(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株產(chǎn)腈水解酶的菌株，及其在生物催化α-氨基腈底物(2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈)制備作為l-草銨膦重要手性前體的l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

腈水解酶(nitrilase，ec3.5.5.1)能將腈類化合物中的氰基直接轉(zhuǎn)化為羧基制備羧酸，它對(duì)腈化合物具有獨(dú)特的化學(xué)選擇性、立體選擇性和區(qū)域選擇性，可以用于合成多種化學(xué)法合成效率低下或難以合成的羧酸。其選擇性好，轉(zhuǎn)化率高，同時(shí)，該途徑與傳統(tǒng)工藝相比具有反應(yīng)條件溫和，無(wú)需高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿，污染較少，有著化學(xué)方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性，符合原子經(jīng)濟(jì)型和綠色化學(xué)的發(fā)展方向，在化學(xué)合成中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，無(wú)論在應(yīng)用數(shù)量還是種類上都有較大發(fā)展，在醫(yī)藥及其中間體、農(nóng)藥及其中間體、食品及飼料添加劑等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用：腈水解酶催化制備瑞舒伐他汀(rosuvastatin)的關(guān)鍵中間體(r)-3-羥基戊二酸乙酯；制備抗血小板聚集藥物氯吡格雷(clopidogrel)的關(guān)鍵中間體r型鄰氯扁桃酸；制備ida路線生產(chǎn)除草劑草甘膦的關(guān)鍵中間體亞氨基二乙酸等。

l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸是制備l-草銨膦的重要手性前體。dl-草銨膦，有效成分是phosphinothricin(簡(jiǎn)稱ppt)，其化學(xué)名稱為：4-[羥基甲基膦?；鵠-dl-高丙氨酸(別名：d,l-草銨膦胺鹽)，為廣譜、觸殺型、滅生性、非殘留除草劑，是由德國(guó)赫斯特公司(目前為拜耳公司旗下企業(yè))于20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)的新型滅生性除草劑。除了具有除草活性外還具有殺蟲(chóng)殺菌活性可以與殺蟲(chóng)劑等混配達(dá)到同時(shí)防治的效果。該除草劑具有高效、低毒、易降解等特點(diǎn)。草銨膦是外消旋體混合物，只有l(wèi)–型具有植物毒性，其除草活性為外消旋混合物的2倍。目前，市售的草銨膦一般都是外消旋混合物，如果能以l-型的草銨膦來(lái)代替其使用，不僅可以降低使用成本，還能減輕環(huán)境壓力。草銨膦的合成方法有很多，包括化學(xué)法合成外消旋草銨膦：蓋布瑞爾(gabriel)–丙二酸二乙酯合成法、阿布佐夫(arbuzov)合成法、高壓催化合成法、赫勒-貝格斯(bucherer-bergs)法、赫勒-貝格斯(bucherer-bergs)法、(neber)重排法、michael自由基加成法、(srecker)法合成dl-草銨膦；化學(xué)法合成l-草銨膦：d-纈氨酸甲酯和(s)-2-羥基-3-蒎酮為輔助劑的手性輔助劑誘導(dǎo)法、l-谷氨酸和l-蛋氨酸為手性源的天然氨基酸手性源法、不對(duì)稱strecker反應(yīng)和不對(duì)稱michael加成法、利用奎寧進(jìn)行外消旋體拆分法；酶法合成l-草銨膦主要有蛋白酶水解法、磷酸二酯酶i水解法，?；D(zhuǎn)移酶i催化法，谷氨酰胺酶三種酶協(xié)同水解法；轉(zhuǎn)氨酶法；α-胰乳蛋白酶拆分法、酰胺酶拆分法、脫乙?；覆鸱址?、d-氨基酸氧化酶拆分法等(現(xiàn)代農(nóng)藥，2009，8(3)：1-5)。

目前應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)草銨膦的方法可歸結(jié)為以下三條路線：拜耳公司利用michael自由基加成法制備d,l-草銨膦；srecker法合成d,l-草銨膦；明治制果不對(duì)稱催化加氫合成l-草銨膦。其中srecker法合成d,l-草銨膦路線反應(yīng)條件溫和，是目前產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)所采用的路線。該路線以亞磷酸三乙酯和三氯化磷為起始原料，經(jīng)歧化、格氏、甲基化、加成、腈銨化、酸解、銨化反應(yīng)制得d,l-草銨膦。用腈水解酶選擇性催化水解反應(yīng)替換srecker路線中的酸解步驟，催化路線中的α-氨基腈底物(2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁腈)制備合成l-草銨膦的重要手性前體：l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化路線的srecker法合成l-草銨膦提供了依據(jù)。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一株產(chǎn)腈水解酶的菌株--產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)zjb-16005，及其生物催化α-氨基腈底物(2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈)制備l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一株具有產(chǎn)腈水解酶性能的新菌株--產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)zjb-16005，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)cctccno：m2017032，保藏日期2017年01月13日，地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072。

本發(fā)明還涉及所述的產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)zjb-16005催化α-氨基腈(2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈)制備作為l-草銨膦重要手性前體的l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：以產(chǎn)酸克雷伯菌zjb-16005經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈為底物，以蒸餾水或100mm、ph7.0磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在30-50℃、100-200rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液分離純化，獲得l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸。

腈水解酶生物催化α-氨基腈(2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈)生成l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸過(guò)程如下：

進(jìn)一步，所述催化劑用量以濕菌體重量計(jì)為10-100g/l反應(yīng)介質(zhì)，優(yōu)選35g/l，所述底物初始加入終濃度為2-100g/l反應(yīng)介質(zhì)，優(yōu)選5g/l。

進(jìn)一步，所述催化劑按如下方法制備：(1)斜面培養(yǎng)：將產(chǎn)酸克雷伯菌zjb-16005接種至斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)48h，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：甘露醇1～20.0g/l，谷氨酸鈉1～10.0g/l，酵母膏1～5.0g/l，k2hpo40.1～1.0g/l，kh2po40.1～1.0g/l，mgso40.1～1.0g/l，己內(nèi)酰胺0.1～2.0g/l，瓊脂20.0g/l，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5；優(yōu)選所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：甘露醇10.0g/l，谷氨酸鈉7.0g/l，酵母膏3.0g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，mgso40.5g/l，己內(nèi)酰胺1.0g/l，瓊脂20.0g/l，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5；

(2)種子培養(yǎng)：挑取斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：甘露醇1～20.0g/l，谷氨酸鈉1～10.0g/l，酵母膏1～5.0g/l，k2hpo40.1～1.0g/l，kh2po40.1～1.0g/l，mgso40.1～1.0g/l，己內(nèi)酰胺0.1～2.0g/l，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5；優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：甘露醇10.0g/l，谷氨酸鈉7.0g/l，酵母膏3.0g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，mgso40.5g/l，己內(nèi)酰胺1.0g/l，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積濃度1～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)48h后，在12000g下離心10min，收集濕菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：甘露醇1～20.0g/l，谷氨酸鈉1～10.0g/l，酵母膏1～5.0g/l，k2hpo40.1～1.0g/l，kh2po40.1～1.0g/l，mgso40.1～1.0g/l，己內(nèi)酰胺0.1～2.0g/l，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5，優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：甘露醇10.0g/l，谷氨酸鈉7.0g/l，酵母膏3.0g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，mgso40.5g/l，己內(nèi)酰胺1.0g/l，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5。

本發(fā)明所述反應(yīng)液分離純化的方法為：將反應(yīng)液調(diào)至ph2.5，采用陰離子交換樹(shù)脂201×7進(jìn)行柱層析，以上柱流速為1～6.0bv/h(優(yōu)選4.0bv/h)進(jìn)行上樣，先用去離子水洗滌，再用0.5～2.0m(優(yōu)選1m)的氨水進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1.0～4.0bv/h(優(yōu)選2bv/h)，收集含有目標(biāo)物的洗脫液；將洗脫液減壓蒸餾至無(wú)溶劑流出，加入甲醇溶解，在冰浴下攪拌，重結(jié)晶，過(guò)濾，濾餅干燥，即得產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸。

本發(fā)明中利用腈水解酶選擇性催化水解2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈制得作為l-草銨膦重要手性前體的l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化路線成熟的srecker法合成l-草銨膦提供了依據(jù)。同時(shí)替代了國(guó)內(nèi)工業(yè)化strecker路線中的酸解反應(yīng)，減少了酸解反應(yīng)產(chǎn)生的酸性廢水污染和酸解反應(yīng)對(duì)設(shè)備的腐蝕損害。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一株能夠產(chǎn)腈水解酶的菌株--產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)zjb-16005，本發(fā)明還提供了利用產(chǎn)酸克雷伯菌zjb-16005經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為生物催化劑催化2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈制得作為l-草銨膦重要手性前體的l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸的方法，具有重要應(yīng)用前景。

(四)附圖說(shuō)明

圖1為柱前衍生化反相高效液相色譜條件下d-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸與l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸的液相結(jié)果譜圖。

圖2為銨根離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：產(chǎn)腈水解酶菌株的篩選及鑒定

1、產(chǎn)腈水解酶菌株的篩選

(1)本發(fā)明從全國(guó)各地取土樣，各稱取1g用0.85％生理鹽水懸浮，靜置，加1ml上清于50ml添加有1g/lα-氨基腈底物(2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁腈)作為唯一碳源的富集培養(yǎng)基中，在30℃，150rpm的搖床上培養(yǎng)3天；待培養(yǎng)基渾濁后，取1ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到添加有1g/l2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁腈的新鮮的富集培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)3天。如此循環(huán)富集3～4個(gè)循環(huán)；

(2)將最后一次富集培養(yǎng)液用無(wú)菌水逐級(jí)稀釋10個(gè)梯度，選取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8五個(gè)梯度的稀釋液各取0.1ml均勻涂布在添加有1g/l2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁腈的平板培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，將平板上的單菌落挑取，接種于斜面培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，于4℃保藏；

(3)將保存于斜面上的菌株接種至種子培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)24h。將種子液以體積濃度1％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)48h。在12000g下離心10min，收集濕菌體，取一定量的菌體和底物(2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁腈)懸浮于蒸餾水中，制成0.2g/10ml菌濃度，10g/l底物濃度的反應(yīng)體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，置于30℃水浴搖床轉(zhuǎn)化24h。取樣，進(jìn)行苯酚-次氯酸鹽法初篩，腈水解酶活力相對(duì)好的，再進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸的濃度和光學(xué)純度，最終篩選獲得菌株zjb-16005。

所述富集培養(yǎng)基終濃度組成為(g/l)：葡萄糖5.0，氯化鈉1.0，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po43.3，mgso4·7h2o0.2，溶劑為去離子水，ph為7.0，在此培養(yǎng)基中添加1g/l的2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈作為唯一的碳源。

所述平板篩選培養(yǎng)基為(g/l)：葡萄糖5.0，氯化鈉1.0，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po43.3，mgso4·7h2o0.2，瓊脂20.0，溶劑為去離子水，ph為7.0。115℃30min滅菌。冷卻至室溫后加入2-氨基-4(羥基甲基磷?；?-丁腈1.0g/l。

所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為(g/l)：甘露醇10.0，谷氨酸鈉7.0，酵母膏3.0，k2hpo40.75，kh2po40.75，mgso40.5，己內(nèi)酰胺1.0，瓊脂20.0，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為(g/l)：甘露醇10.0，谷氨酸鈉7.0，酵母膏3.0，k2hpo40.75，kh2po40.75，mgso40.5，己內(nèi)酰胺1.0，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5。

(4)苯酚-次氯酸鹽法初篩

用移液管取2ml的a液置于10ml的離心管中，加入4μl待測(cè)液，蓋上蓋子，用力混勻。之后再用移液管加入2ml的b液，蓋上蓋子，再次混勻。置于37℃水浴加熱5min后，至離心管內(nèi)顏色不再發(fā)生變化，取200μl置于96孔板中，620nm處測(cè)量吸光度后同標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得到待測(cè)液中銨根的濃度，銨根濃度等于轉(zhuǎn)化后得到的2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸的濃度，用此可以檢測(cè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸的產(chǎn)量。

所述a液：稱量5g苯酚和25mg亞硝基鐵氰化鈉，置于500ml容量瓶中，加入超純水定容后，保存于棕色瓶中，4℃冰箱中儲(chǔ)存。

所述b液：稱量2.5g的naoh置于500ml容量瓶，用移液管加入4.4ml含5.2％有效氯的次氯酸鈉水溶液后，用超純水定容，保存于棕色瓶中，4℃冰箱中儲(chǔ)存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：苯酚-次氯酸鹽法在室溫下用比色皿和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)或者在96孔板和通用微孔板分光光度計(jì)下都可以對(duì)銨根的濃度進(jìn)行測(cè)量，在620nm波長(zhǎng)下，od620值與銨根離子的濃度有著良好的線性關(guān)系(如圖2)，r²＝0.9982，表明此法有很高的可行性和準(zhǔn)確性。

(5)柱前衍生化反相高效液相色譜法復(fù)篩

取經(jīng)初篩后得到的結(jié)果較好的反應(yīng)液500μl，加入等體積的衍生化試劑，混勻，進(jìn)行衍生化反應(yīng)5min，然后進(jìn)樣15μl，進(jìn)行hplc分析。

所述的衍生化試劑：分別稱取10mg鄰苯二甲醛(opa)和12mgn-乙酰-l-半胱氨酸(nac)，以lml無(wú)水乙醇溶解后，用0.2mol/l硼酸緩沖液(ph值9.8)稀釋至5ml，-4℃冰箱保存?zhèn)溆?存放時(shí)間不宜超過(guò)3d)。

高效液相色譜分析條件為：采用的氣相色譜儀為美國(guó)戴安u3000液相色譜儀(配置熒光檢測(cè)器)；色譜柱：戴安c18(4.6mm×250mm，硅羥基填料)；流動(dòng)相：甲醇：0.05mol/l醋酸銨溶液(體積比10:90，ph值5.7)；流速：1ml/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：15μl；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)ex350nm，發(fā)射波長(zhǎng)em450nm。

在該條件下，l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸與d-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸的出峰時(shí)間分別為9.2min和11.1min，見(jiàn)圖1。

2、菌株zjb-16005的分子鑒定

將步驟1篩選得到的菌株zjb-16005用分子試劑盒提取其總dna，以該菌株zjb-16005的總dna為模板，利用引物:p1:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和p2:5'-aaggaggtgatccagccgca-3'擴(kuò)增菌株的16srdna基因(seqidno：1所示)，將基因產(chǎn)物同t載體連接后，委托上海生工對(duì)該菌16srdna擴(kuò)增及測(cè)序，得到該菌株的16srdna序列后，在ncbi網(wǎng)站上用blast檢索genbank中相關(guān)菌株的16srdna基因序列，并進(jìn)行同源性比對(duì)。本發(fā)明微生物與klebsiellaoxytoca菌株jko3同源性最高(homology，99％，basedon16srdna)，根據(jù)微生物分子遺傳學(xué)鑒定原則，基于16srdna序列的同源性高于95％，鑒定菌基本屬于對(duì)照菌。因此，本實(shí)驗(yàn)鑒定的菌株zjb-16005為產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)，擬命名為產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)zjb-16005。

任何對(duì)seqidno：1所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入處理獲得的核苷酸序列，只要其與該核苷酸具有90％以上的同源性，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例2：濕菌體的制備

(1)斜面培養(yǎng)

將產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)zjb-16005接種至斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)48h，獲得斜面菌體。

所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為(g/l)：甘露醇10.0，谷氨酸鈉7.0，酵母膏3.0，k2hpo40.75，kh2po40.75，mgso40.5，己內(nèi)酰胺1.0，瓊脂20.0，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5。

(2)種子培養(yǎng)

從斜面菌體挑取菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為(g/l)：甘露醇10.0，谷氨酸鈉7.0，酵母膏3.0，k2hpo40.75，kh2po40.75，mgso40.5，己內(nèi)酰胺1.0，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液以體積濃度1％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)48h后，在12000g下離心10min，收集濕菌體。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為(g/l)：甘露醇10.0，谷氨酸鈉7.0，酵母膏3.0，k2hpo40.75，kh2po40.75，mgso40.5，己內(nèi)酰胺1.0，溶劑為去離子水，ph7.0-7.5。

實(shí)施例3：以α-氨基腈(2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈)為底物的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)

(1)在10ml磷酸緩沖液(100mm，ph7.0)中加入實(shí)施例2方法制備的濕菌體0.2g，底物2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁腈終濃度為2g/l，放入水浴搖床30℃，150rpm條件下轉(zhuǎn)化24h。取1ml轉(zhuǎn)化液于ep管中，12000r/min離心2min，取上清進(jìn)行手性液相檢測(cè)。結(jié)果表明菌株zjb-16005對(duì)2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈的轉(zhuǎn)化得到產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸的光學(xué)純度為99.9％。

(2)酶反應(yīng)得到含產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸的轉(zhuǎn)化液在離子交換柱上采用陰離子交換樹(shù)脂201×7進(jìn)行產(chǎn)物的分離。

1)樹(shù)脂預(yù)處理

用50℃溫水浸泡，使其充分膨脹并除去細(xì)小顆粒(傾斜或浮選法)；依次用l.0m的naoh水溶液浸泡3h用去離子水洗至中性，再用l.0m的hcl水溶液浸泡3h后用去離子水洗至中性，然后用l.0m的naoh水溶液浸泡3h，轉(zhuǎn)化為oh^-形式，最后用去離子水洗至中性備用。

2)裝柱

采用濕法裝柱(內(nèi)徑1.5cm，高40cm)，先在離子交換柱內(nèi)先加入一定高度的去離子水(一般為柱長(zhǎng)的1/3)，在取30ml濕樹(shù)脂201×7裝入玻璃杯，加入50ml去離子水，慢慢攪拌，懸浮狀的樹(shù)脂倒入離子交換柱中，讓其自然沉降，樹(shù)脂在柱內(nèi)必須分布均勻，不應(yīng)有明顯的分界線，不要有氣泡產(chǎn)生。

3)上樣，洗脫

將步驟(1)轉(zhuǎn)化液調(diào)至ph2.5，以上柱流速為4.0bv/h進(jìn)行上樣，每隔一段時(shí)間取流出的液體進(jìn)行液相檢測(cè)，當(dāng)吸附達(dá)到了最高值時(shí)，柱子先用去離子水洗滌，再用1.0m的氨水進(jìn)行洗脫，洗脫速度為2.0bv/h，收集洗脫液，并每隔一段時(shí)間檢測(cè)其中所含的l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸。洗脫完畢后離子交換柱用去離子水洗滌，并將樹(shù)脂201×7轉(zhuǎn)化為oh^-用于下一次的分離提取。

4)純化

洗脫液減壓蒸餾得黃色粘稠物質(zhì)，加入甲醇溶解，在冰浴下攪拌，重結(jié)晶得白色固體，過(guò)濾即得產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸。

以步驟(1)反應(yīng)條件制備轉(zhuǎn)化液1l，經(jīng)上述分離純化后，最后得到l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸固體0.7g，光學(xué)純度為99.9％。

實(shí)施例4：

在10ml磷酸緩沖液(100mm，ph7.0)中加入實(shí)施例2方法制備的濕菌體0.2g，底物2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈終濃度為10g/l，放入水浴搖床30℃，150rpm條件下轉(zhuǎn)化24h。取1ml轉(zhuǎn)化液于ep管中，12000r/min離心2min，取上清進(jìn)行手性液相檢測(cè)。同樣的反應(yīng)條件下制備轉(zhuǎn)化液1l，經(jīng)實(shí)施例3的方法進(jìn)行分離純化后，得到產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸3g，光學(xué)純度為99.9％。

實(shí)施例5：

在10ml磷酸緩沖液(100mm，ph7.0)中加入實(shí)施例2方法制備的濕菌體1g，底物2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈終濃度為10g/l，放入水浴搖床30℃，150rpm條件下轉(zhuǎn)化24h。取1ml轉(zhuǎn)化液于ep管中，12000r/min離心2min，取上清進(jìn)行手性液相檢測(cè)。同樣的反應(yīng)條件下制備轉(zhuǎn)化液1l，經(jīng)實(shí)施例3的方法進(jìn)行分離純化后，得到產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸4.2g，光學(xué)純度為99.9％。

實(shí)施例6：

在10ml磷酸緩沖液(100mm，ph7.0)中加入實(shí)施例2方法制備的濕菌體0.2g，底物2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁腈終濃度為10g/l，放入水浴搖床40℃，150rpm條件下轉(zhuǎn)化24h。取1ml轉(zhuǎn)化液于ep管中，12000r/min離心2min，取上清進(jìn)行手性液相檢測(cè)。同樣的反應(yīng)條件下制備轉(zhuǎn)化液1l，經(jīng)實(shí)施例3的方法進(jìn)行分離純化后，得到產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷?；?-丁酸3.2g，光學(xué)純度為99.9％。

實(shí)施例7：

在100ml磷酸緩沖液(100mm，ph7.0)中加入實(shí)施例2方法制備的濕菌體5g，底物2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁腈終濃度為10g/l，放入水浴搖床30℃，150rpm條件下轉(zhuǎn)化48h。取1ml轉(zhuǎn)化液于ep管中，12000r/min離心2min，取上清進(jìn)行手性液相檢測(cè)。同樣的反應(yīng)條件下制備轉(zhuǎn)化液1l，經(jīng)實(shí)施例3的方法進(jìn)行分離純化后，得到產(chǎn)物l-2-氨基-4(羥乙基甲基磷酰基)-丁酸5.1g，光學(xué)純度為99.9％。

sequencelisting

<110>浙江工業(yè)大學(xué)

<120>產(chǎn)酸克雷伯菌及其應(yīng)用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1458

<212>dna

<213>klebsiellaoxytoca

<400>1

cgcattgcggcagctaccatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtga60

cgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactg120

gaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctct180

tgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcg240

acgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccaga300

ctcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccat360

gccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcgat420

aaggttaataaccttgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgc480

cagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgc540

acgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattc600

gaaactggcaggctggagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatg660

cgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctc720

aggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacg780

atgtcgacttggaggttgttcccttgaggagtggcttccggagctaacgcgttaagtcga840

ccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaa900

gcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatc960

cagagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatgg1020

ctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttat1080

cctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggagg1140

aaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctaca1200

atggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgt1260

agtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggat1320

cagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatggga1380

gtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgatt1440

catgactgggggaagtcg1458