高為主要臨床表現(xiàn)的慢性代謝性疾病，主要分為1型糖尿病和2型糖 尿病，2型糖尿病占糖尿病患者90%以上。1型糖尿病是一種自體免疫疾病，是由于免疫系 統(tǒng)對(duì)分泌胰島素的胰腺0細(xì)胞作出攻擊導(dǎo)致胰腺不能分泌足夠的胰島素。而2型糖尿病 是由于各種致病因素導(dǎo)致組織器官產(chǎn)生胰島素抵抗，即胰島素相對(duì)缺乏，故通常臨床上用 胰島素釋放實(shí)驗(yàn)來區(qū)別糖尿病的類型?；颊咴囼?yàn)空腹及進(jìn)食75克葡萄糖后30分鐘、60分 鐘、120分鐘和180分鐘分別抽血測(cè)定胰島素及C肽水平。若空腹胰島素及C肽低于正常， 且進(jìn)食后不增高考慮為1型糖尿病；若空腹胰島素及C肽低于正常、增高或降低，且進(jìn)食后 增高，則考慮為2型糖尿病。
[0003] 2型糖尿病具體的致病原因仍然未知，現(xiàn)在的研宄發(fā)現(xiàn)其是由遺傳因素和環(huán)境因 素共同作用導(dǎo)致的，其中遺傳因素約占30%，環(huán)境因素約占70%。2型糖尿病的遺傳風(fēng)險(xiǎn) 是由多個(gè)基因共同決定的，目前為止，公認(rèn)的2型糖尿病易感基因已經(jīng)增至20個(gè)，同時(shí)還 發(fā)現(xiàn)了 13個(gè)影響空腹血糖的基因以及5個(gè)影響餐后血糖的基因。臨床常規(guī)檢查例如空腹 及餐后血糖、糖化血紅蛋白、C肽水平只能判斷2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展情況，但無法找到致 病根源，無法根據(jù)這些指標(biāo)做出及時(shí)的預(yù)防。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)在臨床常規(guī)檢查存在的問題與不足，本發(fā)明提供一種引物對(duì)及其用于檢測(cè) Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法，克服了無法根據(jù)臨床常規(guī)指標(biāo)做出及時(shí)預(yù)防的難題。 本發(fā)明根據(jù)檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的具體狀況作為2型糖尿病健康管理的主 線，監(jiān)控疾病的發(fā)生發(fā)展，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，進(jìn)而做到及早預(yù)防，早 發(fā)現(xiàn)，早治療甚至避免疾病的發(fā)生。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種引物對(duì)，所述引物對(duì)是根據(jù)一個(gè)2型糖尿病 相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)的，所述的2型糖尿病相關(guān)基因?yàn)锳poM基因，所述的引物對(duì)用于檢測(cè) ApoM基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)。
[0006] 較佳的，所述引物對(duì)是SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。
[0007] 所述引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法包括如下步驟：
[0008]a.提取樣品的全基因組DNA;
[0009]b.根據(jù)所述引物對(duì)對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳，以2000bpmark為標(biāo)尺，根據(jù)擴(kuò)增片段大小，確定檢測(cè)目的片段并回收純 化；
[0010] C.對(duì)純化后的檢測(cè)目的片段進(jìn)行測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果檢測(cè)ApoM基因啟動(dòng)子 區(qū)-724位點(diǎn)的狀況，判斷所述ApoM基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)正常與否。
[0011] 其中步驟b中回收純化包括制膠、上樣、電泳、割膠、溶膠、柱平衡、轉(zhuǎn)移、漂洗、洗 脫回收、濃度與純度檢驗(yàn)的步驟。
[0012] 較佳的，所述柱平衡的步驟之前有一個(gè)柱預(yù)處理的步驟。
[0013] 較佳的，所述洗脫回收的步驟中洗脫體積不小于30y1，這樣做對(duì)回收效率有較 好的影響。
[0014] 所述洗脫回收的步驟中洗脫液為ddH20,為了得到較好的洗脫效率，PH值控制在 7. 0-8. 5 之間。
[0015] 所述洗脫回收的步驟得到的產(chǎn)物保存在-20°C，以防止其分解。
[0016] 有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了ApoM基因的啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)是2型糖尿病易感 位點(diǎn)，并根據(jù)ApoM基因設(shè)計(jì)特異性的引物，以來自人的組織、全血樣本提取全基因組DNA模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，設(shè)計(jì)巧妙、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，根據(jù)該 易感位點(diǎn)的具體狀況作為2型糖尿病健康管理的主線，監(jiān)控疾病的發(fā)生發(fā)展。如果是2型 糖尿病遺傳傾向較高的人群，及時(shí)預(yù)防2型糖尿病的外在致病因素，并按時(shí)完善預(yù)防性的 相關(guān)的檢查，例如空腹、餐后血糖，做到及早預(yù)防，早發(fā)現(xiàn)，早治療甚至避免疾病的發(fā)生。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
[0018] 1.基因組DNA提取：
[0019] 1. 1試劑和儀器：
[0020] 1. 1. 1 試劑和耗材：基因組DNA抽提試劑盒（TIANampBLOODDNAkit，DP318-03 ; TIANamp口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，DP322-03)含：細(xì)胞裂解液CL;緩沖液GA;緩沖 液GS;緩沖液GB;緩沖液⑶；漂洗液PW;洗脫緩沖液TB;CarrierRNA;RNase-freeddH20 ; 蛋白酶K(20mg/ml);吸附柱；收集管（2ML) ;1.5ML無菌收集管；無水乙醇。
[0021] 1. 1. 2 儀器：BECKMANCOULTERMTCR(M;(;E?20R離心機(jī)；QilinbeierV0RTEX-5 旋渦混合器；HH-W600電熱恒溫水浴鍋。
[0022] 1. 2提取步驟
[0023] 從全血中提取基因組DNA
[0024] 1. 2. 1取200y1的抗凝全血至1. 5ml的Eppendorf管中，如果樣本的量少于 200y1，則加入緩沖液GS補(bǔ)充至200y1。如果樣本量多于200y1，需要用細(xì)胞裂解液CL 處理，具體步驟如下：在樣品中加入1-2. 5倍體積的細(xì)胞裂解液CL,顛倒混勾，lOOOOrpm離 心1分鐘，吸取上清，留下細(xì)胞核沉淀（如果裂解不徹底，可重復(fù)以上步驟一次），向離心收 集到的細(xì)胞核沉淀中加200y1緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。
[0025] 1. 2. 2加入20y1的蛋白酶K溶液，混勾，再加入200y1的緩沖液GB，立刻充分顛 倒混勻。56°C水浴樣本10分鐘，水浴過程中請(qǐng)每隔3分鐘上下輕柔顛倒混勻樣本，溶液應(yīng) 變清亮。（如溶液未徹底變清亮，可延長(zhǎng)裂解時(shí)間至溶液變清亮為止）。
[0026] 1. 2. 3加入200y1無水乙醇，充分顛倒混勻，這時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
[0027] 1. 2. 4將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(?13, 400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
[0028] 1.2. 5向吸附柱中加入500yl緩沖液⑶（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙 醇），12000rpm(?13, 400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
[0029]1. 2. 6向吸附柱中加入700y1漂洗液PW使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇）， 12, OOOrpm(?13, 400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
[0030] 1. 2. 7向吸附柱中加入500y1漂洗液PW，12,OOOrpm(?13, 400Xg)離心30秒， 倒掉收集管中的廢液。
[0031] 1. 2. 8將吸附柱放回收集管中，12,OOOrpm(?13, 400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。 吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0032] 1.2.9將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加 50-200y1洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5分鐘，12,OOOrpm(?13, 400Xg)離心2分鐘，將溶 液收集到離心管中。
[0033] 注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50yl，體積過小影響回收效率。為增加基因 組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,OOOrpm? 13, 400Xg)離心2分鐘。洗脫液的pH對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證 其pH值在7. 0-8. 5范圍內(nèi)（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7. 0會(huì)降低 洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20°C，以防DNA降解。
[0034] 2.基因目的片段擴(kuò)增：
[0035] 1. 1試劑和儀器：
[0036] 2. 1. 1 試劑和耗材：PCR反應(yīng)試劑盒（TIANampTaqPCRMastermix(KT201); TIANampMarkerI(MD101)〇
[0037] 2. 1. 2 儀器：AppliedBiosystems2720ThermalcyclerPCR儀；天能 Tanon- 4100凝膠成像系統(tǒng)。
[0038] 2. 2進(jìn)行PCR反應(yīng)，詳見下表：
[0039]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種引物對(duì)，所述引物對(duì)是根據(jù)一個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)的，其特征 在于；所述的2型糖尿病相關(guān)基因?yàn)锳poM基因，所述的引物對(duì)用于檢測(cè)ApoM基因啟動(dòng)子 區(qū)-724位點(diǎn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于；所述引物對(duì)是SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述一種引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn) 的方法，其特征在于，包括如下步驟： a. 提取樣品的全基因組DNA; b. 根據(jù)所述引物對(duì)對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，W 2000bp mark為標(biāo)尺，根據(jù)擴(kuò)增片段大小，確定檢測(cè)目的片段并回收純化； C.對(duì)純化后的檢測(cè)目的片段進(jìn)行測(cè)序。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法，其特征 在于；所述步驟b中回收純化包括制膠、上樣、電泳、割膠、溶膠、柱平衡、轉(zhuǎn)移、漂洗、洗脫回 收、濃度與純度檢驗(yàn)的步驟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法，其特征 在于；所述柱平衡的步驟之前有一個(gè)柱預(yù)處理的步驟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法，其特征 在于；所述洗脫回收的步驟中洗脫體積不小于30 y 1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法，其特征 在于；所述洗脫回收的步驟中洗脫液為(1化0,抑值控制在7. 0-8. 5之間。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法，其特征 在于；所述洗脫回收的步驟得到的產(chǎn)物保存在-20°C。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種引物對(duì)及其用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法，所述引物對(duì)是根據(jù)一個(gè)2型糖尿病ApoM基因的序列設(shè)計(jì)的，所述引物對(duì)用于檢測(cè)Apom基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)的方法包括如下步驟：提取樣品的全基因組DNA；根據(jù)所述引物對(duì)對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行確定檢測(cè)目的片段并回收純化；對(duì)純化后的檢測(cè)目的片段進(jìn)行測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果來判斷所述的ApoM基因啟動(dòng)子區(qū)-724位點(diǎn)是否發(fā)生突變。本發(fā)明為后續(xù)的檢測(cè)手段以及進(jìn)一步采取有針對(duì)性的健康管理、疾病預(yù)防提供參考依據(jù)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104531888
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510023321
【發(fā)明人】章堯, 張普宏, 高家林, 孟宇, 王李卓, 呂俊
【申請(qǐng)人】皖南醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月16日