專利名稱：蛋白質(zhì)活性多肽及其編碼基因、表達載體、表達菌及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護 多肽及其編碼基因、重組表達載體、表達菌以及該蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物 活性保護多肽的應用。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代生物科學、化學和醫(yī)學領域中，廣泛使用具有生物活性的 各種蛋白質(zhì)制劑。蛋白質(zhì)制劑的存貯方式一般有液體和固體(干粉) 兩種形式。第一種方式的蛋白質(zhì)溶液由于在常溫下容易變性，降低或 喪失生物活性，因此需要存放在低溫環(huán)境中，但在存貯和運輸過程中， 可能由于各種原因?qū)е缕涿撾x低溫環(huán)境，造成蛋白質(zhì)變性沉淀和生物 活性降低。第二種方式是將蛋白質(zhì)制劑成干粉，存放常溫下，但冷凍 干燥過程中的冷凍和干燥所導致的脫水過程可對蛋白質(zhì)造成損傷變 性，導致生物活性降低。此外，在蛋白質(zhì)溶液制劑的使用過程中，反 復凍融會顯著降低蛋白質(zhì)的生物活性。為了保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和保 護蛋白質(zhì)的生物活性，蛋白質(zhì)制劑中往往加入了各種保護劑，例如-在蛋白酶溶液中加入血清蛋白和甘油等保護劑，血清蛋白可以防止蛋 白酶發(fā)生由疏水相互作用引起的聚集和沉淀，甘油可以避免疏水作用 引起的蛋白酶聚集，保護蛋白酶的生物活性。在蛋白質(zhì)凍干制劑中加 入了糖、多羥基化合物、血清蛋白、表面活性劑和氨基酸等各種保護劑，可與蛋白質(zhì)表面的極性基團形成氨鍵，防止蛋白質(zhì)在冷凍干燥過 程中失水后氫鍵直接暴露于周圍環(huán)境中，減少蛋白質(zhì)的損傷、變性和 聚集。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的在于提供一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護 多肽。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物 活性保護多肽的編碼基因。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物 活性保護多肽的重組表達載體。本發(fā)明的第四個目的在于提供一種表達本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與 生物活性保護多肽的表達菌。本發(fā)明的第五個目的在于提供本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性 保護多肽的應用。本發(fā)明人注意到一段高度保守的22氨基酸序列和其同源序列 (一般具有1-9個氨基酸取代的同源序列)，多分布在植物胚蛋白中。 該22氨基酸序列和其同源序列主要由親水性氨基酸組成。本發(fā)明人 推測該22氨基酸序列可防止高溫、干燥或冰凍引起的脫水及反復凍 融對蛋白質(zhì)的損傷和變性，保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和保護蛋白質(zhì)的生物 活性。本發(fā)明人將此22氨基酸序列命名為"多肽ZYZ22"，并通過基 因工程方法表達和獲得了含有2-12個多肽ZYZ22或其同源序列的多 肽，加入到蛋白質(zhì)液體制劑和蛋白質(zhì)固體制劑中，可有效提高蛋白質(zhì) 在常溫條件下的穩(wěn)定性，防止蛋白質(zhì)在冷凍干燥過程的變性和失活， 防止蛋白質(zhì)在反復凍融過程中的失活，保護蛋白質(zhì)的生物活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽，為如下(a)或(b) 或(C)所述的多肽(a) 由2-12個多肽ZYZ22或其同源序列首尾串聯(lián)而成的多肽， 多肽ZYZ22之間由0-5個氨基酸連接起來；所述多肽ZYZ22為序列表 中SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列，其同源序列為具有卜9個氨基酸 取代的序列；(b) (a)所述的多肽經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加而成的具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護功能的由(a)衍 生的多肽；(c) 含(a)或(b)所述多肽且具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護功 能的多肽。所述多肽ZYZ22的氨基酸序列如下VNKMGEYKDYAAEKAKEGKDAT。 所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護具體為可防止高溫、干燥、冷凍和反復凍融對蛋白質(zhì)損傷、變性和生物活性喪失。為了使發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽便于純化，本發(fā)明可在(a)或(b)或(c)所述多肽的氨基末端或羧基末端連接有Poly-His標簽或GST標簽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽，較好的為序列表中 SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列，它是由2個多肽ZYZ22的同源序列 首尾串聯(lián)組成的多肽，申請人將其命名為ZYZ22-2多肽；較好的還有 序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列，它是由6個多肽ZYZ22的 同源序列首尾串聯(lián)組成的多肽，申請人將其命名為ZYZ22-6多肽；更 好的為序列表中SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列，它是由12個多肽 ZYZ22的同源序列首尾串聯(lián)而成的多肽，申請人將其命名為ZYZ22-12本發(fā)明中的(c)所述多肽，較好的為序列表中SEQ ID N0.5所 述的ZYZ-L3多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽可人工合成，也可先合 成其編碼基因，再進行生物表達得到。其中(b)所述多肽的編碼基 因可通過將(a)所述多肽的編碼基因中缺失一個或幾個氨基酸殘基 的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端連上Poly-His標簽或GST標簽的編碼序列得到。本發(fā)明的DNA序列，為如下(a)或(b)所述的DNA序列(a) 編碼上述本發(fā)明的任一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽 的DNA序列；(b) 在嚴格條件下可與(a)所述DNA序列雜交的DNA序列；所 述嚴格條件為在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后 用2XSSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。序列表中SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列，是編碼ZYZ22-2多 肽的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO. 7所述的核苷酸序列，是編碼 序列表中SEQ ID NO. 3所述ZYZ22-6多肽的核苷酸序列。序列表中 SEQ ID N0.8所述的核苷酸序列，是編碼序列表中SEQ ID NO. 4所述 ZYZ22-12多肽的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO. 9所述的核苷酸 序列，是編碼序列表中SEQ ID NO. 5所述ZYZ-L3多肽的核苷酸序列。本發(fā)明的重組表達載體，包含有上述本發(fā)明的任何一種DNA序 列?？捎矛F(xiàn)有的原核表達載體構(gòu)建重組表達載體。本發(fā)明的表達菌，包含有本發(fā)明的任何一種重組表達載體或本 發(fā)明的任何一種DNA序列。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽的表達純化方法，是 將重組表達載體轉(zhuǎn)化表達菌例如大腸桿菌后，誘導表達，收集菌體， 細胞破碎，離心，親和層析純化，凝膠過濾。最終獲得蛋白質(zhì)穩(wěn)定與 生物活性保護多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽可應用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定 與蛋白質(zhì)活性保護劑。實驗證明，本發(fā)明蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽作為蛋白質(zhì)穩(wěn) 定與蛋白質(zhì)活性保護劑，加入蛋白質(zhì)溶液后，可以防止或降低因高溫、 冷凍、干燥或反復凍融所引起的蛋白質(zhì)變性、聚集和沉淀，可以防止 或降低因高溫、冷凍、干燥或反復凍融所引起的蛋白質(zhì)生物活性喪失。例如序列表中SEQ ID NO. 2所述ZYZ22-2多肽加入乳酸脫氫酶溶液后，用液氮冷凍，再在25'C融化，反復多次，可防止乳酸脫氨酶因反復凍融過程引起的酶活性下降，對反復凍融過程中的蛋白質(zhì)生物 活性具有明顯的保護作用。序列表中SEQ ID NO. 2所述ZYZ22-2多肽與海藻糖加入乳酸脫氫酶溶液中，在高溫(如63°C)條件下，可與 海藻糖發(fā)生協(xié)同作用，保護乳酸脫氫酶活性的作用效果高于單獨的 ZYZ22-2多肽或海藻糖。本發(fā)明蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性 保護劑，可保持以液體形式存在的蛋白質(zhì)在高溫處理或反復凍融處理 下的穩(wěn)定性，保護蛋白質(zhì)的生物活性，對蛋白質(zhì)制劑的應用具有重要


圖1是原核表達載體pET-ZYZ22-2的物理圖譜。 圖2是純化的ZYZ22-2多肽電泳圖。圖3是ZYZ22-2多肽對反復凍融條件下乳酸脫氫酶(LDH)活性 的保護作用結(jié)果圖。圖4是ZYZ22-2多肽與海藻糖對高溫條件下乳酸脫氫酶(LDH) 活性的協(xié)同保護作用結(jié)果圖。圖5是ZYZ-22-6、 ZYZ-22-12、 ZYZ-L3多肽對反復凍融條件下 乳酸脫氫酶(LDH)活性的保護作用結(jié)果圖。
具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實施例一:多肽ZYZ22-2的原核表達載體和重組菌株的構(gòu)建提取大豆白農(nóng)6號(吉林省白城農(nóng)業(yè)科學研究所提供)未成熟種 子的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中 檢索到的大豆胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白3組蛋白(LEA3)序列(Genebank 的序列號為M80664)設計引物如下5， _ ATGGCGTCCAAGAMCMGA _3，5' - TGCGTCTATATATACTMTA -3，。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1400bp的條帶，與預期 結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)回收該片段。將該回 收片段與pGEM-T Easy (購自Promega公司)連接，參照Cohen等的 方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ToplO感受態(tài)細胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標記 篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上 的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結(jié)果 表明擴增到的大豆胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白3組蛋白(LEA3)基因由200910190296.7 的重組質(zhì)粒命名 為pGEM-LEA3。
利用EcoR I和Not I雙酶切含LEA3基因的pGEM-LEA3質(zhì)粒，并 連接至經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a ( + )載體，得重組載體，命名為 ZYZ-L3。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Star中，獲得BL21-ZYZ3菌株。
根據(jù)大豆胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白3組蛋白中ZYZ22-2多肽的核苷 酸序列，即序列表中SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列設計引物 5， -GAATTCGGTTCCAAGGTCGGAGAG-3， 5' -AAGCTTTTAGGTCGTCTTCTTCGCTTC-3'。
以pGEM-LEA3為模板，進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行0. 8%瓊脂 糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為140bp的條帶，與預期結(jié)果相符。 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)回收該片段。將該回收片段與 pET-28a ( + )載體連接，插入位點為EcoR I和HindIII，參照Cohen等 的方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Topl0感受態(tài)細胞，根據(jù)pET-28a ( + )載體上的卡那霉素抗性標記篩 選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的 T7啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明為大 豆胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白3組基因(LEA3)中編碼ZYZ22-2多肽的核苷 酸序列，其開放閱讀框(0RF)為序列表中SEQ ID N0.6的自5'末端 第1至132位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中SEQ ID N0.2的第l至44位氨基酸。
將上述含有序列表中SEQ ID NO. 6所述脫氧核糖核苷酸序列的重 組質(zhì)粒載體命名為pET-力Z^-么參見附圖l。
將重組載體/^T-^Z^^轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 STAR,獲得重組菌株BL21/ZYZ22-2。
同樣，設計如下引物，以ZYZ-L3質(zhì)粒為模板進行PCR擴增 5 ， -CACCGAATTCTCTAGAGGTTCCAAGGTCGGAGAGTAC-3 ， 5' -GTCCAAGCTTCCTAGCACTAGTCCCCAACGTCGTATCTTT-3，。 重復上述瓊脂糖凝膠電泳、PCR產(chǎn)物回收的過程，獲得編碼 ZYZ22-6多肽的核苷酸序列，并克隆至pET-28a ( + )載體，獲得的質(zhì) 粒命名為/^T-Z}Z^-《。其開放閱讀框(0RF)為序列表中SEQ ID NO. 7 的自5'末端第1至429位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列 表中SEQ ID NO. 3的第1至143位氨基酸。
將編碼ZYZ22-6多肽的核苷酸序列再次插入上面構(gòu)建好的重組 載體/^7-^ZW-6中，片段酶切位點為Nhe I和HindIII，載體酶切位 點為Spe I和HindIII，獲得可以表達ZYZ22-12多肽的重組載體，命名 為pi5T-ZrZ^-7么其開放閱讀框(ORF)為序列表中SEQ ID NO. 8的自 5'末端第1至864位脫氧核糖核苷酸，編碼的氨基酸序列是序列表 中SEQ ID NO. 4的多肽，即ZYZ22-12多肽。
實施例二多肽ZYZ22-2的表達
接種BL21/ZYZ22-2單克隆于少量培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至吸光度 值(OD,)為0. 8時，補加異丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至0. 2mM， 37TH秀導4h， 4000g離心收集菌體，2X樣品緩沖液重懸，IO(TC水浴 處理5min， 10000g離心IO分鐘，取上清進行12% SDS-PAGE,染色， 觀察結(jié)果。同實驗對照組BL21/pET-28a比較，BL21/ZYZ22-2出現(xiàn)一 條特異的蛋白條帶，與ZYZ22-2多肽預期分子量10kDa接近。實施例三多肽ZYZ20-2的純化
接種BL21/ZYZ22-2單克隆于少量培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過夜；按 1: 100比例轉(zhuǎn)入1000ml LB液體培養(yǎng)基，37匸培養(yǎng)至吸光度值(OD,) 為0.8，補加異丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至0.2mM， 37tH秀導 4h， 4000g離心收集菌體，重懸于PBS中，冰浴超聲破碎，4°C， 20000g 離心10分鐘，收集上清，參照金屬螯合親和層析介質(zhì)使用說明，使 用Chelating S印harose Fast Flow柱純化融合蛋白，獲得的初步純 化蛋白用Superdex 30 PG預裝柱進行凝膠過濾，收集目標蛋白，并 進行12% SDS-PAGE。結(jié)果表明在預期分子量處有一條特異條帶，而 其余蛋白條帶基本消失，獲得了純度較高的ZYZ22-2多肽，見附圖2。
實施例四ZYZ22-2多肽對反復凍融條件下乳酸脫氫酶(LDH)活性 的保護作用
乳酸脫氫酶反應體系中，乳酸脫氫酶的濃度為62.5ng/ml。將不 同濃度的ZYZ22-2多肽與乳酸脫氫酶按照質(zhì)量比為1: 10、 1: 5、 1:
1、 5: 1、 1: 10分別混合后，分成兩組。 一組用于直接測定乳酸脫
氫酶的活性。另一組放入液氨中速凍1分鐘，在25。C恒溫混勻器上 完全融化，反復處理10次，測定乳酸脫氫酶的殘留酶活性，分析 ZYZ22-2多肽對乳酸脫氫酶活性在反復凍融下的保護作用。以加入同 樣量的血清蛋白BSA作為對照組。
結(jié)果表明，經(jīng)過反復凍融后，沒有加入保護劑的乳酸脫氫酶活性 幾乎完全消失，酶活僅為處理前的1%左右。加入質(zhì)量濃度比為1: 1 的ZYZ22-2多肽后，乳酸脫氫酶殘留酶活升高，為處理前的11%。對 照組加入等比例BSA，可提高乳酸脫氫酶的殘留酶活，但比ZYZ22-2多肽顯著低，見附圖3。實驗表明ZYZ22-2多肽對反復凍融條件下乳 酸脫氫酶活性具有良好的保護作用。
實施例五ZYZ22-2多肽與海藻糖對高溫條件下乳酸脫氫酶(LDH) 活性的協(xié)同保護作用
將不同量的ZYZ22-2多肽與62. 5ng/ml乳酸脫氫酶混合。使混合 后ZYZ22-2多肽與乳酸脫氫酶的質(zhì)量比分別為0:1 、 1:5、 1:1和5:1 。 將混合液分成兩組。 一組用于直接測定乳酸脫氫酶活性。另一組在 63。C恒溫混勻器上保持5分鐘后，測定乳酸脫氫酶活性，比較加入 ZYZ22-2多肽前后的乳酸脫氫酶活性，分析ZYZ22-2多肽對乳酸脫氫 酶在高溫下的保護作用。以加入同樣量的血清蛋白BSA作為對照組。
在以上實驗體系中同時加入終濃度為250ng/ml的海藻糖，經(jīng)過 上述同樣過程處理后，測定乳酸脫氫酶的活性。
結(jié)果表明，乳酸脫氫酶在高溫處理后，沒有加入保護劑的乳酸脫 氫酶活性僅為16%。在加入的ZYZ22-2多肽和BSA質(zhì)量相同時，乳酸 脫氫酶活性比較接近。實驗體系中加入50mM海藻糖后，在加入同樣 質(zhì)量的ZYZ22-2多肽和BSA時，LDH酶活性明顯高于單獨添加ZYZ22-2 多肽和BSA。而且，在ZYZ22-2多肽、BSA蛋白與LDH酶的質(zhì)量比例 為1:5、1:1和5:1時，添加ZYZ22-2多肽的乳酸脫氫酶活性高于BSA， 見附圖4。實驗結(jié)果表明ZYZ22-2多肽對高溫下的乳酸脫氫酶活性具 有一定的保護作用，在與海藻糖同時存在的情況下，可發(fā)揮協(xié)同效應 作用提高對乳酸脫氫酶活性的保護作用。
對ZYZ22-12多肽同樣進行了反復凍融處理實驗，實驗結(jié)果表明 在ZYZ22-12多肽與LDH酶的質(zhì)量比為1: 1時，經(jīng)過10次反復凍融
13處理后，LDH酶殘留活性比ZYZ22-2多肽提高1倍多，表明ZYZ22-12多肽比ZYZ22-2多肽對LDH酶活性具有更強的保護作用，見附圖5。根據(jù)實驗結(jié)果及理論推測，其它串聯(lián)數(shù)目的22氨基酸系列多肽對LDH酶均具有保護作用，并且隨著22氨基酸串聯(lián)數(shù)目的增加，在加入同樣質(zhì)量的系列多肽的條件下，對LDH酶的保護作用效果也相應提高。同樣，對于含有22氨基酸序列的多肽，如SEQ ID NO. 5所述的ZYZ-L3多肽也進行了反復凍融處理實驗。實驗結(jié)果表明在ZYZ-L3多肽與LDH酶的質(zhì)量比為l: l時，經(jīng)過10次反復凍融處理后，LDH酶殘留活性明顯高于添加BSA的對照組。根據(jù)實驗結(jié)果及理論推測，其他含有22氨基酸序列的多肽對LDH酶均具有保護作用。見附圖5。序列表
〈110〉深圳大學
〈120〉蛋白質(zhì)活性多肽及其編碼基因、表達載體、表達菌及應用〈160〉 9
〈170〉 Patentln version 3. 1
<210> 1<211〉 22〈212〉 PRT
〈213〉 Glycine Max. L<400〉 1
Vai Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys15 10 15
Glu Gly Lys Asp Ala Thr20
〈210〉 2<211> 44<212〉 PRT
〈213〉 Glycine Max丄〈400〉 2
Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys15 10 15Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr A印Tyr
20 25Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Ala Lys Lys Thr Thr35 40
30
<210〉 3〈211〉 143<212> PRT
〈213〉 Glycine Max. L〈400〉 3
Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr
15 10 15
Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met
20 25 30
Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser
50 55 60
Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly65 70 75 80
Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala
85 90 95
Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr100 105 110Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp
115 120 125
Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly
130 135 140
〈210〉 4〈211〉 288〈212〉 PRT〈213〉人工合成〈400〉 4
Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn1 5Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys20
Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr35
Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu
50 55Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg65 70Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala85
Thr Val Asn Lys Met Gly Glu100
17
Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr10 15
Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr25 30
40
Met
Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu
45
Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser60
Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly
75 80Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala
90 95Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr
105Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp115 120 125
Tyr Thr130Arg Ala145
Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys135
Asp Thr Thr Leu Gly Thr140
Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys150 155
Tyr Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Thr Lys165 170
Val Gly Glu160
Asp Ala Thr175
Met Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys
180 185 190
Glu Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr195 200 205
Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp210 215
Ala Thr Val Asn Lys Met220
Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu225 230 235
Gly
Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala245 250
Lys Asp240Glu Lys255
Thr Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys
260 265 270
Asp Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly275 280 285〈211〉 463
<212> PRT
〈213〉 Glycine Max. L
〈400〉 5
Met Ala Ser Lys Lys Gin Glu Glu Arg Ala Glu Ala Ala Ala Lys Val1
5
10
15
Ala Ala Lys Glu Leu Glu Gin Val Asn Arg Glu Arg Arg Asp Arg Asp
20 25 30
Phe Gly Val Val Ala Glu Gin Gin Gin Gin His His Gin Glu Asp Gin
35 40 45
Gin Lys Arg Gly Val lie Gly Ser Met Phe Lys Ala Val Gin Asp Thr50 55 60
Tyr Glu Asn Ala Lys Glu Ala Val Val Gly Lys65 70 75
Lys Glu Ala Thr
Asn80
Asn Ala Tyr Ser Asn Thr Glu Val lie His Asp Val Asn lie Gin Pro
85 90 95
Asp Asp Val Ser Ala Thr Gly Glu Val Arg Asp lie Ser Ala Thr Lys
100 105 110
Thr His Asp lie Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr
115 120 125
Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys130 135 140Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr A印Tyr145 150 155 160
Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly
165 170 175
Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp
180 185 190
Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys
195 200 205
Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys
210 215 220
Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn225 230 235 240
Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly
245 250 255
Lys Asp Thr Thr Leu Gly Lys Leu Gly Glu Leu Lys Asp Thr Ala Ser
260 265 270
Asp Ala Ala Lys Arg Ala Val Gly Tyr Leu Ser Gly Lys Lys Glu Glu275 280 285
Thr Lys290Gly Glu305
Glu Met Ala Ser Glu Thr Ala Glu Ala Thr Ala Asn Lys Ala295 300
Met Lys Glu Ala Thr Lys Lys Lys Thr Ala Glu Thr310 315
Ala Ala Lys Asn Lys Ala Gly Glu lie Lys Asp Arg Ala Ala325 330
Ala Glu320Glu Thr335Ala Glu Ala Ala Lys Asn Lys Thr Ala Glu Thr Ala Glu Val Thr Lys
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Glu Met Lys Asp Ala Ala Lys Asp Arg Thr Ala Glu
355 360 365
Thr Thr Asp Ala Ala Lys Gin Lys Thr Ala Gin Ala Lys Glu Asn Thr
370 375 380
Lys Glu Asn Val Ser Gly Ala Gly Glu Thr Ala Arg Arg Lys Met Glu 385 390 395 400
Glu Pro Lys Leu Gin Gly Lys Glu Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Asp Lys
405 410 415
Val Val Val Lys Val Glu Glu Ser Arg Pro Gly Ala lie Ala Glu Thr
420 425 430
Leu Lys Ala Ala Asp Gin lie Ala Gly Gin Thr Phe Asn Asp Val Gly
435 440 445
Arg Phe Asp Glu Glu Gly Val Val Asn Val Glu Arg Arg Lys Lys 450 455 460
〈210〉 6 〈211〉 132 〈212〉 DNA
〈213〉 Glycine Max丄 <400> 6
ggttccaagg tcggagagta cgcagattac gcttctcaga aggccaagga aacaaaagat 60 gcaacgatgg aaaaagctgg agagtacacg gattatgctt cgcagaaagc gaaggaagcg 120aagaagacga cc 132
〈210〉 7 <211〉 429 〈212〉 DNA
〈213〉 Glycine Max. L 〈400〉 7
gccEicggaca acaacaacaa caaaaccggt tccaaggtcg gagagtacgc agattacgct 60 tctcagsagg ccaaggaaac aaaagatgca acgatggaaa aagctggaga gtacacggat 120 tatgcttcgc agaaagcgaa ggaagcgaag aagacgacca tggagaaggg tggagaatac 副 aaggattact ctgcggagaa agctaaggag agaaaagatg ctactgtgaa taagatggga 240 gagtataagg actatgctgc ggagaaagcc aaagagggga aagatgctac tgtgaataaa 300 atgggagagt ataaggacta tgctgcggag aaaacgaaag aggggaaaga tgccactgtg 360 aataagatgg gagagtataa ggattacact gcggagaagg cgaaagaggg gaaagatacg 420 scgttgggg 429
〈210〉 8 〈211〉 864 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 8
gccacggaca acaacaacaa caaaaccggt tccaaggtcg gagagtacgc agattacgct 60 tctcagaagg ccaaggaaac aaaagatgca acgatggaaa aagctggaga gtacacggat 120 tatgcttcgc agaaagcgaa ggaagcgaag aagacgacca tggagaaggg tggagaatac 180aaggattact ctgcggagaa agctaaggag agaaaagatg ctactgtgaa taagatggga 40
gagtataagg actatgctgc ggagaaagcc aaagagggga aagatgctac tgtgaataaa 300
3tgggagagt ataaggacta tgctgcggag 3aaacgaaag aggggaaaga tgccactgtg 3G0
aat3ag3tgg gagagtataa^ ggatt已cact gcggag犯gg cgaaagaggg gaaagata^cg 420
acgttgggga ctagagccac ggacaaca^c aacaacaaaa ccggttccaa ggtcggagag 480
tacgcagatt acgcttctca gaaggccaag gaaacaaaag atgcaacgat ggaaaaagct 540
ggagagtaca cggattatgc ttcgcagaas gcgaaggaag cgaagaagac gaccatggag 600
aagggtggag犯tacaagga ttactctgcg gaga3agcta agg3gagaB3 agatgctact GGO
gtgaataaga tgggagagta taaggactat gctgcggaga犯gccaaaga ggggaaagat 720
gctactgtga ata^aatggg agagtstaag gactatgctg cggagaaaac g犯agagggg 780
aaagatgcca ctgtgaat己a gatgggagag tataaggatt acactgcgga gaaggcgaaa 840
gaggggaaag at已cgacgtt gggg 864
〈210〉 9 〈211〉 1389 〈212〉 腿
<213〉 Glycine Max. L 〈400〉 9
atggcgtcca aga_aacaaga ggagcgsgct gaggcagctg cgaaaigttgc tgccaaaga^ GO ctcgaacaag tcaacagaga aagaagagac cgtgatttcg gtgttgttgc tgaacaacaa 120 caacaacatc atcaggaaga tcaacaaaaa cgtggtgtsa tcgggtccat gtttaaggcg 180 gtgcaagaca cctacgagaa cgccaaggaa gctgtcgttg gcaagaaaga agctactaat 240 aacgcgtaca gtaatacaga ggttattcac gatgttaaca ttcagcccga tgacgtgtcg 300gcaacggggg aagtaaggga catatcagcc acaaagactc atgatatcta cgattctgcc 360
acggacaaca acaacaacaa aaccggttcc犯ggtcggag agtacgcaga ttacgcttct 420
cagaaggcca aggaaacaaa agatgc犯cg atggaaaaag ctggagagtai cacagattait 480
gcttcgC￡ig￡L aagcgaagga agcgaagaag acgaccatgg agaagggtgg agaatacaag 540
gatteictctg cggagaaagc taaggagaga aaagatgcta ctgtgaataa gatgggagag 600
tataaggact atgctgcgga gaaagccaaa g己ggggaaag atgctactgt gaataaaatg 660
ggagagtata aggactatgc tgcggagaaa acg犯agagg ggaaag￡itgc cactgtgaat 720
aagatgggag agtataaigga ttacactgcg gagaaggcg￡i aagaggggaa agatacgacg 780
ttggggaagc ttggggagct gaaggacacg gcttcggatg cggcg卿ag ggccgtgggt 840
tacttgagcg gcaagaaaga ggaaactaaa gagatggctt cggagaccgc cgaggcgacg 900
gcgaMaagg cagggg卿t gaaggaggca acaa卿犯a卿cggcgga gaccgcggag %0
gcggcga卿ataaggcggg gg卿tcaag gac卿gccg cgg卿cggc ggaggccgcg 1020
aaaaacaaga ccgcggagac cgcggaagtg acgaagaata aggctttgga gatgaaggat 1080
gcagcgaagg acaggaccgc tgagacaacg gatgcggcga agcagaaaac tgcacaggca 1140
aaggagaaca ccaagga^aai tgtgagtggt gcaggtgaaa ctgcaaggag gaaaatggaa 1200
gagcca卿c ttcaaggtaa卿agggtat gggggccgtg g卿c卿gt ggtggtgaaa l扁
gtggaagaga gtcgaccagg ggcaattgcg gaaacgctga aagccgccga ccagattgcg 1320
ggacagacct tcaacgatgt aggacgcttc gatgaagagg gtgtcgtcaa tgtggagcgc 1380
cgcaagaaa 1389
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽，為如下(a)或(b)或(c)所述的多肽(a)由2-12個多肽ZYZ22或其同源序列首尾串聯(lián)而成的多肽，多肽ZYZ22之間由0-5個氨基酸連接起來；所述多肽ZYZ22為序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，其同源序列為具有1-9個氨基酸取代的序列；(b)(a)所述的多肽經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護功能的由(a)衍生的多肽；(c)含(a)或(b)所述多肽且具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護功能的多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽，其 特征在于為序列表中SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽，其 特征在于為序列表中SEQ ID N0.3所述的氨基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽，其 特征在于為序列表中SEQ ID N0.4所述的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽，其 特征在于為序列表中SEQ ID N0.5所述的氨基酸序列。
6. —種DNA序列，為如下(a)或(b)所述的DNA序列(a)編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽的 DNA序列；(b)在嚴格條件下可與(a)所述DNA序列雜交的DNA序列； 所述嚴格條件為在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然 后用2XSSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA序列，其特征在于為序列表中 SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所述的 核苷酸序列。
8. —種重組表達載體，包含有權(quán)利要求6所述的任何一種DNA 序列。
9. 一種表達菌，包含有權(quán)利要求8所述的任何一種重組表達載 體或權(quán)利要求6所述的任何一種DNA序列。
10. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護多肽在蛋白 質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護劑上的應用。
全文摘要
本發(fā)明為一種蛋白質(zhì)活性多肽及其編碼基因、表達載體、表達菌及應用。所述蛋白質(zhì)活性多肽為(a)由2-12個多肽ZYZ22或其同源序列首尾串聯(lián)而成的多肽；(b)上述多肽經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而成的衍生多肽；(c)含上述任一多肽且具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護功能的多肽。所述DNA序列為(a)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)活性多肽的DNA序列；(b)在嚴格條件下可與(a)所述DNA序列雜交的DNA序列。所述重組表達載體包含有本發(fā)明的任何一種DNA序列。所述表達菌包含有本發(fā)明的任何一種重組表達載體或本發(fā)明任何一種DNA序列。本發(fā)明的多肽可保持蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性和生物活性，應用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護劑。
文檔編號C07K14/415GK101665533SQ20091019029
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者鄭易之 申請人:深圳大學