專利名稱：一種動脈粥樣硬化細胞模型的建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種動脈粥樣硬化細胞模型的建立方法。
背景技術：
已經(jīng)知道oxLDL中的很多組分對動脈硬化斑的形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到至關重要的作用。研究又發(fā)現(xiàn)P2-GPI的特異性配體，oxLig-l，具有較強的免疫活性，并在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到至關重要的作用(Liuetal.， J Lipid Res 2002， 43:1486-95)。
PCT/JP02/00723公開了利用WSC/DMAP催化劑體系化學合成oxLig-l方法合成oxLig-l，在進行7-酮基膽固醇(7-KC)和壬二酸的脂縮合反應合成oxLig-l時，l-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)和4- 二甲氨基吡啶(DMAP)作為合成反應的催化劑。但此方法的缺陷是oxLig-l合成量并不高，反應時間較長，需2-3天。
在動脈粥樣硬化的初期，NF-k B活化被認為動脈粥樣硬化形成的關鍵環(huán)節(jié)，oxLDL中的很多組分，如13-HPODE(13-hydroperoxyoctadecadienoic acid)，氧磷脂，溶血卵磷脂，氧固醇和羥基壬烯，均激活NF-k B的活化[Winther et al.， Arterioscler ThrombVase Biol 2005， 25 : 904-14]，但oxLig-l對NF- k B的活化作用未見報道。[OO(H] 陳潔等[解剖學研究，2007，第29巻第03期]報道了建立鼠動脈粥樣硬化模型的建立方法，但是動物模型的建立既費時間又耗經(jīng)費。目前尚未報道有關利用oxLig-l建立動脈粥樣硬化細胞模型的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對oxLig-l的合成方法進行改良，提出一種高效快速的動脈粥樣硬化細胞模型的建立方法。
本發(fā)明的技術方案是 一種動脈粥樣硬化細胞模型的建立方法，該方法包括合成oxLig-l改良方法；以oxLig-l為剌激物用于促進PKC和NF- k B信號通路的活化；以oxLig-l能誘導單核細胞(THP-1)分化成巨噬細胞；oxLig-l作用J774A.1細胞12小時后，巨噬細胞內(nèi)脂肪蓄積，形成泡沫細胞，最后引起細胞凋亡。步驟如下
—、合成oxLig-l : 以7-ketocholesterol(5-cholesten-3 P -ol-7-one)(7-KC)和壬二酸的脂為原料，以1，3- 二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)和4- 二甲氨基吡啶(DMAP)作為合成反應的催化劑，二氯
甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸dcc : dmap : 7-kc = 4 : 1.5 : 1 : 1，縮
合反應合成oxLig-l，即7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷，反應式如下
Azelaic add 反應物在室溫下進行，攪拌反應12h后回流12h，最后過濾。粗產(chǎn)物經(jīng)飽和NaCl 萃取清洗，收集有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，隔天蒸干。粗產(chǎn)物隨后經(jīng)硅膠柱層析，
純氯仿、氯仿甲醇=100 : i和氯仿甲醇=75 : i三種極性的洗脫液依次進行純化。
DCC吸水后生成不溶于反應介質(zhì)的N， N' -二環(huán)己基脲，過濾即可除去，后處理容易。
另外DCC的價格比較便宜，而且收率也很高，有一定的經(jīng)濟效益。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)分析合成的oxLig-l與13 2-GPI結合活性。 二、 oxLig-l促進PKC和NF-KB信號通路的活化 (l)oxLig-l誘導的J774A.1細胞中I k B a的磷酸化和降解 oxLig-l是一種氧化型脂類分子，在多種細胞類型中如巨噬細胞等，能激活 NF- k B信號轉(zhuǎn)導通路。本發(fā)明中主要探討oxLig-l活化NF- k B是否受I k B a的磷酸化 所介導。 J774A.1細胞使用50 y g/mL蛋白酶體抑制劑(ALLN)預處理30分鐘，隨后用以 不同濃度(O， 5， 10， 20， 50iig/mL)的oxLig-l作用J774A.1細胞，用Western Blot技術 檢測I k B a 32位和36位絲氨酸磷酸化的水平。結果顯示I k B a的磷酸化呈時間和濃度 依賴性顯著升高，其發(fā)生在30分鐘后，并在20 g/mL oxLig-l作用2小時后磷酸化水平 最為顯著。這一結果證實了 oxLig-l介導的NF- k B的活化受I k B a的磷酸化所介導。
(2)oxLig-l介導了 NF- k B的DNA結合活性 在NF-KB的活化過程中，其與DNA特異位點的結合非常關鍵，這種特異性結 合能啟動下游一系列細胞因子的表達。本發(fā)明采用了電泳遷移率EMSA實驗手段觀察了 這種結合。 J774A.1細胞經(jīng)20 y g/mL的oxLig-l作用30和60分鐘，以0.1 %的乙醇作用細胞 設為空白對照。核提取物經(jīng)包含生物素標記的NF-k B保守序列的寡聚核苷酸探針處理， 隨后進行電泳遷移率實驗(EMSA)。結果顯示，oxLig-l介導的NF- k B的DNA結合活性 呈時間依賴性，相應的空白對照并為觀察的這一特異性結合。我們同時采用了未標記的 突變探針和標記的探針競爭性的與核提取物結合來驗證NF- k B的DNA結合特異性，結 果顯示只有標記了的探針能特異性的識別NF- k B的DNA結合活性。證實了 oxLig-l介 導的NF- k B與DNA結合的特異性。
(3)oxLig-l誘導NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 激光共聚焦顯微鏡法證實了 oxLig-l誘導NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位。在J774A.1細 胞中，NF-KB/p65主要定位在細胞質(zhì)中，而當細胞受到oxLig-l作用后，NF-k B/p65發(fā) 生了核轉(zhuǎn)位，大量的p65蛋白在細胞核中表達。
(4)oxLig-l通過激活PKC通路活化NF- k B : 有報道證實NF- k B的活化經(jīng)由PKC信號通路，本發(fā)明探討了 J774A.1細胞經(jīng) oxLig-1處理后PKC通路的激活情況。PKC信號通路在oxLig-1作用J774A.1細胞5min 后活化，而I k B a在oxLig-1作用細胞后30min發(fā)生降解，說明oxLig-1通過激活PKC 信號通路影響NF- k B的活化。 (5) P 2-GPI抑制oxLig-1介導的I k B a的磷酸化 前期研究報道稱oxLig-1是13 2-GPI的特異性配體，并且oxLig-1/13 2-GPI復合體 對動脈硬化的發(fā)生具有一定的影響。所以本發(fā)明檢測了 ！^-GPI對oxLig-l介導的NF-KB
的活化是否存在一定的干擾作用。 J774A.1細胞先用ALLN預處理lh， 分另U用20 y g/mL的oxLig-1和 oxLig-l(20 ii g/mL)/P 2-GPI(200 y g/mL)復合物作用J774A.1細胞，結果顯示P 2-GPII有效 地抑制lKBa的磷酸化。 (6) P 2-GPI抑制oxLig-1介導的NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 通過激光共聚焦顯微鏡法我們證實了 13 2-GPI對oxLig-1誘導的NF- k B/p65的轉(zhuǎn) 位有抑制作用。在僅用P 2-GPI作用的J774A.1細胞中，NF- k B/p65主要定位在細胞質(zhì) 中。而當細胞受到oxLig-1和13 2-GPI的作用后，NF- k B/p65核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象受到了抑制。
三、oxLig-1介導的人THP-1向巨噬細胞趨化 動脈硬化的發(fā)展過程中，伴隨著單核細胞粘附于血管內(nèi)皮細胞層，隨后便進入 亞內(nèi)皮空間并分化成巨噬細胞。進而，巨噬細胞攝取大量的oxLDL形成泡沫化細胞，最 后在血管內(nèi)皮層堆積。所以，本發(fā)明觀察了oxLig-l是否也具有趨化THP-l細胞形成巨 噬細胞的作用。調(diào)節(jié)人THP-1細胞濃度為2X 105個細胞/ml，接種于置有蓋玻片的6孔 培養(yǎng)板中，每孔2ml，生長至接近融合，換無血清培養(yǎng)液作用12h，經(jīng)oxLig-l處理后， 常規(guī)H-E染色。光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的變化。結果顯示oxLig-1確實具有這種特 性，THP-1細胞受到作用后形成梭形的貼壁細胞，即巨噬細胞。
四、oxLig-1介導的人THP-1細胞的泡沫化 加入不同濃度oxLig-l(O、 5、 10、 20、 40禾P 80 y g/mL)，作用人THP-1細胞18h 后，經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)脂質(zhì)聚積發(fā)生變化，隨著oxLig-l濃度的增加，人THP-1細 胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加。說明oxLig-l進入人THP-1細胞后在細胞中聚積。其中，10 g/mL 和20iig/mLoxLig-l作用后細胞內(nèi)脂質(zhì)聚積最為明顯，細胞質(zhì)中有明顯的脂滴。3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)結果顯示，當oxLig-1的濃度大于25 y g/ mL時泡沫細胞引起細胞凋亡活力呈明顯減弱，并且呈時間和濃度依賴性。
本發(fā)明的有益效果是動脈粥樣硬化細胞模型的建立可以代替耗費時間的動物 模型，將會對動脈粥樣硬化的機理研究提供一種有效手段。


圖1為ELISA分析測定oxLig-1與P 2-GPI結合能力圖。 圖2為oxLig-l誘導的lKBa的磷酸化和I k B a的表達呈濃度和時間依賴性曲 線圖。 圖3為oxLig-1介導了 NF- k B的DNA結合活性呈時間依賴性對比圖。
圖4oxLig-l介導的NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位。 圖5oxLig-l對I k B a的表達和PKC通路的影響。 圖6 P 2-GPI對oxLig-1介導的I k B a的磷酸化的抑制作用。 圖7為oxLig-1介導的人THP-1向巨噬細胞趨化前后對比圖。 圖8為oxLig-1介導的人THP-1細胞的泡沫化形成圖。 圖9為oxLig-1對J774A.1細胞生長的影響示意圖。
具體實施方式

實施例1 —、 oxLig-1的化學合成及結構分析
1、合成oxLig-1 :
(1)建立反應 0.500mmol的壬二酸、0.1875mmol DCC和(U25mmo1催化劑DMAP溶于15mL 二氯甲烷中，由恒壓漏斗逐滴加入同樣溶于二氯甲烷的0.125mmo1 7-KC，各物質(zhì)摩爾比
為壬二酸dcc : dmap : 7-kc = 4 : 1.5 : i : i。 反應物在4(TC攪拌反應12h后回流12h，其間利用薄層層析隨時檢測反應情況。 [OO49] (2)反應后處理 將反應產(chǎn)物進行減壓過濾，除去不溶的脲；飽和NaCl萃取3次，收集有機相； 無水Na^04干燥過夜。 (3)拌樣 稱取干燥產(chǎn)物3倍質(zhì)量的拌樣硅膠(100-140目)與產(chǎn)物于少量CH2C12中溶解，
自然晾干。 (4)裝柱 稱取干燥產(chǎn)物50倍質(zhì)量的純化硅膠(200-300目)，連續(xù)倒入柱子中，顛實；加 入拌樣硅膠，最后壓一薄層純化硅膠。
(5)純化 先后用純氯仿、氯仿甲醇=ioo : i和氯仿甲醇=75 : i三種極性的洗脫 液進行純化。
(6)純品收集
6
將含純品的洗脫液收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到純品oxLig-l。
(7)樣品分析 測定熔點，紅外譜，核磁碳譜、氫譜，質(zhì)譜檢測合成樣品。 整個脂縮合反應時間為24小時，最終產(chǎn)物通過硅膠柱層析分離。以這種方式合 成的oxLig-l的產(chǎn)率為80.4% ，證實DCC/DMAP脂縮合合成體系對oxLig-l的合成是可行 的，并且具有相當客觀的得率。 2、 ELISA法檢測oxLig-l與P 2-GPI的結合情況(1)將合成的oxLig-l和心磷脂(CL，陽性對照)溶于無水乙醇中，以50 ii g/mL
濃度，50iiL/孔進行包被，電吹風吹干。 (2)1 % (W/V)BSA-PBS(150 y 1/孑L )封閉lh。(3)加入含0.3% (W/V)BSA的P 2-GPI(30 y g/mL， 50 y L/孔)，室溫孵育20min。
(4)加入抗P 2-GPI抗體(WB-CAL-1 ; 5.0 ii g/mL， 50 ii L/孔)，室溫孵育lh。
(5)辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG(HRP-labeled anti-mouse IgG)(l : 1000稀
釋)，室溫孵育lh。 (6)o-phenylenediamine(OPD)禾P H202顯色反應(2mg OPD， 10mL 0.1M Citrate Buffer pH5.0， 10 ii L H202)。 (7)2N H2SO4(100 ii L/孑L )終止顯色反應。
(8)酶標儀490nm檢測吸光度值。各步驟之間用0.05% (W/V)Tween 20PBS洗3次。無水乙醇做空白對照。 通過ELISA分析，合成的oxLig-l具有與P 2-GPI結合活性，見圖1。 二、 oxLig-l促進NF-KB信號通路的活化 1、 oxLig-l誘導的J774A.1細胞中I k B a的磷酸化和降解 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析設置時間梯度和濃度梯度，用oxLig-l作用
J774A.1細胞。使用Pierce公司的細胞核和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和漿蛋白。每
個樣品的蛋白濃度經(jīng)Pierce BCA蛋白定量試劑盒定量，-S(TC保存。 蛋白樣品(20iig/孔)經(jīng)12X的聚丙烯不連續(xù)凝膠分離，80V約兩小時。電泳后 100V轉(zhuǎn)膜約l小時，之后用含5%的牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1小時，洗膜后孵育l 比1000稀釋抗I k B a和I k B a磷酸化抗體，4。C過夜，再次洗膜后用辣根過氧物酶標記 的羊抗鼠二抗(l : 5000)孵育1小時，最后使用增強型化學發(fā)光系統(tǒng)ECL顯影，所得結 果使用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析。結果如圖2所示，lKBa的磷酸化呈時間和濃度依賴 性顯著升高，其發(fā)生在30分鐘后，并在20 i！ g/mL oxLig-l作用2小時后磷酸化水平最為 顯著。這一結果證實了 oxLig-l介導的NF- k B的活化受I k B a的磷酸化所介導。
2、 oxLig-l介導了 NF- k B的DNA結合活性 為了檢測NF-KB的DNA結合活性，研究使用了電泳遷移率實驗(EMSA)，并使 用為標記的突變探針做為競爭性探針來確定結合的特異性。NF- k B的DNA結合活性通 過EMSA試劑盒檢測(Viagene Biotech, Ningbo)，實驗方法如操作說明書所示。試劑盒中 所包含的保守的NF- k B寡聚核苷酸序列為5' -TTG TTA CAA GGG ACT TTC CGC TGG GGA CTT TCC AGG GAG GCG TGG-3'。 結果如圖3所示，oxLig-l介導的NF-KB的DNA結合活性呈時間依賴性，相應
7的空白對照并為觀察的這一特異性結合。我們同時采用了未標記的突變探針和標記的探 針競爭性的與核提取物結合來驗證NF-KB的DNA結合特異性，結果顯示只有標記了的 探針能特異性的識別NF- k B的DNA結合活性。證實了 OxLig-1介導的NF- k B與DNA
結合的特異性。 3、 oxLig-1誘導NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 激光共聚焦顯微鏡法證實了 oxLig-1誘導NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位。正常細胞及經(jīng) 20ug/mL oxLig-1作用12h后的細胞，用免疫熒光雙染色法檢測NF- k B/p65的表達情況， 樣品經(jīng)40g/L的多聚甲醛室溫固定lOmin， PBS清洗3次后，使用lmL/L Triton X-100處 理10min破膜。山羊血清工作液封閉lh， 1 : 50稀釋兔抗NF-KB/p65抗體，4"孵育過 夜。次日，PBS清洗后，使用異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG避光孵育2h，最后用 10mg/L碘化吡啶對細胞核進行復染，封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察實驗結果并照相。 細胞受到oxLig-l作用后，NF-KB/p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)位，大量的p65蛋白在細胞核中表達， 如圖4所示。 4、 oxLig-l通過激活PKC通路活化NF- k B : 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析設置時間梯度(O， 5， 15， 30， 60， 120h)，用 oxLig-1作用J774A.1細胞。使用Pierce公司的細胞核和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和 漿蛋白。每個樣品的蛋白濃度經(jīng)Pierce BCA蛋白定量試劑盒定量，-S(TC保存。
蛋白樣品(20iig/孔)經(jīng)12X的聚丙烯不連續(xù)凝膠分離，80V約兩小時。電泳后 100V轉(zhuǎn)膜約l小時，之后用含5%的牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1小時，洗膜后孵育l 比IOOO稀釋抗PKC磷酸化抗體，fC過夜，再次洗膜后用辣根過氧物酶標記的羊抗鼠二 抗(l : 5000)孵育1小時，最后使用增強型化學發(fā)光系統(tǒng)ECL顯影，所得結果使用UVP 凝膠成像系統(tǒng)分析。結果如圖5所示，PKC的磷酸化發(fā)生在5分鐘，而I k B a在30分 鐘時降解，證實了 oxLig-l介導的NF- k B的活化受PKC磷酸化所介導。
5、 P 2-GPI抑制oxLig-1介導的I k B a的磷酸化 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析J774A.1細胞先用ALLN預處理lh，分別用 20 ii g/mL的oxLig-1和oxLig-l(20 y g/mL)/ P 2-GPI(200 y g/mL)復合物作用J774A.1細胞。 使用Pierce公司的細胞核和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和漿蛋白。每個樣品的蛋白濃 度經(jīng)Pierce BCA蛋白定量試劑盒定量，-80°〇保存。 蛋白樣品(20 P g/孔)經(jīng)質(zhì)量濃度為12%的聚丙烯不連續(xù)凝膠分離，80V約兩小 時。電泳后IOOV轉(zhuǎn)膜約1小時，之后用含質(zhì)量比為5%的牛血清白蛋白封閉液室溫封閉 l小時，洗膜后孵育l比lOOO稀釋抗lKBa磷酸化抗體，4t:過夜，再次洗膜后用辣根 過氧物酶標記的羊抗鼠二抗(l : 5000)孵育1小時，最后使用增強型化學發(fā)光系統(tǒng)ECL 顯影，所得結果使用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析。結果如圖6所示，^-GPII有效地抑制 IkB a的磷酸化。 6、 P 2-GPI抑制oxLig-l介導的NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 如圖4所示，通過激光共聚焦顯微鏡法我們證實了 13 2-GPI對oxLig-1誘導的 NF- k B/p65的轉(zhuǎn)位有抑制作用。在僅用P 2-GPI作用的J774A.1細胞中，NF- k B/p65主 要定位在細胞質(zhì)中。而當細胞受到oxLig-1和13 2-GPI的作用后，NF- k B/p65核轉(zhuǎn)位現(xiàn) 象受到了抑制。
三、oxLig-l介導的人THP-1向巨噬細胞趨化 調(diào)節(jié)人THP-1細胞濃度為2X105個細胞/ml，接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板
中，每孔2ml，生長至接近融合，換無血清培養(yǎng)液作用12h，經(jīng)oxLig-l處理后，常規(guī)蘇
木精-伊紅(H-E)染色。光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的變化。結果如圖7所示，oxLig-l
確實具有這種特性，THP-1細胞受到作用后形成梭形的貼壁細胞，即巨噬細胞。 四、oxLig-l介導的人THP-1細胞的泡沫化(油紅0染色) (1)將滅菌的蓋玻片放入6孔板中，按照1 X 105/mL接種人THP-1細胞，37"培
養(yǎng)12h ;(2)分別加入含5iig/mL、 10 ii g/mL、 20iig/mL、 40 ii g/mL和80 ii g/mL oxLig-l
培養(yǎng)基2mL， 37"C培養(yǎng)18h; (3)取出蓋玻片，1XPBS洗3次； (4)4% (V/V)多聚甲醛，4"固定15min后，1XPBS洗3次；
(5)60% (V/V)異丙醇洗片1次； (6)配制油紅0工作液6mL飽和油紅+蒸餾水4mL，混合后靜置10min后過 濾，染色20min;(7)60% (V/V)異丙醇洗去多余染液； WOO] (8)蒸餾水洗，晾干后，中性樹膠封片。 經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn)，人THP-1細胞細胞內(nèi)脂質(zhì)聚積發(fā)生變化，隨著oxLig-l濃度 的增加，人THP-1細胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加。說明oxLig-l進入人THP-1細胞后在細胞中聚 積。其中，10iig/mL和20iig/mLoxLig-l作用后細胞內(nèi)脂質(zhì)聚積最為明顯，細胞質(zhì)中有 明顯的脂滴，如圖8所示。
五、細胞活力檢測(MTT法) 使用MTT法檢測細胞的活力。簡而言之，處于指數(shù)生長期的1774久1細胞接種 于96孔板中，每孔1X104細胞，并做3次重復。細胞經(jīng)12小時無血清培養(yǎng)后，用20yg/ mL的oxLig-l作用6、 12、 24和48小時，同時用不同濃度(O、 5、 25、 50、 75、 100 y g/ ml)的oxLig-l作用J774A.1細胞24小時，J774A.1細胞經(jīng)處理后，在每孔中加入20 y L MTT(5mg/mL)， 37。C孵育4小時。反應后的產(chǎn)物用二甲基亞砜(DMSO)溶解，在570nm 波長處檢測吸光值。結果顯示，當oxLig-l的濃度大于25 ii g/mL時泡沫細胞活力呈明顯 減弱，并且呈時間和濃度依賴性，見圖9。
權利要求
一種動脈粥樣硬化細胞模型的建立方法，其特征在于，步驟如下一、合成oxLig-1以7-ketocholesterol(5-cholesten-3β-ol-7-one)(7-KC)和壬二酸的脂為原料，以1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為合成反應的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸∶DCC∶DMAP∶7-KC＝4∶1.5∶1∶1，縮合反應合成oxLig-1，即7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷，反應式如下反應物在室溫下進行，攪拌反應12h后回流12-24h，最后過濾，粗產(chǎn)物經(jīng)飽和NaCl萃取清洗，收集有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，隔天蒸干，粗產(chǎn)物隨后經(jīng)硅膠柱層析，純氯仿、氯仿∶甲醇＝100∶1和氯仿∶甲醇＝75∶1三種極性的洗脫液進行純化，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)分析，合成的oxLig-1與β2-GPI結合活性；二、oxLig-1促進PKC和NF-κB信號通路的活化(1)oxLig-1誘導的J774A.1細胞中IκBα的磷酸化和降解；(2)oxLig-1介導了NF-κB的DNA結合活性；(3)oxLig-1誘導NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位；(4)oxLig-1通過激活PKC通路活化NF-κB；(5)β2-GPI抑制oxLig-1介導的IκBα的磷酸化；(6)β2-GPI抑制oxLig-1介導的NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位；三、oxLig-1介導的人THP-1向巨噬細胞趨化oxLig-1確實具有這種特性，THP-1細胞受到作用后形成梭形的貼壁細胞，即巨噬細胞；四、oxLig-1介導的人THP-1細胞的泡沫化oxLig-1進入人THP-1細胞后在細胞中聚積，其中，10μg/mL和20μg/mL oxLig-1作用后細胞內(nèi)脂質(zhì)聚積最為明顯，細胞質(zhì)中有明顯的脂滴，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽MTT結果顯示，當oxLig-1的濃度大于25μg/mL時泡沫細胞引起凋亡，并且呈時間和濃度依賴性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種動脈粥樣硬化細胞模型的建立方法。該方法包括合成oxLig-1改良方法；以oxLig-1為刺激物用于促進PKC和NF-κB信號通路的活化；以oxLig-1能誘導單核細胞(THP-1)分化成巨噬細胞；oxLig-1作用J774A.1細胞12小時后，巨噬細胞內(nèi)脂肪蓄積，形成泡沫細胞，最后引起細胞凋亡。本發(fā)明的有益效果是動脈粥樣硬化細胞模型的建立可以代替耗費時間的動物模型，將會對動脈粥樣硬化的機理研究提供一種有效手段。
文檔編號C07J9/00GK101691562SQ200910187818
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權日2009年9月30日
發(fā)明者劉慶平, 李文哲, 黃振宇 申請人:大連大學