甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從甜瓜葉片提取蔗糖磷酸合成酶以及測(cè)定其活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蔗糖磷酸合成酶是一種關(guān)鍵的蔗糖代謝酶，也是一種重要的光合酶，其活性與凈 光合速率呈正相關(guān)，因此研究該酶活性對(duì)于改善甜瓜光合作用具有重要意義。目前蔗糖磷 酸合成酶提取大部分采用的是G-25 Sephadex柱和透析袋，G-25 Sephadex柱價(jià)格昂貴，提 取成本較高，而透析袋價(jià)格較低，但操作繁雜，耗費(fèi)時(shí)間，且提取效率低；離心式去鹽柱價(jià)格 稍高，但具有可再生性，提取效率優(yōu)于透析袋和G-25 Sephadex柱。在酶活性測(cè)定方面，目 前存在的問(wèn)題是酶與底物反應(yīng)時(shí)間及溫度研究者較少關(guān)注，不同的材料其最佳反應(yīng)條件不 一，本發(fā)明優(yōu)化了甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶活性測(cè)定條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè) 定方法。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的 提取及活性測(cè)定方法，包括以下步驟：
[0005] (1)酶液提?。悍Q(chēng)取2g甜瓜新鮮葉片，放入預(yù)冷的研缽中，加IOmL提取緩沖液；加 入石英砂，冰浴下研磨，充分勻漿后，0~4°C條件下12000rpm離心20min，取上清液，去除初 提酶液中的鹽分，純化后的酶液可直接用于酶活性測(cè)定；
[0006] (2)酶活性測(cè)定：以0. 2mL酶液沸水浴IOmin為對(duì)照；取0. 2mL酶液加入反應(yīng) 底物；15~40°C條件下反應(yīng)3~30min;沸水浴lmin，用雙蒸水定容至lmL，加入0.ImL 2mol?L1NaOH,沸水浴lOmin，流水沖洗冷卻；向反應(yīng)液中加入3. 5mL30%HC1，ImL0. 1% 間苯二酸，搖勾后在80°C水浴鍋中水浴lOmin，流水冷卻后，480nm比色。
[0007] 作為優(yōu)選，步驟（1)中，提取緩沖液由以下組分組成：50mmol?L1HEPEStN-Q-羥 乙基）哌嗪-N' -2 橫酸]，Immol?L1EDTA.Na2，IOmmol?L1MgCl2, 2. 5mmol?L1DTT, IOmmol?L1抗壞血酸；且HEPES提取緩沖液的pH值為7. 5。
[0008] 作為優(yōu)選，步驟（1)中采用離心式去鹽柱去除初提酶液中的鹽分。
[0009] 作為優(yōu)選，步驟（2)中，反應(yīng)底物包含0.ImL50mmol?L-1果糖-6-磷酸，0.ImL 3Ommol?L1UDPG, 0.ImL10OmnioI?L1Tris, 0. 05mL10mmol?L1MgCl20
[0010] 作為優(yōu)選，步驟（2)中，甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶及反應(yīng)底物在30°C水浴中反應(yīng) 5min即可達(dá)到最高酶活性。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：
[0012] 能夠有效將初提取酶液中的鹽分、糖分、離子等小分子物質(zhì)除去，從而更能夠精確 地測(cè)定葉片中鹿糖磷酸合成酶的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0013]( -）實(shí)驗(yàn)方法
[0014] 1、供試材料：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所自主選育的甜瓜品種"早甜一號(hào)"，搜 集到的甜瓜變種"羊角蜜"、"S1"。
[0015] 2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0016] 甜瓜長(zhǎng)至三葉一心時(shí)取同一部位葉片，將葉片剪碎混勻，每份稱(chēng)取2g，迅速置于液 氮中速凍，然后保存在-80°C冰箱中備用。本試驗(yàn)分別采用離心式去鹽柱、G-25Sephadex 柱和透析袋提取蔗糖磷酸合成酶。每個(gè)處理3次重復(fù)。
[0017] 3、蔗糖磷酸合成酶的提取
[0018] 將待測(cè)樣品放入預(yù)冷的研缽中，加IOmL提取緩沖液（50mmol*L1HEPES,lmmol*L1E DTA.Na2,IOmmol?L1MgCl2, 2. 5mmol?L1DTT,IOmmol?L1抗壞血酸，pH7. 5);加入石英砂， 冰浴下研磨，充分勾衆(zhòng)后，0~4°C條件下12000rpm離心20min，取上清液，取0. 5mL上清液 慢慢滴入離心式去鹽柱（Spin-OUT?GT-1200)，收集到的酶液可直接用于酶活性測(cè)定。
[0019] 4、蔗糖磷酸合成酶活性的測(cè)定
[0020] 在 0? 35mL反應(yīng)液中（0?ImL50mmol?L1果糖-6-磷酸，0?ImL30mmol?L1UDPG, 0.ImL100mmo1?L1Tris, 0. 05mL10mmol.L1MgCl2)加入 0? 2mL酶液，30°C條件下反應(yīng) 5min 后，沸水浴lmin，用雙蒸水定容至lmL，加入0.ImL2mol?L1NaOH,沸水浴lOmin，流水沖洗 冷卻；向反應(yīng)液中加入3. 5mL30%HCl，ImL0. 1 %間苯二酸，搖勻后在80°C水浴鍋中水浴 lOmin，流水冷卻后，480nm比色。
[0021] (二）結(jié)果分析
[0022] 1、不同處理方法提取甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶活性比色值比較
[0023]表1
[0024]
[0025]由表1可知，甜瓜葉片采用不同的方法提取蔗糖磷酸合成酶，其提取效率差異較 大，離心式去鹽柱提取的酶液其比色值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于G-25Sephadex柱和透析袋，透析袋提取效 率最低。
[0026] 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法
[0027] (1)將分析純蔗糖在80°C下烘至恒重，精確稱(chēng)取蔗糖lg，加水溶解，定容到50mL， 即鹿糖的標(biāo)準(zhǔn)液（200yg?mL3。
[0028] (2)取7個(gè)試管編號(hào)，按照表2所示的量精確配制溶液
[0029] 表2標(biāo)準(zhǔn)曲線配制比較
[0030]
[0031] 各管溶液混勻后，沸水浴lOmin，流水沖洗冷卻；向反應(yīng)液中加入3. 5mL30%HC1， ImL0. 1 %間苯二酸，搖勾后在80°C水浴鍋中水浴lOmin，流水冷卻后，480nm比色。
[0032] 以含糖量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y =433. 5Xx+7. 999,R2= 0? 998)。
[0033] 3、酶活性計(jì)算
[0034] 酶活性（ymol?h1?g1FW)=[由比色值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蔗糖含量 (mg)]/342.3(蔗糖摩爾質(zhì)量）X酶提取液的總體積（mL)/[樣品鮮重（g)X反應(yīng)時(shí)所加的 酶液體積（mL)X反應(yīng)時(shí)間（h)。
[0035] 根據(jù)以上公式計(jì)算出相應(yīng)的酶活性，如表3所示。
[0036]表 3
[0037]
[0038] 本實(shí)施例的提取緩沖液沒(méi)有巰基乙醇等有毒或腐蝕性藥品，為保障科研人員身體 健康提供了條件。
[0039] 本實(shí)施例采用離心式去鹽柱可有效將初提取酶液中的鹽分、糖分、離子等小分子 物質(zhì)除去，從而更能夠精確地測(cè)定葉片中蔗糖磷酸合成酶的活性，且離心式去鹽柱具有可 再生性，可大大降低科研成本。
[0040] 本實(shí)施例優(yōu)化了甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶與底物反應(yīng)條件，可真實(shí)反應(yīng)酶活性水 平，并縮短了酶活性測(cè)定的時(shí)間，提高了科研效率。
[0041] 以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明 的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法，包括以下步驟： (1) 酶液提取：稱(chēng)取2g甜瓜新鮮葉片，放入預(yù)冷的研缽中，加IOmL提取緩沖液；冰浴下 研磨，充分勾衆(zhòng)后，0~4°C條件下12000rpm離心20min，取上清液，去除初提酶液中的鹽分， 純化后的酶液可直接用于酶活性測(cè)定； (2) 酶活性測(cè)定：以0. 2mL酶液沸水浴IOmin為對(duì)照；取0. 2mL酶液加入反應(yīng)底 物，15~40 °C條件下反應(yīng)3~30min ;沸水浴lmin，用雙蒸水定容至ImL ;加入0.1 mL 2mol ? L 1NaOH,沸水浴lOmin，流水沖洗冷卻；向反應(yīng)液中加入3. 5mL 30% HC1，ImL 0. 1% 間苯二酸，搖勾后在80°C水浴鍋中水浴lOmin，流水冷卻后，480nm比色。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法，其特征 在于：步驟（1)中，所述提取緩沖液由以下組分組成 ：50mmol ? L 1HEPESm-O-羥乙基）哌 嗪-N' _2 橫酸]，Immol ? L 1EDTA. Na2，10mmol ? L 1MgCl2, 2. 5mmol ? L 1DTT, 10mmol ? L 1抗壞 血酸；且HEPES提取緩沖液的pH值為7. 5。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法，其特征在 于：步驟（1)中采用離心式去鹽柱去除初提酶液中的鹽分。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法，其 特征在于：步驟⑵中，所述反應(yīng)底物包含0.1 mL 50mmol ? L-1果糖-6-磷酸，0.1 mL 3Ommol ? L 1UDPG, 0.1 mL 10OmnioI ? L 1Tris, 0. 05mL10mmol ? L 1MgCl205. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法，其特征在 于：步驟（2)中，甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶及反應(yīng)底物在30°C水浴中反應(yīng)5min即可達(dá)到最 高酶活性。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法，包括以下步驟：(1)酶液提?。喝⌒迈r的甜瓜葉片迅速置于研缽中,用冰浴過(guò)的提取緩沖液研磨，充分勻漿后高速冷凍離心，取上清液用離心式去鹽柱脫鹽,提取的酶液可直接用于酶活性測(cè)定；(2)酶活性測(cè)定：取上述酶液加入反應(yīng)底物，給予不同的反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間，確定甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶最佳反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間，從而能更精確的反映酶的活性。本發(fā)明能夠有效將初提取酶液中的鹽分、糖分、離子等小分子物質(zhì)除去，并優(yōu)化了酶的反應(yīng)條件，從而能夠更精確地測(cè)定葉片中蔗糖磷酸合成酶的活性。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/48, C12N9/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105087514
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510570664
【發(fā)明人】田紅梅, 方凌, 嚴(yán)從生, 王朋成, 王艷, 張其安
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月9日