一種肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測(cè)方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種肺炎克雷伯菌碳青霉稀酶基因型檢測(cè)方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因型檢測(cè)方法。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯菌化lebsiellapneumoniae)為常見(jiàn)院感病原菌，是臨床醫(yī)院感染重 點(diǎn)監(jiān)測(cè)的病原菌之一。隨著碳青霉締類(lèi)抗生素的大范圍使用，多藥耐藥株肺炎克雷伯菌不 斷出現(xiàn)。由肺炎克雷伯菌感染導(dǎo)致己西大規(guī)模流行的"超級(jí)細(xì)菌"事件使全球的目光又聚 焦到了 "多重抗生素耐藥"和"肺炎克雷伯菌"上。
[0003] 據(jù)報(bào)道，一些腸桿科屬細(xì)菌體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)攜帶肺炎克雷伯菌型碳青霉締酶，如大腸 埃希菌、沙口菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、沙雷菌等，使得利用臨床抗生素治療細(xì)菌感染 性疾病失敗或者造成治病療程延緩。肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理主要是菌體產(chǎn)生質(zhì)粒 介導(dǎo)的超廣譜0-內(nèi)酷胺酶巧SBLs)和頭抱菌素酶（AmpC酶），進(jìn)而導(dǎo)致菌體外膜孔蛋白 丟失、抗菌藥物主動(dòng)外排、生物被膜形成、基因變異等，因此針對(duì)于抑制上述兩種酶活性的 抗生素治療是解決肺炎克雷伯菌耐藥性的關(guān)鍵。碳青霉締類(lèi)抗生素是目前臨床使用的抗 菌活性最強(qiáng)、抗菌譜最廣的一類(lèi)抗生素，尤其對(duì)產(chǎn)超廣譜0-內(nèi)酷胺酶和頭抱菌素酶的菌 株治療效果極佳，因此在臨床上被廣泛使用。隨著該類(lèi)抗生素使用頻率的不斷提高，在世界 范圍內(nèi)不斷出現(xiàn)了產(chǎn)碳青霉締酶肺炎克雷伯菌化lebsiellapneumoniaecarbapenemase， KPC)。碳青霉締酶是一種由質(zhì)粒編碼并能夠被克拉維酸抑制的酶類(lèi)，能夠水解碳青霉締類(lèi)、 青霉素類(lèi)、頭抱菌素類(lèi)和氨曲南等抗生素，因此該類(lèi)菌株的出現(xiàn)是導(dǎo)致臨床抗生素治療失 敗的主要原因。肺炎克雷伯菌型碳青霉締酶是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型碳青霉締酶類(lèi)，屬于Bush 分類(lèi)的2f組，Ambler分類(lèi)的A類(lèi)，能夠水解碳青霉締類(lèi)、青霉素類(lèi)、頭抱菌素類(lèi)和氨曲南等 臨床常用的抗生素。肺炎克雷伯菌型碳青霉締酶基因位于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，可依靠質(zhì)粒、整 合子、插入序列的基因元件進(jìn)行傳播，該也是多藥耐藥菌株易于傳播的重要原因。
[0004] 目前有報(bào)道采用多重巧光定量PCR技術(shù)結(jié)合酶切的方法針對(duì)肺炎克雷伯菌KPC-2 和KPC-3型碳青霉締酶進(jìn)行分型。最新的文獻(xiàn)報(bào)道采用多重巧光定量PCR結(jié)合分子信標(biāo)技 術(shù)對(duì)11種類(lèi)型的肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因進(jìn)行區(qū)分。該11種碳青霉締酶基因型是由 5個(gè)不同的基因多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)成。
[0005] 對(duì)于肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因分型及新基因篩查相關(guān)工作開(kāi)展較少，國(guó)內(nèi)并 無(wú)該方面研究，而且對(duì)于每種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因亞型的生物學(xué)功能尚不清楚。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因型分類(lèi)方法，該方法對(duì)肺炎 克雷伯菌碳青霉締酶化lebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)基因KPC1-15 共 14 種亞型進(jìn)行分型，該方法設(shè)及一對(duì)大片段擴(kuò)增引物，六條SNaPshot檢測(cè)用引物，擴(kuò)增結(jié)果 使用毛細(xì)管測(cè)序基因分析儀檢測(cè)，操作方便。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[000引本發(fā)明提供一種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因型檢測(cè)方法，所述方法為；W待測(cè) 菌株基因?yàn)槟０?，在引?和引物2作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后W擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在 引物3-引物8的混合引物作用下進(jìn)行SNaPshotPCR反應(yīng)，對(duì)SNaPshotPCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序；
[0009] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、308位和814位均為C堿基（即胞喀晚），272位 為T(mén)堿基（即胸腺喀晚），502位為G堿基（即鳥(niǎo)嚷嶺），716位為A堿基（即腺嚷嶺），則待 測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-1或KPC-2;
[0010] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、308位為C堿基，272位和814位為T(mén)堿基，502位 為G堿基，716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-3;
[0011] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、716位和814位為C堿基，在308位和502位為G 堿基，在272位為T(mén)堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-4;
[001引 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位和814位為C堿基，在308位和502位為G堿基， 在272位為T(mén)堿基，在716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-5;
[0013] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、308位、716位和814位為C堿基，在272位為T(mén) 堿基，在502位為G堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-6;
[0014] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、272位和814位為T(mén)堿基，在308位為C堿基，在 502位為G堿基，在716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-7;
[0015] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、308位和716位為C堿基，在272位和814位為T(mén) 堿基，在502位為G堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-8;
[0016] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位和308位為C堿基，在272位和814位為T(mén)堿基， 在502位和716位為G堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-9;
[0017] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位為C堿基，在308位和502位為G堿基，在272位 和814位為T(mén)堿基，716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-10;
[0018] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位和814位為C堿基，在502位為G堿基，在308位 和272位為T(mén)堿基，716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-11;
[0019] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、308位和814位為C堿基，在272位和502位為T(mén) 堿基，716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-12;
[0020] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、308位和272位為C堿基，在502位為G堿基，在 814位為T(mén)堿基，716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-13;
[0021] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位、308位、272位和814位為C堿基，在502位為G 堿基，716位為A堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-14;
[0022] 若SNaPshotPCR產(chǎn)物在147位和716位為C堿基，在308位和502位為G堿基， 在272位和814位為T(mén)堿基，則待測(cè)菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-15;
[0023]引物 1 為；5' -CTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGT-3,；
[0024]引物 2 為；5' -CAGAGCCTTACTGCCCGTTGA-3,；
[002引 引物 3 為；5，- (T)3GCGCCTGAGCCGGTATC-3'，（T)3表示有 3 個(gè)T，即（T)3為T(mén)TT;
[0026]引物 4 為；5, -(T)9GCAAAAATGCGCTGGTTC-3'，訊9含義同（T) 3;
[0027]引物 5 為；5' -(T)mCCGTAACGGATGGGTGTG-3'，（T) 14含義同訂）3;
[002引 引物 6 為；5, -(T)20GGGATGGCGGAGTTCA-3'，訊2。含義同（T) 3;
[0029]引物 7 為；5，- (T) 2sGTCATTTGCCGTGCCATAC-3 '，（T)28含義同（T) 3;
[0030]引物 8 為；5, -(T)3sGCGCCTAACAAGGATGACAAG-3,，（T) %含義同（T) 3。
[003U進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為；基因組DNAO.SuL、反應(yīng)混合物lO.OuL， 0. 1-3. 5yM引物混合物5. 0yL、5U/yL熱啟動(dòng)Taq酶1. 0yL，3地20補(bǔ)足至25. 0yL;所述 反應(yīng)混合物為 2. 5XPCR緩沖液、MgClal. 2-3.OmM和dNTPs200uM。
[003引進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C初始變性5分鐘，30個(gè)循環(huán)；94°C1分鐘，58°C1 分鐘，72°C1分鐘，72 °C終延伸5分鐘，4°C保溫。
[003引PCR產(chǎn)物經(jīng)2.抓CIAP(寶生物堿性磯酸酶）和抓ExoI處理后，W美國(guó)生命科技 公司（lifetechnology)的ABIPRISMSNaPshotMultiplexKit進(jìn)行反應(yīng)，所述SNaPshot PCR反應(yīng)體系為；反應(yīng)緩沖液ReactionMixO. 5yLPCR產(chǎn)物2. 0yL引物混合物1. 0yL 水1. 5yL。所述SNaPshotPCR反應(yīng)程序?yàn)?；預(yù)變性96°C，10秒，96°C變性10秒，53°C延伸 5秒，60°C30秒，30個(gè)循環(huán)游延伸60°C10秒，4°C保溫。
[0034] 本發(fā)明首先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載KPC1-15序列（KPC-1 ;AF297554 ;KPC-2 ; GU086225 ;KPC-3 ;AF395881 ;KPC-4 ;FJ473382 ;KPC-4 ;AY700571 ;KPC-5 ;抓400222 ;KPC-6 ; 抓555534;KPC-7 ;EU729727 ;KPC-8 ;FJ234412 ;KPC-9 ;FJ624872 ;KPC-10 ;GQ140348 ; KPC-11 ;HM066995;KPC-12 ;HQ641422 ;KPC-13 ;冊(cè)342889. 1 ;KPC-14JX524191 ;KPC-15 ; KC433553)，經(jīng)序列比對(duì)之后，選擇了 6 個(gè)SNP位點(diǎn)（ntl47,nt272,nt308,nt502,nt716 及 n巧14)，該些位點(diǎn)可W將KPC1-KPC15分成14種不同的亞型（KPCl與KPC2基因型相同）； 其次設(shè)計(jì)一對(duì)大片段引物（引物1和引物2)對(duì)檢測(cè)模板進(jìn)行富集，富