專利名稱：一種α-熊果苷生產(chǎn)過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種α -熊果苷生產(chǎn)過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法。
背景技術(shù)：
熊果苷是一種氫醌的葡萄糖苷衍生物，首次發(fā)現(xiàn)于熊果屬的植物葉子中。熊果苷具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎、抗菌等生理活性，因而被用作鎮(zhèn)咳藥物和尿道消毒劑等使用。更為重要的是，熊果苷能夠抑制酪氨酸酶的活性，從而遏制黑色素的生長，因此可以作為一種美白成分添加于化妝品中。熊果苷有兩種異構(gòu)體α-熊果苷和β_熊果苷。其中，α-熊果苷的結(jié)構(gòu)比β_熊果苷更穩(wěn)定，美白效果是β_熊果苷10倍以上，并且對表皮細胞的正常生長沒有影響，具有穩(wěn)定、有效、安全的特點，因此α-熊果苷是21世紀最有競爭力的美白添加劑之一。
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α -熊果苷與β -熊果苷的來源有所不同，β -熊果苷可以通過植物提取、植物細胞培養(yǎng)、有機合成以及糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)或逆水解反應(yīng)獲得。，而α -熊果苷一般只能通過微生物直接轉(zhuǎn)化或或微生物的酶催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)獲得。但通過微生物直接轉(zhuǎn)化制備熊果苷的產(chǎn)率較低，而糖苷酶的價格昂貴，只適于實驗室制備，都不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)α-熊果苷。因而較低成本的獲得高酶活的糖苷酶對于生產(chǎn)催化合成α-熊果苷十分必要。專利201110009399. 6公開了一株表達重組蔗糖磷酸化酶的大腸桿菌，利用該菌發(fā)酵可以生成高酶活的蔗糖磷酸化酶，并且利用該酶催化蔗糖和氫醌進行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)可以大量生產(chǎn)α-熊果苷，生產(chǎn)成本相對于直接利用糖苷酶低。此外由于整個酶催化反應(yīng)的條件溫和，反應(yīng)時間短，所以反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液中蔗糖磷酸化酶的酶活仍然較高。因此回收并重復(fù)利用蔗糖磷酸化酶，可以進一步降低生產(chǎn)成本。固定化蔗糖磷酸化酶可以重復(fù)利用，這可以在一定程度上降低酶的使用成成本較高。但整個酶的固定化成本也比較高,包括酶的分離純化成本及固定化成本。因此直接利用非固定的即游離的蔗糖磷酸化酶作為催化劑，可有效地省去酶的分離、純化、固定化等過程，大大降低酶的制備成本。在利用游離的蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷的過程中，能否實現(xiàn)非固定化蔗糖磷酸化酶的多次回收利用是降低酶成本的關(guān)鍵，也是游離蔗糖磷酸化酶能否應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)α-熊果苷的制約因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種α -熊果苷生產(chǎn)過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，有效地解決游離蔗糖磷酸化酶的回收利用，使得蔗糖磷酸化酶的使用成本顯著降低，對于游離蔗糖磷酸化酶應(yīng)用于酶催化領(lǐng)域有著重大的意義。本發(fā)明以蔗糖和氫醌為底物，利用游離蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化生產(chǎn)α -熊果苷，反應(yīng)結(jié)束后，利用膜分離方法進行游離蔗糖磷酸化酶的回收，再利用回收的蔗糖磷酸化酶進行下一批次的催化反應(yīng)。本發(fā)明中，利用游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化合成α -熊果苷可以采用現(xiàn)有技術(shù)公開的任一種技術(shù)方案，作為本發(fā)明的最佳實施方式，優(yōu)選合成過程為加入濃度為20-50% (w/v)的蔗糖，濃度為1-5% (w/v)的氫醌，酶活為100-300 U/mL的蔗糖磷酸化酶粗酶液，反應(yīng)PH為6-7，反應(yīng)溫度為20-40 0C，輕微攪拌，反應(yīng)20-30h后，氫醌的轉(zhuǎn)化率可達到90%，更優(yōu)選合成過程為將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為2% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)pH至6，反應(yīng)溫度為35 V,輕微攪拌，反應(yīng)24h。。上述合成反應(yīng)結(jié)束后，首先加入濃度為1%_10% (w/v)的穩(wěn)定添加劑，然后利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，再利用孔徑較小的超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收。該超濾回收過程中，α-熊果苷作為濾出液濾出，收集處理后可得合成產(chǎn)物α -熊果苷。本發(fā)明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，蔗糖磷酸化酶的回收率達到95%以上，回收的酶液中殘留的反應(yīng)物以及產(chǎn)物均小于5%。最后利用回收的蔗糖磷酸化酶進行下一批·次的催化合成α -熊果苷，除了不需要另外添加酶液以外，其他反應(yīng)條件與前一批次相同，這樣可以達到反復(fù)使用蔗糖磷酸化酶的目的。如此進行5個批次反應(yīng)后，回收的蔗糖磷酸化酶的活性還可以保持在初始酶活的85%以上。本發(fā)明所述蔗糖磷酸化酶為游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液，理論上所述的蔗糖磷酸化酶可以來源于多種菌株，為實現(xiàn)更好的回收效果，本發(fā)明優(yōu)先考慮大腸桿菌SP1515，該酶在催化反應(yīng)結(jié)束之后仍然具有較高的酶活力。本發(fā)明所述的添加劑為海藻糖、葡聚糖和/或甘露醇，所述添加劑的用量為反應(yīng)液的1%-10% (w/v)。優(yōu)選地,所述的添加劑為相當(dāng)于反應(yīng)液5% (w/v)的海藻糖、葡聚糖或甘露醇。更優(yōu)選所述的添加劑為相當(dāng)于反應(yīng)液5% (w/v)的海藻糖。本發(fā)明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，特別的使用了添加劑來增強蔗糖磷酸化酶的穩(wěn)定性，使得回收過程中蔗糖磷酸化酶的酶活損失較少。本發(fā)明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，所述陶瓷膜的孔徑為O. 1-0. 15Mffl，優(yōu)選為 O. 12Mm。本發(fā)明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，所述超濾膜為醋酸纖維膜、混合纖維膜或聚砜膜，優(yōu)選醋酸纖維膜膜，所述超濾膜的截留分子量為2000-10000Da，優(yōu)選為5000Dao采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次提出利用膜回收游離蔗糖磷酸化酶，有效地解決游離蔗糖磷酸化酶的回收利用。并通過加入添加劑，增加回收過程中酶的穩(wěn)定性，提高了酶活的回收率。此外先利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，然后再利用孔徑較小的超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收，對于降低膜污染，延長膜的使用壽命，降低生產(chǎn)成本等都具有重大意義，從而使得游離蔗糖磷酸化酶在酶催化領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步描述。
實施例I :
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 6% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)PH至6，反應(yīng)溫度為25 °C，輕微攪拌，反應(yīng)24h。在此反應(yīng)條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率可達到90%。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入相當(dāng)于反應(yīng)液5% (w/v)的海藻糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為5000Da的醋酸纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到97%，回收的酶液中殘留的反應(yīng)物以及產(chǎn)物均小于5%。實施例2
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 6% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)PH至6，反應(yīng)溫度為25 °C，輕微攪拌，反應(yīng)24h。在此反應(yīng)條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率可達到90%。
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反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入相當(dāng)于反應(yīng)液5% (w/v)的海藻糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. IMffl的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為2000Da的醋酸纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到93%，回收的酶液中殘留的反應(yīng)物以及產(chǎn)物均小于5%。實施例3
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 8% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)PH至6，反應(yīng)溫度為30 °C，輕微攪拌，反應(yīng)24h。在此反應(yīng)條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率可達到85%。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入相當(dāng)于反應(yīng)液5% (w/v)的葡聚糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為5000Da的混合纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到90%，回收的酶液中殘留的反應(yīng)物以及產(chǎn)物均小于5%。實施例4
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 8% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)PH至6，反應(yīng)溫度為30 °C，輕微攪拌，反應(yīng)24h。在此反應(yīng)條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率可達到85%。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入相當(dāng)于反應(yīng)液3% (w/v)的葡聚糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. IMffl的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為IOOOODa的混合纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到86%，回收的酶液中殘留的反應(yīng)物以及產(chǎn)物均小于5%。實施例5
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為2% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)PH至6，反應(yīng)溫度為35 °C，輕微攪拌，反應(yīng)24h。在此反應(yīng)條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率可達到81%。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入相當(dāng)于反應(yīng)液5% (w/v)的甘露醇并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為5000Da的聚砜膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到88%，回收的酶液中殘留的反應(yīng)物以及產(chǎn)物均小于5%。實施例6
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為2% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)PH至6，反應(yīng)溫度為35 °C，輕微攪拌，反應(yīng)24h。在此反應(yīng)條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率可達到81%。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入相當(dāng)于反應(yīng)液3% (w/v)的甘露醇并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為2000Da的聚砜膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到84%，回收的酶液中殘留的反應(yīng)物以及產(chǎn)物均小于5%。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明具體實施方式
及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種α-熊果苷生產(chǎn)過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，以蔗糖和氫醌為底物，利用游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化合成α-熊果苷，其特征在于合成反應(yīng)結(jié)束后，首先向除去α-熊果苷的反應(yīng)液中加入添加劑以增加蔗糖磷酸化酶的穩(wěn)定性，然后利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及大分子蛋白，再利用超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶來源于大腸桿菌spl515。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加劑為海 藻糖、葡聚糖或甘露醇，所述添加劑的用量為反應(yīng)液質(zhì)量體積比的1%-10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加劑為相當(dāng)于反應(yīng)液質(zhì)量體積比5%的海藻糖、葡聚糖或甘露醇，并攪拌均勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加劑為相當(dāng)于反應(yīng)液質(zhì)量體積比5%的海藻糖，并攪拌均勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔徑為 O. 1-0. 2Mflio
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔徑為 O. 15Mm。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超濾膜為醋酸纖維膜、混合纖維膜或聚砜膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超濾膜為醋酸纖維膜。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超濾膜的截留分子量為2000-10000Da。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種α-熊果苷生產(chǎn)過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，所述α-熊果苷生產(chǎn)過程以蔗糖和氫醌為底物，利用游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化合成α-熊果苷。反應(yīng)結(jié)束后，首先向反應(yīng)液中加入一定濃度的添加劑以提高其穩(wěn)定性，然后利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質(zhì)以及一些大分子蛋白，再利用孔徑較小的超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收，最后利用回收的蔗糖磷酸化酶進行下一批次的催化反應(yīng)。反復(fù)操作，達到重復(fù)利用蔗糖磷酸化酶的目的。本發(fā)明首次提出蔗糖磷酸化酶的回收利用，并且該方法對于降低膜污染，延長膜的使用壽命，降低生產(chǎn)成本等都具有重大意義，從而使得游離蔗糖磷酸化酶在酶催化領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/10GK102925418SQ20121047470
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者姜岷, 萬月佳, 賀愛永, 馬江鋒, 張敏, 陳可泉, 韋萍, 歐陽平凱 申請人:南京工業(yè)大學(xué)