一種雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種耐熱保護劑活疫苗及其制備方法，尤其是一種雞馬立克氏病耐熱 保護劑活疫苗及其制備方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 馬立克氏病是雞的一種淋己組織增生性腫瘤病，目前是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的= 大主要疫?。R立克氏病、雞新城疫及雞傳染性法氏囊病)之一，感染的雞群出現(xiàn)較高的發(fā) 病率和死亡率，成為一種世界性疾病。其病理表現(xiàn)為外周神經(jīng)淋己樣細胞浸潤和增大，引起 肢(翅)麻搏，并在性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚等部位出現(xiàn)腫瘤樣的病灶。
[0003] 疫苗免疫是防控該病的重要手段。國內(nèi)常用的弱毒疫苗有兩種：一種為病毒與細 胞結合的馬立克氏病液氮苗，它的需用液氮保存，運輸及保存條件苛刻使疫苗的長期保存 和運輸受到限制；另一種為病毒脫離細胞的火雞瘤疹病毒凍干活疫苗(HVT)，保存相對較 易，使用廣泛。
[0004] 目前，馬立克氏病火雞瘤疹弱毒疫苗采用雞胚成纖維細胞生產(chǎn)，大多制成凍干活 疫苗?，F(xiàn)有的凍干疫苗生產(chǎn)工藝存在著生產(chǎn)成本較高、保存困難和免疫效果不盡理想等問 題。因此，研發(fā)一種生產(chǎn)成本相對較低、適于大規(guī)模生產(chǎn)、保護功能強的馬立克氏病活疫苗 耐熱凍干保護技術顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服已有技術之缺陷，提供一種雞馬立克氏病耐熱 保護劑活疫苗及其制備方法，制備的雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗具有耐熱性能好、保 護功能強的特點。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術方案實現(xiàn)的： 一種雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗，是由雞馬立克氏病病毒與耐熱保護劑混合凍干 而成;所述耐熱保護劑是由W質量體積百分含量計的下列組分構成:薦糖8~10%，聚乙締化 咯燒酬2~4%，聚賴氨酸3~6%，酶解明膠1~2%，乳蛋白水解物2~6%，谷氨酷胺0.4~1%，L-精氨酸0.05~0.5%，甘油1~4%，蘆布若爾2~5%，余量為水。
[0007] -種雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，包括如下步驟： a.細胞制備：用抓TA-膜酶消化SPF雞胚成纖維細胞，并加入細胞生長液，在36~37°C 溫度下培養(yǎng)20~28小時，至生成細胞單層;所述邸TA-膜酶的濃度為質量體積百分含量為1% ~3〇/〇。
[000引b.接毒:接種雞馬立克氏病病毒，加入細胞培養(yǎng)液體積10%的輔助培養(yǎng)液，按100 ~200萬個/毫升復種雞胚成纖維細胞，36~37°C繼續(xù)培養(yǎng)2~4日。
[0009] C.收獲與凍干:細胞病變達75%~85%時，棄去90%細胞培養(yǎng)液，轉動細胞培養(yǎng)瓶， 使細胞全部脫離瓶壁，收集、低速離屯、，取沉淀細胞并稱重，加入耐熱保護劑，進行勻漿和超 聲波裂解，定量分裝和冷凍真空干燥，制成雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗。
[0010] 上述雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，步驟a中抓TA-膜酶的消化溫度 為2~8°C，消化時間為10~18小時。
[0011] 上述雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，步驟b中輔助培養(yǎng)液為含有水 解乳蛋白、精氨酸和谷氨酷胺的水溶液。
[0012] 上述雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，步驟C中耐熱保護劑的加入量 為每克沉淀細胞加入100~300ml。
[0013] 本發(fā)明所述疫苗及其制備方法具有W下特點： (1)本發(fā)明在耐熱保護劑中添加表面活性劑蘆布若爾、氨基酸聚合物聚賴氨酸，并與酶 解明膠、聚乙締化咯燒酬等最適配比，降低了病毒在冷凍和真空干燥過程中損傷，且提高了 產(chǎn)品在保存和使用中的穩(wěn)定性。
[0014] (2)本發(fā)明采用高濃度抓TA-膜酶冷消化SPF雞胚，顯著提高了細胞產(chǎn)量和細胞活 性，結合細胞復種技術和直接收獲病變細胞，有效提高了病毒產(chǎn)量，顯著降低成本，為生產(chǎn) 高效價疫苗奠定基礎。
[0015] (3)本發(fā)明在接毒后不更換細胞培養(yǎng)液，而是添加少量輔助液，降低了生產(chǎn)成本。
[0016] (4)發(fā)明的禽用耐熱保護劑活疫苗，實現(xiàn)了疫苗儲運過程中的冷藏保存，延長了保 存期，由原來-15°C W下保存18個月提高到2~8°C保存36個月。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合【具體實施方式】做進一步的說明。
[001引實施例1耐熱保護劑的制備 薦糖、聚乙締基化咯燒酬(K30)和酶解明膠等耐熱保護劑組方原料均為常規(guī)試劑，市場 上有售。
[0019] (1)配制耐熱保護劑1 配制1000 ml耐熱保護劑:稱取薦糖lOOg、聚乙締化咯燒酬(K30)40g、聚賴氨酸60g、酶解 明膠lOg、乳蛋白水解物20g、谷氨酷胺4g、L-精氨酸0.5g、甘油10ml、蘆布若爾50g加入去離 子水中并定容到1000ml，制得耐熱保護劑1，除菌備用。
[0020] (2)配制耐熱保護劑2 配制1000 ml耐熱保護劑:稱取薦糖80g、聚乙締化咯燒酬化30)30g、聚賴氨酸30g、酶解 明膠20g、乳蛋白水解物60g、谷氨酷胺10g、L-精氨酸5g、甘油40ml、蘆布若爾30g加入去離 子水中并定容到1000ml，制得耐熱保護劑2,除菌備用。
[0021 ]輔助培養(yǎng)液為含有水解乳蛋白、精氨酸和谷氨酷胺的水溶液，水解乳蛋白、精氨酸 和谷氨酷胺的含量(m: V)依次為50~150g/L、0.70~2. lOg/L和1~3g/L。
[0022] 實施例2雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備 雞馬立克氏病火雞瘤疹病毒(FC126株)毒種購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0023] (1)細胞制備 將10日齡SPF雞胚放入2000ml螺口瓶（30胚/瓶），加入濃度為2%(m: V)的抓TA-膜酶 45ml，在4°C的條件下消化SPF雞胚16小時，紗布過濾，濾液經(jīng)1500巧m離屯、10分鐘，棄上清。 向沉淀中加入60ml細胞生長液制得細胞懸液，并進行細胞計數(shù)。用細胞生長液將細胞密度 調(diào)整至150萬個/ml,接入細胞培養(yǎng)瓶，36~37°C培養(yǎng)24小時，長成致密的細胞單層。本次試 驗消化獲得纖維細胞的活細胞數(shù)為3 X IO8個/胚，約為常規(guī)方法的2倍。
[0024] (2)接毒 按體積百分含量(V: V)2%接種雞馬立克氏病病毒于細胞培養(yǎng)液中，然后加入輔助培養(yǎng) 液，輔助培養(yǎng)液的加入量為細胞培養(yǎng)液體積百分含量10%(V:V)，并按100萬個/毫升復種雞 胚成纖維細胞，36~37°C繼續(xù)培養(yǎng)。輔助培養(yǎng)液為含有水解乳蛋白、精氨酸和谷氨酷胺的水 溶液，濃度依次為50g/L、0.70g/L和3g/L。
[0025] (3)收獲與凍干 培養(yǎng)至72小時，細胞病變達80%時收獲，棄去90%細胞培養(yǎng)液，轉動細胞培養(yǎng)瓶，使細胞 全部脫離瓶壁，將細胞收集于離屯、瓶中，20(K)rpm離屯、10分鐘，取沉淀細胞，并稱重。按照每 克沉淀細胞中加入200ml耐熱保護劑的量，分別加入上述制備好的耐熱保護劑1和耐熱保護 劑2，然后進行勻漿和超聲波裂解，最后將裂解的細胞液進行定量分裝和冷凍真空干燥，審U 成雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗1和雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗2。
[0026] 按照農(nóng)業(yè)部297號公告（雞馬立克氏病火雞瘤疹病毒耐熱保護劑活疫苗制造及檢 驗試行規(guī)程、同類耐熱苗行業(yè)標準)方法制備同類耐熱苗作為對照1;按照《中華人民共和國 獸用生物制品規(guī)程》(2000版XW下簡稱"規(guī)程"）方法制備常規(guī)苗作為對照2。
[0027] (4)疫苗穩(wěn)定性測定 ① 檢測冷藏保存的穩(wěn)定性:于凍干前、凍干后2~8°C放置0、6、12、24和36個月時隨機取 樣測定病毒含量，3瓶/次。結果見表2 ② 檢測37°C保存的穩(wěn)定性:每批取20瓶，于37°C放置0、5、10和15天時隨機取樣測定病 毒含量，3瓶/次。結果見表1、2 表1不同保存期雞馬立克氏病活疫苗病毒含量檢測結果(2~8°C) 單位:P即/羽
表2不同保存期雞馬立克氏病病毒含量檢測結果(37°C) 單位:P即/羽
由W上結果可W看出：采用本發(fā)明方法制備的兩組雞馬立克氏病活疫苗，在2~8°C條 件下保存36個月其病毒含量下降幅度不大，病毒含量遠高于"規(guī)程"標準中雞馬立克氏病活 疫苗病毒含量應含2000 PFU/羽的要求，保存期在36個月時疫苗中病毒存活率高達78%;對 照U同類耐熱苗)和對照2(常規(guī)苗)2~8°C條件下保存，病毒含量下降較快，對照1保存期為 24個月時病毒存活率僅為52%、對照2保存期僅為6個月，6個月的病毒存活率為67%。
[0028] 37°C條件下保存15天其病毒含量下降幅度不大，病毒含量遠高于"規(guī)程"規(guī)定，保 存期在15天時疫苗中病毒存活率高達79%;對照1(同類耐熱苗）、對照2(常規(guī)苗)37°C條件下 保存，病毒含量下降較快，對照1保存期為10天、對照2保存期不足5天。
[0029] 另外，本次制苗SPF胚用量30枚，制得1000羽/瓶的耐熱苗304瓶，凍干前8000PFU/ 羽，單胚可W生產(chǎn)病毒量為8.1 X IO7PFU,是常規(guī)方法的4~10倍(常規(guī)方法單胚生產(chǎn)病毒量 為 0.8 ~2.0Xl〇7pFU)。
【主權項】
1. 一種雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗，其特征在于，由雞馬立克氏病病毒與耐熱保 護劑混合凍干而成;所述耐熱保護劑是由以質量體積百分含量計的下列組分構成:蔗糖8~ 10%，聚乙烯吡咯烷酮2~4%，聚賴氨酸3~6%，酶解明膠1~2%，乳蛋白水解物2~6%，谷氨酰 胺0.4~1%，L一精氨酸0.05~0.5%，甘油1~4%，蘆布若爾2~5%，余量為水。2. -種根據(jù)權利要求1所述的雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟： a. 細胞制備：用EDTA-胰酶消化SPF雞胚成纖維細胞，并加入細胞生長液，在36~37°C 溫度下培養(yǎng)20~28小時，至生成細胞單層;所述EDTA-胰酶的濃度為質量體積百分含量為1% ~3%; b. 接毒:種入雞馬立克氏病病毒，加入細胞培養(yǎng)液體積10%的輔助培養(yǎng)液，按100~200 萬個/毫升復種雞胚成纖維細胞，36~37°C繼續(xù)培養(yǎng)2~4日； c .收獲與凍干:細胞病變達75%~85%時，棄去90%細胞培養(yǎng)液，轉動細胞培養(yǎng)瓶，使細 胞全部脫離瓶壁，收集、低速離心，取沉淀細胞并稱重，加入耐熱保護劑，進行勻漿和超聲波 裂解，定量分裝和冷凍真空干燥，制成雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗。3. 根據(jù)權利要求2所述的雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，其特征在于， 步驟a中EDTA-胰酶的消化溫度為2~8°C，消化時間為10~18小時。4. 根據(jù)權利要求3所述的雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，其特征在于，步 驟b中輔助培養(yǎng)液為含有水解乳蛋白、精氨酸和谷氨酰胺的水溶液。5. 根據(jù)權利要求4所述的雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗的制備方法，其特征在于，步 驟c中耐熱保護劑的加入量為每克沉淀細胞加入100~300ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗及其制備方法，屬于生物技術領域。本發(fā)明雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗由病毒液與耐熱保護劑混合凍干而成；其耐熱保護劑組方包括：蔗糖8～10%、聚乙烯吡咯烷酮2～4%、聚賴氨酸3～6%、酶解明膠1～2%、乳蛋白水解物2～6%、谷氨酰胺0.4～1%、L－精氨酸0.05～0.5%、甘油1～4%、蘆布若爾2～5%；本發(fā)明通過胰酶冷消化、接毒后添加輔助液提高生產(chǎn)效率、降低成本；通過添加耐熱保護劑，降低了病毒在冷凍和真空干燥過程中損傷，提高了產(chǎn)品在保存和使用中的穩(wěn)定性；本發(fā)明方法制備的雞馬立克氏病耐熱保護劑活疫苗，實現(xiàn)了儲運過程中冷藏保存，保存期延長到2～8℃保存36個月。
【IPC分類】A61K47/42, A61P35/00, A61K39/245, A61K47/32, A61K47/34
【公開號】CN105497888
【申請?zhí)枴緾N201511000683
【發(fā)明人】何平有, 韓佳麗, 鄒立宏, 馬明, 柳珊, 郁宏偉, 劉濤, 梁武, 朱秀同, 楊保收
【申請人】瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月29日