一種纖維素酶及其基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域和酶工程領域，具體涉及一種纖維素酶及編碼該酶的基 因，含有其編碼基因的重組載體、基因工程菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素是地球上非常豐富的可再生資源，在中國這樣的農業(yè)大國其來源廣泛，但 是目前的利用率卻十分低下。這主要是因為在自然條件下的纖維素資源常與木質素、半纖 維素等物質結合在一起，并且纖維素具有水不容性的高結晶構造，使得纖維素在自然條件 下難以被高效、迅速地分解。目前使用纖維素酶對其進行降解是一個切實可行并且有效的 方法，因此，如何開發(fā)新的能高效、充分利用纖維素的酶制劑是至關重要的。
[0003] 纖維素是一種大分子多糖，其結構只要是由D-葡萄糖以0 -1，4-糖苷鍵相聯(lián)結而 構成的具有復雜結構的結晶分子，分子量50000-2500000。其分子間存在氫鍵，通常情況下 比較穩(wěn)定，不溶于水及一般有機溶劑，是植物細胞壁的主要成分。在一定的條件下，纖維素 可與水發(fā)生水解反應，氧橋斷裂，同時水分子加入，纖維素由長鏈分子變?yōu)槎替湻肿樱敝?氧橋全部斷裂，最終產(chǎn)物是葡萄糖分子。
[0004] 纖維素酶是指能夠水解纖維素P-1，4-葡萄糖苷鍵，使得纖維素變成纖維二糖 和葡萄糖的一類酶系的總稱，根據(jù)對糖苷鍵不同的催化作用，可以分為外切葡聚糖苷酶 (1，4- 0 -D-glucanase或exo-1, 4- 0 -D-glucanase，EC3. 2. 1. 91，來自真菌的簡稱CBH，來 自細菌的簡稱Cex)，內切葡聚糖苷酶（1，4-0 -D-glueanase或endo-1, 4-0 -D-glueanase， EC3. 2. 1.4,CMC酶，來自真菌的簡稱EG，來自細菌的簡稱Cen)和(6-葡聚糖苷酶 (0 -1，4-glucosidase，EC3. 2. 1. 21，簡稱BG) 〇
[0005] 纖維素酶降解纖維素是酶的各組分之間協(xié)同作用的結果，目前主要有兩種觀 點：一種認為，首先由內切葡聚糖苷酶（EG)作用于纖維素分子內部的無定型區(qū)，隨機水解 0-1，4-糖苷鍵，將長的纖維素分子截短，產(chǎn)生大量不同長度的帶非還原性末端的小分子纖 維素，然后再由外切葡聚糖酶（CBH)由末端水解纖維二糖，每次切下1個纖維二糖分子，最 后由(6-葡聚糖苷酶（BG)將纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖水解為葡萄糖。另一種觀點則 認為首先是由CBH水解不溶性纖維素使其變?yōu)榭扇苄缘睦w維糊精和纖維二糖，然后由EG將 纖維糊精生產(chǎn)纖維二糖，再由BG將纖維二糖分解成兩個葡萄糖。
[0006] 在纖維素酶的研究中，對產(chǎn)纖維素酶菌株進行篩選是最常用的辦法，但是自然環(huán) 境中篩選得到的產(chǎn)纖維素酶菌株往往具有一些缺陷，如活性低，生產(chǎn)緩慢，培養(yǎng)基要求高 等。所以從細菌和真菌中克隆纖維素酶基因，然后在表達系統(tǒng)中進行異源表達構建能產(chǎn)生 高性能纖維素酶的工程菌是一個很好的方法。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術的不足，提供一種纖維素酶，編碼該酶的基因， 含有其編碼基因的重組載體、基因工程菌及其應用。
[0008] 本發(fā)明采用的技術方案如下： 本發(fā)明旨在提供一種從芽孢桿菌sp)(菌株保藏號：CGMCCNo. 5312)中分 離得到的纖維素酶基因CdJ(該菌株公開在申請?zhí)?01110435707. 1的專利中），該基因核 苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQIDNO:1所示，或與SEQIDNO:1互補的核苷酸序列， 該基因序列長度為1041bp(堿基），該基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0009] 本發(fā)明的核苷酸序列是DNA形式的，包括CDNA、基因組DNA或人工合成的DNA，可 以是單鏈的或是雙鏈的。由于核苷酸序列的特殊性，任何與SEQIDNO:1所示的核苷酸序 列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸變體，均在本發(fā)明的保護范圍之內。所 述多核苷酸變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列，可以使用本領域所 熟知的取代、缺失或插入變異來獲得。
[0010] 本發(fā)明中的纖維素酶基因編碼的氨基酸序列是具有SEQIDNO:2所示的氨基酸殘 基序列的多肽或蛋白質。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQIDNO:2所示氨基酸 序列的多肽片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物與SEQIDNO:2所示的 氨基酸殘基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白質，均在本發(fā)明的保護范圍之 內。這些方法包括氨基酸序列中氨基酸殘基的缺失、插入、化學修飾或替換，所述蛋白可以 是重組蛋白、天然蛋白或合成蛋白。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供一種含有纖維素酶基因的重組表達載體，是將SEQID NO:1所示基因直接與不同表達載體連接所構建的重組載體。
[0012] 本發(fā)明中，編碼纖維素酶的多核苷酸序列可以插入到載體中，以構成含有本發(fā)明 所述的重組載體。載體是指本領域所熟知的質粒、病毒或其他載體，建議優(yōu)選PET載體系列 及其他原核表達載體?？捎帽绢I域技術人員熟知的方法來構建含編碼纖維素酶的核苷酸序 列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技 術、體內重組技術等。所述編碼纖維素酶的核苷酸序列可以有效連接到表達載體中的適當 啟動子上，以指導mRNA的合成。這些啟動子的代表性例子有：大腸桿菌的Iac或trp啟動 子；A噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和 晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細 胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子 等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA 表達的順式作用因子，通常大約有10_300bp，作用于啟動子以增強基因的轉錄，如腺病毒增 強子。
[0013] 本發(fā)明中，編碼纖維素酶的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可以用本領域 的技術人員熟知的方法轉化或者導入到宿主細胞中，該細胞可以是細菌細胞、真菌細胞、植 物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的后代，代表性例子有：大腸桿菌；真菌細胞或酵母； 植物細胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細胞如CH0、COS或Bowes黑 色素瘤細胞等。
[0014] 本發(fā)明還涉及所述編碼基因在制備重組纖維素酶中的應用，通過常規(guī)的重組DNA 技術，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可以構建表達或生產(chǎn)重組的纖維素酶。一般來說可以通 過以下步驟實現(xiàn)：構建重組載體，轉化入宿主細胞構建重組細胞，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿 主細胞，從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，有很多突出效果。本發(fā)