HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原特異性CTL的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術開發(fā)與應用研究領域，設及HLA-A0201限制性抗化r2-neu抗 原特異性CTL制備方法。
【背景技術】
[0002] -、腫瘤治療的困境與機會
[0003] 惡性腫瘤已成為人類第一號"殺手"，手術、放療與化療是治療腫瘤的Ξ大常規(guī)方 法，能在短期內有效的減輕腫瘤負荷，但仍不能有效清除腫瘤細胞。微小殘留病灶、對放療、 化療的部分敏感和耐藥是腫瘤復發(fā)及轉移的根源，而復發(fā)與轉移正是腫瘤患者死亡的主要 原因。常規(guī)治療方法已力不從屯、，開發(fā)新型的腫瘤治療技術與產品迫在眉睫。
[0004] 二、細胞免疫治療技術的誕生與發(fā)展
[0005] 上世紀80年代起免疫學與腫瘤學的迅速發(fā)展，1982年美國NIH Rosenberg教授為 首的研究小組研制出淋己因子活化的殺傷細胞(LAK)免疫療法，并在后續(xù)研究中對LAK細胞 的臨床應用進行了深入的探討。但是LAK細胞殺傷力不夠強，臨床應用需要大量輸注（3 X l〇iwi)，另一方面擴增能力有限，需要在輸注細胞的同時大劑量應用白細胞介素-2(化-2) (10萬IU/kg，q她），因而產生了相關的不良反應。而后Rosenberg又提出了腫瘤浸潤淋己細 胞(TIL)，其殺瘤能力較LAK有了明顯提高，并且無需大劑量IL-2聯(lián)合應用，但細胞需要從腫 瘤組織中分離獲得，運極大限制其廣泛的臨床應用。在W上的工作基礎上，1991年Stanford 大學的Schmidt-Wolf等采用干擾素丫（IFN-丫）、IL-2和鼠抗人CD3單克隆抗體（Mouse anti-Human CD3mAb)共同誘導出了具有強大抗腫瘤活性的細胞群，命名為細胞因子誘導的 殺傷細胞(CIK)。
[0006] 樹突狀細胞（DCs)是迄今為止已知的體內功能最為強大的專職抗原遞呈細胞 (APC)，其表面存在豐富的抗原捕獲分子，抗原遞呈分子(MHC I類和MHCn類分子），免疫共 刺激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等）。經抗原刺激后的DC細胞向淋己結遷移，將其攜帶的抗 原信息傳遞給相應的T淋己細胞，啟動、激發(fā)CD4+/CD8巧細胞免疫應答，特異性地殺滅腫瘤 細胞。同時經抗原刺激后的DCs可分泌白細胞介素-8(比-8)、干擾素 a(IFN-a)、白細胞介素-12(化-12)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)等，增強機體非特異性免疫應答(天然免疫），故DC有"天 然免疫佐劑"的美稱，其發(fā)現(xiàn)者Ralph Steinman教授獲得2011年諾貝爾醫(yī)學獎。鑒于DC在機 體免疫防御系統(tǒng)中所處的中屯、地位，基于DC開發(fā)的抗腫瘤疫苗已使之成為最先進、最有希 望的腫瘤免疫治療技術之一，近年來國內外學者對其進行了廣泛的探索。1992年Stanford 醫(yī)學院的2位教授成立了世界上第一家WDC為基礎的腫瘤疫苗公司(〇611化6〇11，〔4)，該公司 的產品Provenge已于2010年4月29日獲得抑A批準上市。但是DC在體內的功能受到患者本身 免疫狀態(tài)，腫瘤微環(huán)境的影響，而腫瘤患者體內存在大量抑制因子，因此DC的體內效果并不 如體外效果理想。
[0007] 細胞毒性T淋己細胞(CTL)構建是近期興起的免疫治療技術，因其具有特異、直接 殺傷腫瘤祀細胞的能力，因此成為研究的熱點。
[000引 Ξ、化r2-neu在腫瘤免疫治療中的作用
[0009] 化r2-neu是一種原癌基因，編碼產物為18化D的跨膜糖蛋白pl85,主要包括胞外 區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)Ξ部分，其中胞外區(qū)富含半脫氨酸，含2個配體結合域;跨膜區(qū)起錯定作 用;胞內區(qū)具有內在酪氨酸激酶活性，且含自身酪氨酸憐酸化位點。Her2-neu原癌基因通過 擴增或轉錄異常而表達，也可通過基因突變被激活，與多種上皮細胞起源的腫瘤發(fā)生關系 密切。在多種惡性腫瘤組織中存在擴增和P185的高表達狀態(tài)。
[0010] 1998年美國抑A批準人源化的重組化r2單克隆抗體化rceptin應用于臨床，治療有 化r2-neu基因擴增和過表達的乳腺癌患者；2010年歐盟又批準化rceptin用于化r2陽性胃 癌患者的治療，同年10月，美國FDA也批準化rc ep t i η用于治療晚期胃癌。
[0011] 但化rceptin對于化r2-neu+++患者的臨床有效率只有20-30%左右，使用初期療 效良好，長期使用就會產生耐藥現(xiàn)象(抗體中和），且價格比較昂貴，一年的治療費用在30萬 左右。2003年美國FDA批準化r2-neu信號轉導抑制劑Iressa(吉非替尼）用于化r2高表達的 非小細胞肺癌患者。但腫瘤細胞存在多條信號通路的異常激活，因此限制了分子祀向藥物 的臨床療效。
[0012] 因此，開發(fā)新型針對化r2/neu祀點的藥物勢在必行。抗化r2/neu特異性CTL的開發(fā) 是一種發(fā)展方向。
[OOU] 四、CTL作用機理
[0014] 1、機體T細胞免疫反應過程
[001引機體存在龐大的T細胞庫，通過其表面表達不同的T細胞受體(TCR)特異識別不同 的外部抗原分子(細菌、病毒和腫瘤抗原多膚），被活化為具有殺滅祀細胞的CTL，清除細菌、 病毒的感染和腫瘤細胞，且能產生免疫記憶性CTL，防止細菌、病毒的再次入侵和腫瘤的復 發(fā)。
[0016] CTL免疫應答大致分四個階段：
[0017] (1)抗原識別:APC通過表面受體識別并捕獲抗原(細菌、病毒、腫瘤細胞）；
[0018] (2)抗原加工與遞呈：抗原經APC消化、裂解成多膚分子，后者與APC胞內豐富的 MHC-I類或Π 類分子結合分別形成MHC-I-多膚或MHC-II-多膚復合物，并被轉運至APC表面； [0019] (3)Τ細胞激活(雙信號學說）:APC與T細胞相遇，T細胞通過自身TCR識別APC遞呈的 MHC-I/II-多膚復合物，其中CD8巧細胞識別MHC-I-多膚復合物，CD4巧細胞識別Μ肥-II-多 膚復合物，Τ細胞接受了抗原的刺激信號（第一信號）加上免疫共刺激信號（第二信號)開始 活化，具有細胞毒性作用即CTl;
[0020] (4)祀細胞殺滅：活化CTL循環(huán)至抗原所在部位，通過CTL表面的TCR特異識別抗原 表達細胞后進行殺傷和清除。
[0021] 但，已發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內存在大量免疫抑制因子，影響CTL的有效活化和增殖，數(shù) 量甚少，不足W與迅速增殖的腫瘤抗衡。若能在體外制備大量抗原特異性CTL并回輸給患 者，可直接、快速殺傷腫瘤細胞起到治療作用，對常規(guī)治療無法清除的殘留腫瘤細胞進行殺 滅，將可W防止腫瘤的復發(fā)和轉移。
[0022] 2、CTL表型與功能差異
[0023] 根據(jù)CTL表面分子的表達種類可分為兩型：中央記憶型CTL(CTL-gm)和效應記憶型 CTL(CTL-em)〇
[0024] Klebanoff等研究發(fā)現(xiàn)：表型分析為CD3+CD45R0+CD6化+CCR7+的C化-CM具有更強的 抗腫瘤能力；Johnson等比較了 MART-1TCR基因修飾的CTL-?和CTL-EM，結果發(fā)現(xiàn)前者消退惡 性黑色素瘤細胞的能力是后者的10倍。Berger等研究結果還顯示CTLgm輸注后較表型為CD3 +CD45R0+CD62kCCR7-的CTL-EM在體內能存活更長的時間。
[0025] 3、CTL技術開發(fā)現(xiàn)狀
[0026] 綜合國內、國外CTL體外制備技術可歸類為Ξ種方法與來源：
[0027] (1)腫瘤浸潤淋己細胞(TIL)體外擴增法
[00%]從腫瘤患者腫瘤組織中分離TIL，加入白細胞介素-2(化-2)培養(yǎng)，克隆稀釋法篩選 腫瘤抗原陽性的T細胞克隆，再加入鼠抗人CD3單克隆抗體和IL-2進行擴增培養(yǎng)獲得。
[0029] Li等選擇HLA-A201陽性的IV期惡性黑色素瘤患者，將其腫瘤組織制備成單細胞懸 液后，加入比-2培養(yǎng)，5周后篩選擴增細胞中CD8巧+MART-1+的陽性T細胞克隆，再加入鼠抗 人CD3單克隆抗體和福照后的PBMC飼養(yǎng)細胞擴增培養(yǎng)，次日加入IL-2,再培養(yǎng)12天可獲得 CTLs，能對負載MART-1多膚的T2細胞株特異性識別和殺傷。
[0030] (2)TCR基因修飾法
[0031] TCR是T細胞識別抗原、介導免疫應答的關鍵分子，包括α、β、丫、δ四條鏈，由二硫鍵 連接成α/β和丫作兩種異二聚體，其中α/β巧細胞占外周血Τ細胞的90-95%，是主要的免疫 效應細胞。TCR基因修飾即通過外源質粒轉染自體Τ淋己細胞，導入能識別特異性抗原多膚 的TCR基因，挑選陽性克隆，在體外擴增培養(yǎng)獲得CTL。較為常用的質粒有逆轉錄病毒質粒或 慢病毒質粒。
[0032] Morgan等采用抗CD3+CD28+磁珠激活CD8巧細胞，應用慢病毒質粒轉染修飾MART-1 或gplOO特異性的TCR基因，采用鼠抗人CD3單克隆抗體和IL-2培養(yǎng)體系制備CTLs，在12天能 擴增培養(yǎng)至1〇 9個細胞，用于15例HLA-A化的黑色素瘤患者的治療，結果顯示有2例患者出現(xiàn) 了明顯的臨床療效，1例52歲男性患者的蔽窩轉移病灶消失，肝轉移病灶縮小了 89%，無病 生存期為21個月；1例30歲男性患者，肺部轉移病灶消失，無病生存期為20個月。
[0033] Perro等采用白細胞介素-15(IL-15)和白細胞介素-2UIL-21)細胞因子組合促進 TCR基因轉染非增殖的T細胞，可W維持T細胞高表達CD6化和CD28。
[0034] (3)體外抗原致敏法
[0035] 用人工APC(Artificial APC)，或抗原(蛋白質，多膚，或全細胞)體外反復刺激T細 胞，獲得抗原特異性CTL。
[0036] 浙江大學的發(fā)明專利（專利號:CN102168066A)體外誘導乙型肝炎病毒特異性細胞 毒性T淋己細胞的方法即采用該方法。將MHC-1-Ig和抗CD28mAb包被磁珠構建人工APC，抗原 表位膚負載APC后，體外致敏3-4周，再W磁珠吸附分離抗原特異性CTUTetramer染色鑒定。
[0037] 上述Ξ種方法的缺陷：
[003引 （l)TIL體外擴增法
[0039] ①需要獲得患者的新鮮腫瘤組織作為CTL來源，僅限于可手術的患者，且腫瘤組織 來源有限；
[0040] ②TIL分離，CTL克隆的獲取與鑒定方法復雜，腫瘤組織中各種細胞成分較多，較復 雜，分離細胞的時間長，一般都需要1個月W上；
[0041 ] ③TIL中混有CD4+CD25巧reg亞群，其會抑制CTL擴增效率；
[0042] ④由于體外分離擴增時間長，增加了污染的機會。
[0043] (2)TCR基因修飾法
[0044] ①外源性質粒(逆轉錄病毒或慢病毒等)的引入，給臨床應用帶來一定的風險；
[0045] ②內源性TCR干擾，導入的TCR基因可能并不能導入預期的位點，而與內源性的TCR 發(fā)生錯排，其能識別抗原不是預期設計的，且是未知的，存在很大的風險。
[0046] (3)體外人工APC負載抗原致敏法
[0047] ①引入外源物質:人工APC，制備的CTL是否有人工APC殘留仍是疑問；
[0048] ②人工APC體外致敏CTL的周期較長，需要3-4周，獲得CTL還需要擴增培養(yǎng)后才能 滿足臨床治療的需要，因此體外培養(yǎng)的周期長，污染的幾率較大。
[0049] 目前還沒