一種大鼠原代肝細胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠原代肝細胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。目前肝衰竭治療手段中，生物人工肝系統(tǒng)是最佳的選擇。生物型人工肝是指將同種或異種動物的器官、組織和細胞等與特殊材料、裝置結(jié)合，構(gòu)成的人工肝支持系統(tǒng)，暫時替代肝臟功能，從而協(xié)助治療。
[0003]生物型人工肝包括以往的離體肝灌流、人-哺乳類動物交叉灌流等等，主要的決定修復體性質(zhì)的關(guān)鍵是其中采用的人工細胞的材料。但是，目前所構(gòu)建的各種細胞材料都有其各自的優(yōu)缺點。比如，動物源性肝細胞來源比較廣，可大量獲得，但是其帶有動物源性疾病，容易產(chǎn)生異種蛋白的免疫排斥和免疫致病。另一種能夠大量獲得的就是腫瘤來源的肝細胞系，其可大量增殖并規(guī)模培養(yǎng)，但具有腫瘤性狀，肝細胞的功能不如正常肝細胞，且有致瘤的風險。而相比上兩種，胎肝細胞雖較理想，且缺陷比較少，但本身來源受限，且培養(yǎng)和制備的過程中條件非常嚴格控制，制備難度高且產(chǎn)量也較少，不易大量獲得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種大鼠原代肝細胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，實現(xiàn)了體外肝細胞的大量培養(yǎng)。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0006]—種大鼠原代肝細胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0007]S1、將大鼠原代肝細胞上樣于微孔培養(yǎng)板，60g-260g離心3-1 Imin，去除微孔培養(yǎng)板表面多余細胞懸液后，置于肝細胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)；
[0008]S2、培養(yǎng)完成后，收集步驟SI所得的原代肝細胞用SV40Tag和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染所述原代細胞，獲得改造細胞；
[0009]S32、將所得的改造細胞置于肝細胞無血清培養(yǎng)基進行微載體懸浮培養(yǎng)；
[0010]所述肝細胞無血清培養(yǎng)液包括以下組分:
[0011]基礎(chǔ)培養(yǎng)基500mL、胰島素0.5?l.lyg/mL、亞砸酸鈉6?10yg/L、表皮生長因子5?110ng/mL、肝細胞生長因子5?110ng/mL、纖粘連蛋白0.3?1.3yg/mL、地塞米松0.3?10.3nmol/mL和奶薊草提取物50?110mg/L;
[0012]所述肝細胞無血清培養(yǎng)基包括以下組分:
[0013]01^1作12高糖培養(yǎng)基5001^、表皮再生絲素蛋白纖維0.05?0.5%、地塞米松0.1?1100nmol/mL、葛仙米提取物50?110mg/L、肝細胞生長因子10?25ng/mL、青鏈霉素50?100U/mL，胰高血糖素0.05?5yg/mL、海藻酸鈉5?10yg/L、去端肽膠原0.05?0.5%。
[0014]優(yōu)選地，所述表皮再生絲素蛋白纖維為混合有表皮生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白的再生絲素蛋白纖維構(gòu)成的具有三維交錯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征的纖維氈
[0015]優(yōu)選地，所述表皮再生絲素蛋白纖維內(nèi)表皮生長因子的含量為10?50ng/mL。
[0016]優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的質(zhì)量占所述再生絲素蛋白纖維總質(zhì)量的1.3Χ1(Γ3?4.3Χ1(Γ3%0
[0017]優(yōu)選地，所述的再生絲素蛋白纖維的直徑范圍為350nm?7μηι。
[0018]優(yōu)選地，所述原代肝細胞的培養(yǎng)時間為12_48h。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟S2按照SV40Tag與原代細胞數(shù)比為1x10—5?1x10—4yg/個的轉(zhuǎn)染量進行轉(zhuǎn)染;和/或按照所述人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶與原代細胞數(shù)比為1x10—5?1x10—Vg/個的轉(zhuǎn)染量進行轉(zhuǎn)染。
[0020]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0021 ]利用力學緊湊種植原代肝細胞，可以使肝細胞間排列緊湊，形成緊密接觸，肝細胞可以快速形成高密度培養(yǎng);采用無血清培養(yǎng)基配方，使其更適合肝細胞的生長及功能發(fā)揮，從而實現(xiàn)了體外肝細胞的大量培養(yǎng)。
【具體實施方式】
[0022]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0023]本具體實施中按照SV40Tag與原代細胞數(shù)比為1x10—5?1x10—4yg/個的轉(zhuǎn)染量進行轉(zhuǎn)染;和/或按照所述人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶與原代細胞數(shù)比為1x10—5?1x10—Vg/個的轉(zhuǎn)染量進行轉(zhuǎn)染，所使用的再生絲素蛋白纖維的直徑范圍為350nm?7μηι。
[0024]實施例1
[0025]S1、將大鼠原代肝細胞上樣于微孔培養(yǎng)板，60g離心llmin，去除微孔培養(yǎng)板表面多余細胞懸液后，置于肝細胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12h;
[0026]S2、培養(yǎng)完成后，收集步驟SI所得的原代肝細胞用SV40Tag和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染所述原代細胞，獲得改造細胞；
[0027]S32、將所得的改造細胞置于肝細胞無血清培養(yǎng)基進行微載體懸浮培養(yǎng)；
[0028]所述肝細胞無血清培養(yǎng)液包括以下組分:
[0029]基礎(chǔ)培養(yǎng)基500mL、胰島素0.5yg/mL、亞砸酸鈉6yg/L、表皮生長因子5ng/mL、肝細胞生長因子5ng/mL、纖粘連蛋白0.3yg/mL、地塞米松0.3nmol/mL和奶薊草提取物50mg/L;
[0030]所述肝細胞無血清培養(yǎng)基包括以下組分:
[0031]0腿1作12高糖培養(yǎng)基50011^、表皮再生絲素蛋白纖維0.05%、地塞米松0.1醒01/mL、葛仙米提取物50mg/L、肝細胞生長因子10ng/mL、青鏈霉素50U/mL，胰高血糖素0.05yg/mL、海藻酸鈉5yg/L、去端肽膠原0.05%，所述表皮再生絲素蛋白纖維為混合有表皮生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白的再生絲素蛋白纖維構(gòu)成的具有三維交錯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征的纖維氈;所述表皮再生絲素蛋白纖維內(nèi)表皮生長因子的含量為10ng/mL，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的質(zhì)量占所述再生絲素蛋白纖維總質(zhì)量的1.3Χ1(Γ3。
[0032]實施例2
[0033]S1、將大鼠原代肝細胞上樣于微孔培養(yǎng)板，260g離心3min，去除微孔培養(yǎng)板表面多余細胞懸液后，置于肝細胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h;
[0034]S2、培養(yǎng)完成后，收集步驟SI所得的原代肝細胞用SV40Tag和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染所述原代細胞，獲得改造細胞；