本發(fā)明屬于農業(yè)生物技術領域，具體涉及一種能夠抑制細胞色素P450基因表達的RNAi植物表達載體和其構建方法和應用。

背景技術：
農作物雜種優(yōu)勢利用是農業(yè)增產重要手段之一。水稻是全世界最重要的糧食作物之一，具有明顯的雜種優(yōu)勢。中國是世界上首個成功實現雜交水稻商品化生產的國家，雜交水稻使我國水稻產量提高了20％，全國雜交水稻常年種植面積已超過水稻年播種面積的50％。“三系法”和“兩系法”是目前雜交水稻制種的主要方法，但由于三系核質互作的基因型限制及兩系的光溫敏在特殊條件下的不穩(wěn)定，雜交水稻產業(yè)的發(fā)展已受到制約。美國先鋒公司的SPT技術利用轉基因技術成功解決了雜交制種中的一系列問題，并于2012年在玉米中實現商業(yè)化應用，水稻雜交制種也極有可能利用類似SPT技術實現更新換代。同時，轉基因技術在各種農作物領域的應用越來越廣泛。然而轉基因產品自誕生之日起產生的爭議，至今仍甚囂塵上。因此，轉基因產品需要加以嚴格的控制和監(jiān)管，防止轉基因漂移污染其他品種甚至其他物種就顯得尤為重要。因此，需要建立一種能夠定向清除雜交種子或轉基因植株的機制。培育獲得除草劑敏感的不育系是解決問題的有效手段之一。苯達松(bentazon)是一種苯并噻二唑類除草劑，屬雜環(huán)類選擇性化學除草劑，多數闊葉類雜草和莎草科雜草對苯達松敏感，而包括水稻在內的禾本科和豆科植物則對其有較強的耐藥性，苯達松具有廣譜，高效，低毒的特性。因此，苯達松用于清除稻田的闊葉類雜草和莎草科雜草十分有效，而對水稻又十分安全(張集文(2010)水稻苯達松敏感突變研究進展.中國水稻科學24:551-558)。水稻對苯達松抗性由一個單隱性基因細胞色素P450(CYP81A6)控制，該基因位于水稻第3號染色體上，參與苯達松在植物體內的羥基化脫毒過程。苯達松敏感型突變體“Norin8m”、“M8077S”、“嘉浙mB”、“GZmlS”和“GZm2S”等都是由于CYP81A6基因突變造成的。CYP81A6基因的突變，導致上述突變體無法在體內降解苯達松，從而導致噴施苯達松除草劑時，植物死亡。同時，該細胞色素P450也是磺酰脲類除草劑的作用靶標，包含CYP81A6突變基因或苯達松敏感的植物，在噴施磺酰脲類除草劑時，也會導致死亡。因此，有必要開發(fā)出一種能夠有效的影響水稻細胞色素P450(CYP81A6)表達的技術手段，從而為雜交水稻制種、培育轉基因新品種、防止轉基因逃逸等方面提供有效管控方案。

技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效的影響水稻細胞色素P450(CYP81A6)表達的植物表達載體及其構建方法：為達到以上目的，本發(fā)明提供了一種能夠抑制細胞色素P450基因表達的RNAi植物表達載體，含有發(fā)卡結構表達盒，其中所述發(fā)卡結構表達盒含有由SEQIDNo.1-3所示的DNA片段所形成的發(fā)卡結構。其中，SEQIDNo.1所示的DNA片段為基于CYP81A6的長度為494bp的正向DNA片段，SEQIDNo.3所示的DNA片段為基于CYP81A6的長度為494bp的與SEQIDNo.1所示的DNA片段反向互補的DNA片段。SEQIDNo.2為來自水稻Zincfinger基因的內含子序列(Riceintron)。SEQIDNo.1至3所示的DNA片段按照從上游到下游的方向依次排列。該發(fā)夾表達盒可在轉化的植物細胞中轉錄形成發(fā)卡式的二級結構，SEQIDNo.2所示的DNA片段形成發(fā)卡的“環(huán)”，SEQIDNo.1和3所示的DNA片段互補形成發(fā)卡的“莖”。其中，所述發(fā)卡結構表達盒還包括位于發(fā)卡結構上游的植物組成型啟動子或植物組織特異性啟動子，以及，位于發(fā)卡結構下游的終止子。其中所述植物組成型啟動子為水稻或玉米的Ubi啟動子、CAMV35S啟動子或Actin啟動子；所述植物組織特異性啟動子為Rubisco小亞基啟動子或Cab啟動子。優(yōu)選的，當啟動子為水稻或玉米的Ubi啟動子時，能夠取得非常強的干擾CYP81A6基因表達的效果。所述終止子包括：NOS終止子，Ubi終止子等在植物中可以終止基因轉錄的DNA序列。優(yōu)選的，所述終止子為NOS終止子。所述RNAi植物表達載體還包括選擇標記表達盒，所述選擇標記表達盒含有啟動子、標記基因和終止子，其中所述啟動子為水稻或玉米的Ubi啟動子，CAMV35S啟動子或Actin啟動子，優(yōu)選的，當啟動子為CAMV35S啟動子時，能夠取得良好的驅動選擇標記基因在植物中超量表達的效果。所述終止子為NOS終止子或Ubi終止子，優(yōu)選為NOS終止子。所述標記基因為可產生顏色變化的酶的基因(如GUS基因、熒光素酶基因等)、熒光標記基因(如熒光蛋白基因)、抗生素標記基因(可供篩選的抗生素標記如潮霉素、慶大霉素、卡那霉素基因)、除草劑篩選標記基因(如抗草甘膦基因、抗雙草醚基因等)或抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因等)。特別優(yōu)選的，所述標記基因為潮霉素基因。所得到的RNAi植物表達載體pTCK303-P450i-2。特別優(yōu)選的，所述的RNAi植物表達載體，具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。其中，所述植物為水稻，優(yōu)選的，所述植物為轉基因水稻株系。值得注意的是，用于RNAi植物表達載體構建的中間載體和具有選擇標記基因的RNAi表達載體，工程菌及包含P450i-2莖環(huán)結構的細胞、愈傷組織、轉基因苗、種子等均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述的RNAi植物表達載體在干擾植物細胞色素P450基因CYP81A6表達制備除草劑顯性敏感植物中的應用。本發(fā)明的RNA...