一種豬偽狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗組合物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬偽狂犬病病毒致弱方法、致弱的病毒株及利用該病毒株制備的 疫苗組合物，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae)a亞科中的豬 皰疹病毒I型（SuidherpesvirusIstrain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生 動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國(guó) 廣泛存在，危害嚴(yán)重，是制約規(guī)模化豬場(chǎng)生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死 胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強(qiáng)的泛嗜性、神經(jīng)嗜性及潛 伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可以長(zhǎng)期潛伏感染，當(dāng)潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒， 被潛伏感染的宿主就會(huì)發(fā)病。
[0003] 最近的研究報(bào)道稱豬偽狂犬病發(fā)生了新的特點(diǎn)，突出表現(xiàn)為任何年齡的豬都會(huì) 感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1~2天），發(fā)病率在10%~100 %之間，發(fā)病豬死 亡率在10 %~100%之間（仔豬死亡率可高達(dá)100% )，感染后可引起豬只高熱（40~ 42°C，持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽 搐，側(cè)臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕 母豬流產(chǎn)（高達(dá)35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥 狀?，F(xiàn)有技術(shù)的疫苗免疫豬只后不能完全抵抗野毒攻擊，依然會(huì)出現(xiàn)高熱，精神沉郁，食 欲下降或廢絕等癥狀，感染率超過(guò)80%，發(fā)病率超過(guò)30%，死亡率在10 %~20 %之間 (參見(jiàn)豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析.彭金美等.中國(guó)預(yù)防 獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013,35(1) :1-4;免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定.童武等.中 國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2013, 21 (3) : 1-7!PathogenicPseudorabiesVirus,China, 2012. Yuetal. ,EmerginginfectiousDiseases. 2014,20(I):102-104;Pseudorabiesvirus variantinBartha-K61-vaccinatedpigs,China,Anetal. ,Emerginginfectious Diseases. 2013. 19(11) :1749-1755,現(xiàn)有技術(shù)還沒(méi)有疫苗能夠解決針對(duì)豬偽狂犬變異株引 起的偽狂犬病。
[0004] 預(yù)防和控制豬偽狂犬變異株引起的偽狂犬病有效的方法是疫苗接種，開(kāi)發(fā)商品化 的疫苗可以是滅活疫苗，也可以是弱毒株制備的活疫苗。然而，滅活疫苗成本較高，活疫苗 一般是通過(guò)基因工程手段人工缺失毒力基因致弱毒株來(lái)制備的，存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞傳代方式，自然致弱毒株，使其完全在自然進(jìn)化 過(guò)程中發(fā)生變異，達(dá)到完全適應(yīng)自然環(huán)境條件，以保證該致弱毒株的穩(wěn)定性，不存在生物安 全方面的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 本發(fā)明的第一方面在于一種豬偽狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：（1)所 述豬偽狂犬病病毒的適應(yīng)培養(yǎng)步驟，將豬偽狂犬病病毒接種到哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞中，進(jìn)行 傳代培養(yǎng)至所述豬偽狂犬病病毒傳代5代以上，得到豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞適 應(yīng)株；以及（2)所述豬偽狂犬病病毒的致弱步驟，將所述步驟（1)的所述豬偽狂犬病病毒哺 乳動(dòng)物傳代細(xì)胞適應(yīng)株接種到禽源傳代細(xì)胞中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)至所述豬偽狂犬病病毒傳代 1代以上，得到所述的豬偽狂犬病病毒弱毒株。
[0007] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法中，所 述步驟（1)中的豬偽狂犬病病毒包括豬偽狂犬病病毒JS-2012株、豬偽狂犬HeNl株、 NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRVTJ株、豬偽狂犬病毒變異株 PRV-ZJ01、豬偽狂犬病毒變異株HN1201株、豬偽狂犬病毒變異株HN1202株、豬偽狂犬病病 毒Fa株。
[0008] 豬偽狂犬病病毒株JS-2012株公開(kāi)于免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定 [J].童武，張青占，鄭浩等，中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)2013, 21 (3):1-7);豬偽狂犬HeNl株，保 藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCCN0. 6656， 公開(kāi)于專利申請(qǐng)CN102994458A;NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公開(kāi)于 PathogenicPseudorabiesVirus,XiulingYu,ZhiZhou,DongmeiHu,etal.China, 2012 EmergingInfectiousDiseases,www.cdc.gov/eidol. 20,No.I,January2014；PRVTJ strain(PRVTJ)株，公開(kāi)于ChinaChun-HuaWangJinYuanI,Hua-YangQinl，etal,A novelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotection fromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61_vaccinated swinepopulationinChinaVaccine32(2014)3379 - 3385 中；豬偽狂犬病毒變異株 PRV-ZJ01，其保藏號(hào)為CGMCCNo. 8170公開(kāi)于CN103627678A;豬偽狂犬病毒HN1201株 (Pseudorabiesvirus,strainHN1201)保藏號(hào)為CCTCCNO.V201311 ;保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國(guó)武漢?武漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日；豬偽狂犬 病毒HN1202 株（Pseudorabiesvirus,strainHN1202)保藏號(hào)為CCTCCNO.V201335 ;保藏 于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國(guó)武漢?武漢大學(xué)，保藏日期為2013年8月26 日；豬偽狂犬病病毒Fa株公開(kāi)于偽狂犬病毒Fa株gB_gC_gD基因的克隆與序列分析[J]. 陳振海等，福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2007, 22 (2) :120-125。
[0009] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，步驟（1)所述的豬偽狂犬病病毒株為HN1201 株、HN1202 株、Fa株、PRV-ZJ01 株、HeNl株、JS-2012 株。
[0010] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法中，所 述步驟（1)中的所述哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞包括豬睪丸傳代細(xì)胞ST，豬腎傳代細(xì)胞PK15或 IBRS-2、兔腎傳代細(xì)胞RK、非洲綠猴腎傳代細(xì)胞vero、猴胚胎腎上皮傳代細(xì)胞Marc-145、 牛睪丸傳代細(xì)胞BT或乳倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞BHK-21 ;所述步驟（2)中所述的禽源傳代細(xì)胞為 DF-I0
[0011] 所述的哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞為豬睪丸傳代細(xì)胞ST(ATCC編號(hào)：CRL-1746)，豬腎傳代 細(xì)胞PK15(ATCC編號(hào)：CCL-33)或IBRS-2 (見(jiàn)例如，DECASTR0,M.P. 1964.Behavioroffoot andmouthdiseasevirusincellculturesusceptibilityoftheIB-RS_2swine cellline.ArquivosInstitute)Biologica31 :63_78)，兔腎傳代細(xì)胞RK(ATCC編 號(hào)：CCL-106)，非洲綠猴腎傳代細(xì)胞vero(ATCC編號(hào)：CCL-81)，猴胚胎腎上皮傳代細(xì)胞Marc-145 (ATCC編號(hào)：CRL-12219)，牛腎傳代細(xì)胞MDBK(ATCC編號(hào)：CCL-22)，牛睪丸傳代細(xì) 胞BT(ATCC編號(hào)：CRL-1390)，乳倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞BHK-21(ATCC編號(hào)：CCL-10)。
[0012] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，步驟（1)所述的哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞為豬睪丸傳 代細(xì)胞ST，豬腎傳代細(xì)胞PK15或猴胚胎腎上皮傳代細(xì)胞Marc-145;優(yōu)選地，步驟（2)所述 的禽源傳代細(xì)胞為DF-I(ATCC編號(hào)：CRL-12203)。
[0013] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法中，所述 步驟（1)的豬偽狂犬病病毒的適應(yīng)培養(yǎng)步驟包括：
[0014] 所述哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞經(jīng)胰酶進(jìn)行細(xì)胞分散消化，用細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成 傳代細(xì)胞單層；以及將所述豬偽狂犬病病毒接種至所述的傳代細(xì)胞單層，用細(xì)胞維持液繼 續(xù)培養(yǎng)；40h~48h后，當(dāng)細(xì)胞80%以上發(fā)生病變時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)病毒液作為繼續(xù)傳代用 毒種，進(jìn)行下一步的傳代，所述傳代傳至5代以上，得到豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞 適應(yīng)株。
[0015] 優(yōu)選地，步驟⑴豬偽狂犬病病毒在哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞進(jìn)行傳代的代數(shù)多5代。
[0016]優(yōu)選地，步驟（1)豬偽狂犬病病毒在哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞進(jìn)行傳代的代數(shù)為多18 代。
[0017] 優(yōu)選地，步驟（1)還包括如下步驟：
[0018] (Ia)接毒用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：所述傳代細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散消化，用細(xì)胞生長(zhǎng) 液繼續(xù)培養(yǎng)，形成傳代細(xì)胞單層；
[0019] (Ib)病毒的繁殖：將所述豬偽狂犬病病毒接種至所述步驟（Ia)中得到的傳代細(xì) 胞單層，用細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；40h~48h后，當(dāng)細(xì)胞80%以上發(fā)生病變時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng) 病毒液作為繼續(xù)傳代用毒種。
[0020] 優(yōu)選的，步驟（la)、（Ib)中的細(xì)胞培養(yǎng)所用的溫度為36°C~38°C。
[0021] 優(yōu)選的，步驟（Ib)中豬偽狂犬病病毒接種時(shí)的接種量為1%~2%體積百分比的 豬偽狂犬病病毒的維持液。
[0022] 優(yōu)選的，步驟（Ia)中的細(xì)胞生長(zhǎng)液含90%~97%體積百分比的細(xì)胞培養(yǎng)液和 3%~10%體積比的牛血清，所述細(xì)胞生長(zhǎng)液的pH值為7. 0~8. 0。
[0023] 優(yōu)選的，步驟（Ib)中的細(xì)胞維持液含95%~99%體積百分比的細(xì)胞培養(yǎng)液和 1%~5%體積比的牛血清，所述細(xì)胞維持液的pH值為7. 1~7. 5。
[0024] 其中所述的適合培養(yǎng)易增殖豬偽狂犬病病毒的傳代細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液包括但不 限于選自MEM培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、EMEM培養(yǎng)液、199培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液和a-MEM培養(yǎng)液 中的任意一種，所述的牛血清包括但不限于胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
[0025] 優(yōu)選的，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液，所述的牛血清為胎牛血清。
[0026] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法中，其中， 所述步驟（2)的所述豬偽狂犬病病毒的致弱步驟包括：
[0027] 所述禽源傳代細(xì)胞經(jīng)胰酶進(jìn)行細(xì)胞分散消化，用細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成傳代 細(xì)胞單層；以及將所述步驟（1)得到的所述豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞適應(yīng)株接種 至所述的禽源傳代細(xì)胞單層，用細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；40h~48h后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)病毒液， 即為豬偽狂犬病病毒弱毒株；或?qū)⑺鍪斋@的病毒液進(jìn)行下一步的傳代，所述傳代傳至1 代以上，得到所述的豬偽狂犬病病毒弱毒株。
[0028] 優(yōu)選地，步驟（2)豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)株在禽源傳代細(xì)胞進(jìn)行傳代 的代數(shù)多1代。
[0029] 優(yōu)選地，步驟（2)豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)株在禽源傳代細(xì)胞進(jìn)行傳代 的代數(shù)多3代。
[0030] 優(yōu)選地，步驟（2)豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)株繼續(xù)在禽源傳代細(xì)胞進(jìn)行 傳代的代數(shù)為3~110代。
[0031] 優(yōu)選地，步驟（2)還包括如下步驟：
[0032] (2a)接毒用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：所述傳代細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散消化，用細(xì)胞生長(zhǎng) 液繼續(xù)培養(yǎng)，形成傳代細(xì)胞單層；
[0033] (2b)病毒的繁殖：將所述步驟（1)得到的豬偽狂犬病病毒接種至所述步驟（2a) 中得到的傳代細(xì)胞單層，用細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；40h~48h后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)病毒液即為 豬偽狂犬病病毒弱毒株。
[0034]優(yōu)選的，步驟（2a)、（2b)中的細(xì)胞培養(yǎng)所用的溫度為36°C~38°C。
[0035] 優(yōu)選的，步驟（2b)中豬偽狂犬病病毒接種時(shí)的接種量為1%~2%體積百分比的 豬偽狂犬病病毒的維持液。
[0036] 優(yōu)選的，步驟（2a)中的細(xì)胞生長(zhǎng)液含90%~97%體積百分比的細(xì)胞培養(yǎng)液和 3%~10%體積比的牛血清，所述細(xì)胞生長(zhǎng)液的pH值為7. 0~8. 0。
[0037] 優(yōu)選的，步驟（2b)中的細(xì)胞維持液含95%~99%體積百分比的細(xì)胞培養(yǎng)液和 1%~5%體積比的牛血清，所述細(xì)胞維持液的pH值為7. 1~7. 5。
[0038] 其中所述的適合培養(yǎng)易增殖豬偽狂犬病毒的禽源傳代細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液包括但 不限于選自MEM培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、EMEM培養(yǎng)液、199培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液和a-MEM培養(yǎng) 液中的任意一種，所述的牛血清包括但不限于胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
[0039] 優(yōu)選的，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液，所述的牛血清為胎牛血清。
[0040] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法中， 所述步驟（1)中所述豬偽狂犬病病毒株在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上傳代培養(yǎng)代數(shù)為多18代；所述步 驟（2)中所述豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)株在禽源傳代細(xì)胞進(jìn)行傳代的代數(shù)為多3 代，
[0041] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法中， 所述步驟（1)中所述豬偽狂犬病病毒株在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上傳代培養(yǎng)代數(shù)為多18代，所述步 驟（2)中所述豬偽狂犬病病毒哺乳動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)株在禽源傳代細(xì)胞進(jìn)行傳代的代數(shù)為3~ 110 代。
[0042]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法中， 所述細(xì)胞生長(zhǎng)液含90%~97%體積百分比的細(xì)胞培養(yǎng)液和3%~10%體積比的牛血清， 所述細(xì)胞生長(zhǎng)液的pH值為7. 0~8. 0;所述細(xì)胞維持液含95%~99%體積百分比的細(xì)胞 培養(yǎng)液和1 %~5%體積比的牛血清，所述細(xì)胞維持液的pH值為7. 1~7. 5;所述細(xì)胞培養(yǎng) 液包括MEM培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、EMEM培養(yǎng)液、199培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液和a-MEM培養(yǎng)液， 所述的牛血清包括胎牛血清、新生牛血清或小牛血清；所述細(xì)胞培養(yǎng)所用的溫度為36°C~ 38。。。
[0043] 作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實(shí)施方式，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液，所述的牛 血清為胎牛血清；所述細(xì)胞培養(yǎng)所用的溫度為36°C~38°C。
[0044] 本發(fā)明的另一方面在于提供所述的豬偽狂犬病病毒的致弱方法致弱的豬偽狂犬 病病毒弱毒株，其中，所述豬偽狂犬病病毒弱毒株不能不能表達(dá)gl、gE、IlK和28K蛋白。
[0045] 優(yōu)選地，步驟（2