一種編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其應(yīng)用，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1，其編碼的蛋白含有529個(gè)氨基酸，氨基酸序列為SEQ ID NO.2，預(yù)測蛋白分子量為58.8kDa。本發(fā)明通過對編碼巖藻多糖水解酶的基因GenBank No：AJ877239進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后共有1599bp個(gè)堿基，載入克隆載體為pET28a中，使優(yōu)化的巖藻多糖水解酶的基因可以在大腸桿菌BL21中表達(dá)，獲得了一種能夠高效，專一水解巖藻多糖的糖苷水解酶，為巖藻多糖水解提供了一種生物降解酶。
【專利說明】
一種編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其應(yīng)用，屬于分子生物 學(xué)、基因工程、糖化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 巖藻多糖是一種獨(dú)特的結(jié)合有硫酸基團(tuán)的水溶性多糖，多存在于褐藻及海洋無脊 椎動物中，由硫酸基巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、糖醛酸等單糖組成。其多糖結(jié)構(gòu) 主要包括兩種主鏈類型：I由（1-3)連接的a-L-巖藻糖殘基構(gòu)成；II由包含交替的（1-3)， (1-4)-連接的a-L_巖澡糖殘基構(gòu)成。
[0003] 巖藻多糖作為一種廣泛純在于褐藻中的生物多糖，其生物學(xué)活性越來越被廣大研 究人員關(guān)注，各種生物學(xué)活性，陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖具有抗凝血、抗腫瘤、抗 炎等生物活性（Holtkamp，A.D.，et al.，Appl .Microbiol .Biotechnol. ,2009,82,1-11)。
[0004] 巖藻多糖由于分量大，不易吸收，制約了巖藻多糖的廣泛應(yīng)用。而巖藻寡糖分子由 于具有分子量小、易吸收、水溶性好、生物活性多樣等特點(diǎn)，日益受到人們的關(guān)注 (Hoitkamp，A.D?，et al ?，Appl .Microbiol .Biotechnol ?，2009,82，1-11。所以巖藻寡糖的 制備成為巖藻多糖利用的關(guān)鍵技術(shù)。
[0005] 目前寡糖的制備方法主要有化學(xué)法、物理法及生物降解法?；瘜W(xué)法主要包括酸解 法和氧化法，其中酸解法是企業(yè)生產(chǎn)寡糖采用的主要方法，具有速度快、技術(shù)簡單的特點(diǎn)， 但是需要劇烈的反應(yīng)條件(強(qiáng)酸以及加熱回流），因此該方法具有產(chǎn)物分子量分布寬泛、質(zhì) 量不可控、生產(chǎn)成本高、對環(huán)境污染大等缺點(diǎn)。氧化法主要是利用H 202等強(qiáng)氧化劑降解多糖， 同樣存在著產(chǎn)物分子量分布寬泛、質(zhì)量不可控、環(huán)境污染大等問題。物理法主要是利用微波 等方法降解多糖，不過目前還在實(shí)驗(yàn)階段，并未廣泛應(yīng)用。生物降解法主要是利用專一性的 糖苷水解酶水解多糖，該方法具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品均一度高、產(chǎn)品質(zhì)量可控、成本低、環(huán) 境污染低等優(yōu)點(diǎn)。因此，該方法越來越受到人們重視。但是，生物降解法需要使用高效、專一 的糖苷水解酶。目前針對巖藻多糖水解酶研究的報(bào)道還比較少，市場上還未見利用生物法 制備的巖藻寡糖產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列，及其該核苷酸 序列表達(dá)的巖藻多糖水解酶在制備巖藻寡糖方面的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 巖藻多糖水解酶表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0008] 參照編碼巖藻多糖水解酶的基因(GenBank N〇:AJ877239)，通過密碼子優(yōu)化，委托 生物工程(上海)股份有限公司合成了截?cái)嗟膸r藻多糖水解酶基因，共有1599bp個(gè)堿基，核 甘酸序列為SEQ ID NO. 1，克隆載體為pET28a，結(jié)構(gòu)如圖1所示，克隆位點(diǎn)為Ndel和Xhol，載 體抗性為卡那霉素(Kan)，優(yōu)化物種為E.coli。對攜帶表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Fuc的大腸桿菌進(jìn)行 培養(yǎng)，使用Plasmid Mini Kit I試劑盒提取質(zhì)粒，然后將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌 BL21 (DE3)中，獲得重組菌株。
[0009] 本發(fā)明中，核苷酸SEQ ID NO. 1編碼的蛋白含有529個(gè)氨基酸，氨基酸序列為SEQ ID N0.2,預(yù)測蛋白分子量為58.8kDa。
[0010] 巖藻多糖水解酶在重組菌種中的表達(dá)
[0011] (1)配制含有Kan抗性的LB培養(yǎng)基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化 鈉，120°C滅菌20min，冷卻到室溫加入Kan使其終濃度50ug/ml。
[0012] ⑵將上述得到重組菌株，接種到含有Kan抗性的固體LB培養(yǎng)基上，37 °C過夜培養(yǎng)， 挑取單菌落接種到5ml含有Kan抗性的液體LB培養(yǎng)中，37°C，200rmp搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，將上 述菌液接種到500ml含有Kan抗性的液體LB培養(yǎng)中，37°C、200rmp床培養(yǎng)至0D6Q()nm = 0.6時(shí)， 加入0.5mM IPTG，16°C、200rmp誘導(dǎo)表達(dá)24小時(shí)，5000rmp離心，收集菌體。
[0013] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過對巖藻多糖糖苷水解基因進(jìn)行序列優(yōu)化，使其 可以在大腸桿菌BL21中表達(dá)，獲得了一種能夠高效，專一水解巖藻多糖的糖苷水解酶，為巖 藻多糖水解提供了一種生物降解酶。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明巖藻多糖水解酶的表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；
[0015] 圖2為本發(fā)明表達(dá)巖藻多糖水解酶鎳柱純化的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為marker; 1 為上清；2 為穿透；3 為BufferA;4為BufferA+20mM 咪唑；5 為BufferA+20mM 咪唑；6 為BufferA +60mM 咪唑；7 為BufferA+60mM 咪唑；8 為BufferA+lOOmM 咪唑；9 為BufferA+lOOmM 咪唑；10 為 BufferA+160mM 咪唑；11為BufferA+160mM 咪唑；12 為BufferA+500mM 咪唑；
[0016]圖3為本發(fā)明表達(dá)巖藻多糖水解酶的Western Blot檢測結(jié)果，其中，100、75、50、 37、25的單位是1(0&;
[0017] 圖4為本發(fā)明巖藻多糖水解酶降解產(chǎn)物的HPLC檢測結(jié)果，其中，1為巖藻寡糖_1;2 為巖藻寡糖-2; 3為巖藻寡糖-3; 4為巖藻寡糖-4; 5為巖藻寡糖-5; 6為巖藻寡糖-6; 7為巖藻 寡糖-7。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修 改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0019] 實(shí)施例1巖藻多糖水解酶在重組菌種中的表達(dá)
[0020] (1)配制含有Kan抗性的LB培養(yǎng)基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化 鈉，120°C滅菌20min，冷卻到室溫加入Kan使其終濃度50ug/ml。
[0021 ] (2)將上述得到重組菌株，接種到含有Kan抗性的固體LB培養(yǎng)基上，37 °C過夜培養(yǎng)， 挑取單菌落接種到5ml含有Kan抗性的液體LB培養(yǎng)中，37°C，200rmp搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，將上 述菌液接種到500ml含有Kan抗性的液體LB培養(yǎng)中，37°C、200rmp床培養(yǎng)至0D6Q()nm = 0.6時(shí)， 加入0.5mM IPTG，16°C、200rmp誘導(dǎo)表達(dá)24小時(shí)，5000rmp離心，收集菌體。
[0022 ]實(shí)施例2對表達(dá)的巖藻多糖水解酶的檢測
[0023] 將實(shí)施例 1 收集到菌體，懸浮到Buffer A(50mMTri-HCl+500mM NaCl，pH7.9)緩沖 溶液中進(jìn)行超聲破碎，12000rmp離心收集上清，進(jìn)行SDS-Page檢測，如圖2所示。預(yù)測蛋白分 子量為58.8kDa，然后進(jìn)行Western Blot檢測，如圖3所示。
[0024] 實(shí)施例3對表達(dá)的巖藻多糖水解酶的純化 [0025]使用鎳柱對上述蛋白進(jìn)行純化：
[0026] (1)以Buffer A(50mMTri-HCl+500mM NaCl，pH7.9)平衡柱子，流速lml/min;
[0027] (2)以Buffer A上樣，流速lml/min，收集穿透。
[0028] (3)以Buffer A洗脫，流速lml/min，洗脫30ml;
[0029] (4)依次使用含有2〇111]\1、6〇1111、10〇111]\1、16〇1111、50〇1111咪唑的81^€61八洗脫，流速11111/ min，每5min收集一管；
[0030] (5 )G250檢測每個(gè)收集組分中蛋白含量；
[0031] (6)選取每個(gè)咪唑濃度洗脫蛋白含量高的組、原液、上樣穿透、1 XBinding Buffer 洗脫，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，如圖2所示。
[0032]按照上述步驟獲得純化后的巖藻多糖糖苷水解酶蛋白，使用8000Da的蛋白濃縮管 進(jìn)行濃縮。
[0033]實(shí)施例4巖藻多糖水解酶水解巖藻多糖實(shí)驗(yàn) [0034](一)水解條件 [0035] 底物濃度:0.25%
[0036] 反應(yīng)buffer:Tris-HCl+0.05M CaCl2+0.3M NaCl，pH 7.5
[0037] 反應(yīng)體積：1ml
[0038] 酶濃度：l〇〇ul(1.52mg/ml)
[0039] 反應(yīng)溫度：30 °C
[0040] 反應(yīng)時(shí)間：24小時(shí)
[0041 ](二)對水解產(chǎn)物HPLC檢測
[0042]實(shí)驗(yàn)條件：
[0043] (1)儀器:華譜S6000液相色譜儀
[0044] (2)色譜柱:華譜XAmide分析色譜柱
[0045] (3)檢測器:蒸發(fā)光檢測
[0046] (4)色譜條件:如表1所示，其中，A:水;B:乙腈;C: 100mM甲酸銨
[0047] (5)上樣量:2〇ul
[0048] (6)檢測器條件:增益6
[0049]表 1
[0051]檢測結(jié)果如圖4所示，巖藻多糖水解酶水解巖藻多糖后獲得7個(gè)含有巖藻寡糖的組 分，命名為：1為巖藻寡糖-1; 2為巖藻寡糖-2; 3為巖藻寡糖-3; 4為巖藻寡糖-4; 5為巖藻寡 糖-5; 6為巖藻寡糖-6; 7為巖藻寡糖-7。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ ID Ν0·1〇2. 含有如權(quán)利要求1所述編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列的片段、質(zhì)?；蛘呔?株。3. 如權(quán)利要求1所述編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列編碼的蛋白。4. 如權(quán)利要求3所述蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。5. 如權(quán)利要求1所述編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列在制備巖藻多糖糖苷水解 酶中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求2所述含有編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列的片段、質(zhì)?；蛘呔?株在制備巖藻多糖糖苷水解酶中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求3所述編碼巖藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列編碼的蛋白在制備巖藻多 糖糖苷水解酶中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求4所述氨基酸序列SEQ ID NO.2在制備巖藻多糖糖苷水解酶中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/24GK105821061SQ201610187324
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】林成彬, 李建軍, 任立世, 王斌, 惠鋒基
【申請人】山東潔晶集團(tuán)股份有限公司