r>[0035]S32、將所得的改造細(xì)胞置于肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進行微載體懸浮培養(yǎng)；
[0036]所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包括以下組分:
[0037]基礎(chǔ)培養(yǎng)基500mL、胰島素1.lyg/mL、亞砸酸鈉10yg/L、表皮生長因子110ng/mL、肝細(xì)胞生長因子110ng/mL、纖粘連蛋白1.3yg/mL、地塞米松10.3nmol/mL和奶薊草提取物110mg/L；
[0038]所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包括以下組分:
[0039]DMEM/F12高糖培養(yǎng)基500mL、表皮再生絲素蛋白纖維0.5%、地塞米松IlOOnmol/mL、葛仙米提取物110mg/L、肝細(xì)胞生長因子25ng/mL、青鏈霉素100U/mL，胰高血糖素5yg/mL、海藻酸鈉lOyg/L、去端肽膠原0.5%，所述表皮再生絲素蛋白纖維為混合有表皮生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白的再生絲素蛋白纖維構(gòu)成的具有三維交錯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征的纖維氈;所述表皮再生絲素蛋白纖維內(nèi)表皮生長因子的含量為50ng/mL，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的質(zhì)量占所述再生絲素蛋白纖維總質(zhì)量的4.3 X 1(Γ3 %。
[0040]實施例3
[0041]S1、將大鼠原代肝細(xì)胞上樣于微孔培養(yǎng)板，160g離心7min，去除微孔培養(yǎng)板表面多余細(xì)胞懸液后，置于肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)30h;
[0042]S2、培養(yǎng)完成后，收集步驟SI所得的原代肝細(xì)胞用SV40Tag和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染所述原代細(xì)胞，獲得改造細(xì)胞；
[0043]S32、將所得的改造細(xì)胞置于肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進行微載體懸浮培養(yǎng)；
[0044]所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包括以下組分:
[0045]基礎(chǔ)培養(yǎng)基500mL、胰島素0.8yg/mL、亞砸酸鈉8yg/L、表皮生長因子57.5ng/mL、肝細(xì)胞生長因子57.5ng/mL、纖粘連蛋白0.8yg/mL、地塞米松5.3nmol/mL和奶薊草提取物80mg/L；
[0046]所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包括以下組分:
[0047]DMEM/F12高糖培養(yǎng)基500mL、表皮再生絲素蛋白纖維0.275 %、地塞米松550.05nmol/mL、葛仙米提取物80mg/L、肝細(xì)胞生長因子17.5ng/mL、青鏈霉素75U/mL，胰高血糖素2.525yg/mL、海藻酸鈉7.5yg/L、去端肽膠原0.275%,所述表皮再生絲素蛋白纖維為混合有表皮生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白的再生絲素蛋白纖維構(gòu)成的具有三維交錯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征的纖維氈;所述表皮再生絲素蛋白纖維內(nèi)表皮生長因子的含量為30ng/mL，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的質(zhì)量占所述再生絲素蛋白纖維總質(zhì)量的2.8Χ1(Γ3%。
[0048]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，其特征在于穩(wěn)定增殖的同時保持肝細(xì)胞的特性，包括如下步驟: 51、將大鼠原代肝細(xì)胞上樣于微孔培養(yǎng)板，60g-260g離心3-1Imin，去除微孔培養(yǎng)板表面多余細(xì)胞懸液后，置于肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)； 52、培養(yǎng)完成后，收集步驟SI所得的原代肝細(xì)胞用SV40Tag和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染所述原代細(xì)胞，獲得改造細(xì)胞； S32、將所得的改造細(xì)胞置于肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進行微載體懸浮培養(yǎng)； 所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包括以下組分: 基礎(chǔ)培養(yǎng)基500mL、胰島素0.5?l.lyg/mL、亞砸酸鈉6?10yg/L、表皮生長因子5?110ng/mL、肝細(xì)胞生長因子5?110ng/mL、纖粘連蛋白0.3?1.3yg/mL、地塞米松0.3?10.3nmol/mL和奶薊草提取物50?110mg/L; 所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包括以下組分: 01^1鄺12高糖培養(yǎng)基50011^、表皮再生絲素蛋白纖維0.05?0.5%、地塞米松0.1?1100nmol/mL、葛仙米提取物50?110mg/L、肝細(xì)胞生長因子10?25ng/mL、青鏈霉素50?100U/mL，胰高血糖素0.05?5yg/mL、海藻酸鈉5?10yg/L、去端肽膠原0.05?0.5%。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述表皮再生絲素蛋白纖維為混合有表皮生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白的再生絲素蛋白纖維構(gòu)成的具有三維交錯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征的纖維氈。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述表皮再生絲素蛋白纖維內(nèi)表皮生長因子的含量為10?50ng/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的質(zhì)量占所述再生絲素蛋白纖維總質(zhì)量的1.3Χ1(Γ3?4.3X 1(Γ3%。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的再生絲素蛋白纖維的直徑范圍為350nm?7μηι。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)時間為12-48h。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S2按照SV40Tag與原代細(xì)胞數(shù)比為I X 10—5?I X 10—4yg/個的轉(zhuǎn)染量進行轉(zhuǎn)染;和/或按照所述人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶與原代細(xì)胞數(shù)比為I X 10—5?I X 10—Vg/個的轉(zhuǎn)染量進行轉(zhuǎn)染。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大鼠原代肝細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)方法，包括如下步驟：將大鼠原代肝細(xì)胞上樣于微孔培養(yǎng)板，離心后置于肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)；培養(yǎng)完成后，收集原代肝細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染成改造細(xì)胞置于肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進行微載體懸浮培養(yǎng)；所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素、亞硒酸鈉、表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、纖粘連蛋白、地塞米松和奶薊草提取物；所述肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包括高糖培養(yǎng)基、表皮再生絲素蛋白纖維、地塞米松、葛仙米提取物等。本發(fā)明利用力學(xué)緊湊種植原代肝細(xì)胞，可以使肝細(xì)胞間排列緊湊，形成緊密接觸，肝細(xì)胞可以快速形成高密度培養(yǎng)；采用無血清培養(yǎng)基配方，使其更適合肝細(xì)胞的生長及功能發(fā)揮，從而實現(xiàn)了體外肝細(xì)胞的大量培養(yǎng)。
【IPC分類】C12N5/10, C12N5/071
【公開號】CN105505883
【申請?zhí)枴緾N201610038988
【發(fā)明人】楊獻光, 王棋文, 靳偉, 常翠芳, 朱琳, 和春翠
【申請人】河南師范大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月12日