一種d1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻鑒定領(lǐng)域，具體而言，涉及一種D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交 組合的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 70年代我國應(yīng)用三系法培育雜交水稻獲得成功，并在生產(chǎn)上大面積推廣種植，實(shí) 現(xiàn)了我國水稻單產(chǎn)的第二次飛躍。1976-2005年，我國雜交水稻累計(jì)種植面積52. 5億畝，增 收稻谷約6. 5億噸，因此雜交水稻的發(fā)展是提高糧食產(chǎn)量、解決糧食安全問題的重要途徑 (袁隆平，2008)。三系雜交水稻利用的基礎(chǔ)是細(xì)胞質(zhì)雄性不育，自從野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育 系被發(fā)現(xiàn)與大面積推廣應(yīng)用以來，上世紀(jì)70年代到80年代中期，育種家培育出多達(dá)60多 種細(xì)胞質(zhì)源來源于野敗型、云南滇型OianI和Dianll)、紅蓮型、岡型、K型和馬協(xié)型等，盡 管細(xì)胞質(zhì)源和敗育特點(diǎn)有較大差異，可分為孢子體不育和配子體不育兩種類型（朱英國， 2000)。其中，云南滇型、包臺(tái)型和紅蓮型為配子體不育系，野敗型、D型、K型和岡型等為孢 子體敗育類型，大部分的配子體敗育恢保關(guān)系一致，而大部分孢子體敗育類型的恢保關(guān)系 一致，配子體敗育和孢子體敗育類型的恢保關(guān)系相反。
[0003] 在配子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中，已經(jīng)克隆驗(yàn)證了包臺(tái)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因 〇"79和紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因(^紐79，兩個(gè)不育基因?yàn)榈任蛔儺悾?7%的序列同 源性（Wangetal.2006;Pengetal.2010)，滇型不育系也鑒定到orf79等位變異基因。對(duì) 于孢子體型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，羅蕩平等用全線粒體基因組表達(dá)分析的方法鑒定出野敗型 不育基因WA352,該基因由3個(gè)線粒體基因組片段和一個(gè)來源不明片段組成，其他孢子體細(xì) 胞質(zhì)不育類型，如印水型、矮敗型、岡型、爪哇型、馬協(xié)型、K型均含有不育基因WA352(Luoet al. 2013) 〇
[0004]目前，國際公認(rèn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型主要為野敗、紅蓮、包臺(tái)三種類型，其中前面 兩種不育細(xì)胞質(zhì)都來源于普通野生稻。20世紀(jì)70年代，國內(nèi)外育種家還利用普通野生稻為 細(xì)胞質(zhì)供體培育了其他13種細(xì)胞質(zhì)類型，如崖城野生稻細(xì)胞質(zhì)、田東野生稻細(xì)胞質(zhì)等（朱 英國，2000)，因此，從野生稻中挖掘細(xì)胞質(zhì)是培育新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的一個(gè)重要途徑。 東鄉(xiāng)野生稻為多年生野生稻，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的世界上分布最北的野生稻，被國內(nèi)外譽(yù)為 "野生植物大熊貓"（黃依南等，2012)。
[0005] 上世紀(jì)80年代，江西省農(nóng)科院水稻所利用東鄉(xiāng)野生稻作為細(xì)胞質(zhì)供體培育出雄 性不育系國際油粘A，但一直沒有找到對(duì)該新型不育系育性恢復(fù)良好的恢復(fù)源，因此，沒有 得到推廣和利用。近年來，江西省超級(jí)水稻研宄發(fā)展中心與宜春農(nóng)科所合作，以東鄉(xiāng)野生稻 為細(xì)胞質(zhì)供體培育了新型東野不育系D1A，新型東野不育系D1A的具體培育方法見申請(qǐng)?zhí)?為201410190251. 0所述；新型東野不育系D1A分別與培矮64和天豐B雜交得到新型東野 不育系DPA和DTA。D1A、DPA和DTA均為孢子體不育系，分子標(biāo)記鑒定該類型不育系不含有 已克隆的孢子體不育基因WA352。無花粉敗育，敗育徹底，育性極易穩(wěn)定，且保持譜廣，絕大 多數(shù)栽培品種可為其保持系，只在同質(zhì)野生稻中找到恢復(fù)系，并實(shí)現(xiàn)同質(zhì)野生稻恢復(fù)系恢 復(fù)基因的栽培稻轉(zhuǎn)育，最高恢復(fù)率達(dá)到85. 1%。因此，它的敗育特點(diǎn)、分子機(jī)理和恢保關(guān)系 與目前推廣的其他不育系完全不同，為一種新型孢子體不育類型，暫命名為D1型水稻細(xì)胞 質(zhì)不育系。該不育系的研宄及應(yīng)用推廣對(duì)于豐富雜交水稻類型，促進(jìn)雜交水稻的可持續(xù)發(fā) 展具有重要價(jià)值。
[0006] 植物線粒體基因組由于線粒體基因組高頻率的基因重組導(dǎo)致植物線粒體基因組 序列差異很大，存在各自特異的序列，比較分析任何兩個(gè)物種的線粒體基因組的基因間區(qū)， 發(fā)現(xiàn)大部分基因間區(qū)都不是保守的，甚至是同源物種的比較（KuboandMikami, 2007)。 如，將小麥Ks3和Km3的線粒體基因組進(jìn)行比較，只有85. 2 %的序列為保守序列，與 NCBI數(shù)據(jù)庫比較，7. 3 %Ks3序列為新序列，且大部分特異序列位于進(jìn)化速率快的基因間 區(qū)（Liuetal.，2011);目前，水稻已完成了 7個(gè)線粒體基因組的測(cè)序，分別是水稻品種 Nipponbare、N、9311、CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、RT98C。其中，Nipponbare是一個(gè)典型的粳 稻品種，9311為典型的秈稻品種，WA-CMS和CW-CMS細(xì)胞質(zhì)來源于中國普通野生稻（Oryza rufipogon)，LD-CMS細(xì)胞質(zhì)來源于秈稻品種緬甸的Lead水稻。水稻線粒體基因組最大 的為CW(559, 045bp)，而LD只有 434, 745bp，通過比較水稻CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、N和 Nipponbare線粒體基因組獲得57個(gè)大小在102-5745bp的線粒體基因組特異序列，這些特 異序列占到水稻線粒體基因組14. 5%，通過比較分析獲得了 3個(gè)在所分析的14個(gè)不育系中 均能擴(kuò)出條帶的分子標(biāo)記，3個(gè)在所分析的7個(gè)配子體不育系均能擴(kuò)出條帶的分子標(biāo)記，9 個(gè)在所分析的7個(gè)孢子體不育系均能擴(kuò)出條帶的分子標(biāo)記，沒有鑒定到單個(gè)不育系所特異 的分子標(biāo)記（xieetal.，2014)。
[0007] D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系為一種以東鄉(xiāng)野生稻為細(xì)胞質(zhì)來源的孢子體不育系，與推 廣應(yīng)用的其他孢子體不育系類型完全不一樣，目前，還沒有開發(fā)出相應(yīng)的特異分子標(biāo)記能 夠快速鑒定該不育類型。
[0008] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合的鑒定方 法，能快速、準(zhǔn)確、高效、靈敏地檢測(cè)出D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合；并且該鑒定 方法操作簡便、穩(wěn)定可靠。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0011] 一種D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合的鑒定方法，以堿基序列SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示中的任一種或多種設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因擴(kuò)增鑒定。
[0012] 本發(fā)明提供的D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合的鑒定方法，是以水稻線粒 體基因組遺傳變異為基礎(chǔ)，先將D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系的線粒體提取并測(cè)序，然后與其他 水稻品種進(jìn)行基因組學(xué)分析，篩選出3個(gè)特異性強(qiáng)的東野型不育系D1A線粒體特異序列，即 為序列表中的SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示的序列；以該序列設(shè)計(jì)引物， 然后通過分子檢測(cè)手段，來鑒定是否為D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合特異的標(biāo)記。 該鑒定方法能快速、準(zhǔn)確、高效、靈敏地檢測(cè)出D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合；并且 該鑒定方法操作簡便、穩(wěn)定可靠。
[0013] 進(jìn)一步地，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一種或多種；
[0014] 其中，所述引物DM-1為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合的鑒定方法，其特征在于，W堿基序列 SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3所示中的任一種或多種設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因擴(kuò)增 鑒定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任一種或多種； 其中，所述引物DM-1為： F ;5' -GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3' R;5' -CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3'; 所述引物DM-2為： F ;5' -CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3' R;5' -CTTCGCTAGTGTAGGTGC-3'; 所述引物DM-3為： F ;5' -ACTTCTACGGCCTTACGA-3' R ;5' -GTGGACCTGGGATGACTA-3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任兩種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2和 引物DM-3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的鑒定方法，其特征在于，所述基因擴(kuò)增的模板為所 述D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合的總基因組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的鑒定方法，其特征在于，所述總基因組采用CTAB法提取。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的鑒定方法，其特征在于，所述總基因組的提取材料為D1型水 稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合生長至兩葉一屯、的幼苗。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒定方法，其特征在于，基因擴(kuò)增時(shí)所用的體系中，所述總基 因組的終濃度為8-15ng/ y 1。
10. 權(quán)利要求2所述的引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一種或多種在D1型水稻 細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合種子純度鑒定的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合的鑒定方法，以堿基序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示中的任一種或多種設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因擴(kuò)增鑒定。該鑒定方法是以水稻線粒體基因組遺傳變異為基礎(chǔ)，先將D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系的線粒體提取并測(cè)序，然后與其他水稻品種進(jìn)行基因組學(xué)分析，篩選出3個(gè)特異性強(qiáng)的東野型不育系D1A線粒體特異序列；以該序列設(shè)計(jì)引物，然后通過分子檢測(cè)手段，來鑒定是否為D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合特異的標(biāo)記。該鑒定方法能快速、準(zhǔn)確、高效、靈敏地檢測(cè)出D1型水稻細(xì)胞質(zhì)不育系及其雜交組合；并且該鑒定方法操作簡便、穩(wěn)定可靠。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104531886
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510018679
【發(fā)明人】謝紅衛(wèi), 蔡耀輝, 蔡怡聰, 李永輝, 錢明娟, 毛凌華, 顏龍安
【申請(qǐng)人】江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月14日