用于使生物質(zhì)水解的酶組合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于使生物質(zhì)水解的酶組合物，其包括至少一種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和/或至少一種果膠酶。在又一方面，本發(fā)明涉及實(shí)施該酶組合物用于使生物質(zhì)水解的方法，以及該酶組合物用于使生物質(zhì)水解的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于使生物質(zhì)水解的酶組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于使生物質(zhì)水解的酶組合物，其包括至少一種纖維素酶、至少 一種半纖維素酶和至少一種果膠酶。在又一方面，本發(fā)明涉及實(shí)施該酶組合物用于使生物 質(zhì)水解的方法，以及該酶組合物用于使生物質(zhì)水解的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 源自例如甜菜、玉米、稻草和其他含糖或含多糖及含果膠的材料的來(lái)源的生物質(zhì) 對(duì)于精制糖例如單糖或二糖是有價(jià)值的來(lái)源。
[0003] 在本領(lǐng)域中，已經(jīng)采用了各種方法從所述生物質(zhì)分離或提取這些化合物。通常，這 些方法允許從生物質(zhì)材料例如甜菜中簡(jiǎn)單分離或提取單糖和二糖，然而，大部分含糖化合 物例如纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和/或果膠常常被丟棄。
[0004] 在良好確立的方法中，通過(guò)在連續(xù)對(duì)流方法中用熱水對(duì)碎甜菜進(jìn)行提取，從例如 甜菜移除單糖和二糖。通常，這些方法需要添加另外的試劑例如含量為大約1~3kg CaO/ 100kg甜菜的CaO。該方法的產(chǎn)物是被稱(chēng)為原汁的糖溶液和所謂的甜菜柏，后者在漿柏干燥 器中干燥。原汁經(jīng)過(guò)多級(jí)凈化和過(guò)濾以去除雜質(zhì)和非糖物質(zhì)，以產(chǎn)生濃汁(65-70 %的干物 質(zhì)含量），或者在結(jié)晶后，產(chǎn)生經(jīng)精煉的精制糖。在該方法期間升高的溫度和pH條件導(dǎo)致由 于酸性和有色化合物的形成，溶液中包含的關(guān)鍵量的單糖被破壞。而且，由于氮化合物、特 別是關(guān)于酰胺的分解，氨被釋放到大氣中。此外，所謂的甜菜柏仍然不僅包含甜菜的大部分 蛋白質(zhì)，還包含大部分的多糖例如纖維素、半纖維素和果膠。根據(jù)German Zuckerverband， 在2011/2012年，德國(guó)總計(jì)制造了4.266.670噸的糖（以1如丨鉍1^1?5^6^"給出），對(duì)應(yīng)于 1 ? 907 ? 302噸的Schnitzel ( "殘余物"）（以 "t Trockenschnitzelwert" 表不）。結(jié)果，每噸糖 產(chǎn)生 了大約〇 ? 45噸的殘余物作為廢料(http: //www. zuckerverbaende ? de/zuckermarkt/ zahlen-und-fakten/zuckermarkt-deutschland/ruebenanbau-zuckererzeugung.html)〇
[0005] 為了克服這些缺點(diǎn)，已經(jīng)試驗(yàn)了生物質(zhì)降解的其他可能性，例如使用水解酶。已存 在有源自天然真菌來(lái)源的可用于水解生物質(zhì)的商業(yè)化酶組合物，例如包含果膠酶、半纖維 素酶和纖維素酶作為副活性的產(chǎn)品" Pectmex? "，和主要包含纖維素酶和半纖維素酶的 產(chǎn)品" Celluclast? "（二者均來(lái)自Novozymes?)。這類(lèi)商業(yè)化產(chǎn)品的使用在US4，886，672 和EP 2 256 208 A1中述及。
[0006] 但是截至目前，這些產(chǎn)品很少在大規(guī)模生產(chǎn)工藝中采用，因?yàn)樯镔|(zhì)的降解速率 仍然相對(duì)較低。因此，生物質(zhì)基本水解所需的工藝時(shí)間仍然相當(dāng)高，因此這些商業(yè)可得產(chǎn)品 用于工業(yè)目的應(yīng)用受到限制。
[0007] 因此，需要有能夠使含糖和/或含多糖的生物質(zhì)在合理時(shí)間內(nèi)完全降解和/或水解 的新型高性能酶組合物。此外，在技術(shù)現(xiàn)狀中需要有這樣的高性能酶組合物，其能夠以符合 成本效益的方式進(jìn)行大量制備。此外，需要有這樣的高性能酶組合物，其能夠應(yīng)用于工業(yè)級(jí) 水解工藝。
[0008] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于使生物質(zhì)水解的方法，其不顯示技術(shù)現(xiàn)狀 中已知方法的任何缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 目前，本發(fā)明的發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與技術(shù)現(xiàn)狀中已知的酶組合物相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題 能夠通過(guò)包括至少一種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和至少一種果膠酶的酶組合物解 決，其中上述至少一種半纖維素酶包括阿拉伯聚糖降解活性至少為l〇U/mg蛋白質(zhì)的阿拉伯 聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。
[0010] 在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"纖維素酶"、"半纖維素酶"和"果膠酶"是指分別參與將聚 合纖維素、半纖維素和/或果膠水解切割成單糖的任何酶。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"纖維素酶"、 "半纖維素酶"和"果膠酶"是指天然存在的酶和非天然存在的酶、或者包括數(shù)種由生物體例 如絲狀真菌產(chǎn)生的酶的混合物。"纖維素酶"、"半纖維素酶"和"果膠酶"優(yōu)選源自真菌例如 亞門(mén)真菌門(mén)和卵菌門(mén)的成員，包括但不限于以下屬：曲霉屬（Aspergillus)、枝頂孢屬 (Acremonium)、短梗霉屬（Aureobasidium)、白僵菌屬（Beauveria)、頭抱霉屬 (〇6口11&1〇8。01'；[11111)、擬錯(cuò)菌屬（061'1。01'；[(^818)、毛殼菌屬（01&61：0111；[11111)、金抱子菌屬 (Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋抱腔菌屬（Cochiobolus)、隱球菌屬 (Cryptococcus)、黑蛋巢菌（Cyathus)、內(nèi)座殼屬（Endothia)、Endothiamucor、鏡刀霉屬 (Fusarium)、Gilocladium、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、稻痕病菌（Magnaporthe)、毀絲霉屬 (Myceliophthora)、漆斑菌屬（Myrothecium)、毛霉屬（Mucor)、脈抱菌屬（Neurospora)、 Phanerochaete、柄抱殼菌屬（Podospora)、擬青霉屬（Paecilomyces)、梨抱屬 (Pyricularia)、根毛霉屬(Rhizomucor)、根霉屬(Rhizopus)、裂裙菌屬（Schizophylum)、殼 多孢屬（Stagonospora)、藍(lán)狀菌屬（Talaromyces)、木霉屬（Trichoderma)、嗜熱真菌屬 (Thermomyces)、熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼屬（Thielavia)、彎頸霉屬 (Tolypocladium)、毛癬菌屬(Trichophyton)和栓菌屬（Trametes)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式 中，絲狀真菌是木霉菌物種。
[0011] 在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的優(yōu)選實(shí)施方式中，上述至少一種纖維素酶、半纖維素 酶和/或果膠酶來(lái)自真菌來(lái)源。在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，該真菌 來(lái)源是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
[0012] 術(shù)語(yǔ)"酶的混合物"優(yōu)選是指由一種或多種微生物來(lái)源分泌的酶的混合物。在一些 實(shí)施方式中，可以通過(guò)一種或多種天然存在的絲狀真菌菌株或經(jīng)過(guò)改造的絲狀真菌菌株來(lái) 制備用于這些酶混合物中的酶。優(yōu)選的菌株如上所列?？赏ㄟ^(guò)改變最終混合物中酶的相對(duì) 量而實(shí)現(xiàn)最終混合物中酶組分的期望比例，例如，通過(guò)補(bǔ)充提純的或部分提純的酶。
[0013] 如在本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)"纖維素酶"是指能夠使纖維素聚合物水解成較短的低 聚物和/或葡萄糖的任何酶或者酶混合物。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的酶組合物中的至少一種纖維素酶優(yōu)選選自纖維二糖水解酶（EC 3.2.1. -)、內(nèi)切-1，4-0_葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、0_葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纖維二糖水解 酶（EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(61161和〇8103)、￡1?3118111、5￥〇11611111、1〇〇8111111和(：1?蛋 白（EC 3.1.1.-;CE15)。
[0015] 在優(yōu)選的酶組合物中，術(shù)語(yǔ)"纖維素酶"包括至少一種選自纖維二糖水解酶(EC 3.2.1. -)和內(nèi)切-l，4-0-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)的酶。
[0016] 如在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"半纖維素酶"是指任何能夠使半纖維素降解或支持其 降解的酶或者酶組合物。
[0017] 術(shù)語(yǔ)"阿拉伯聚糖-內(nèi)切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶"是指阿拉伯聚糖-內(nèi)切-l，5_a-L_阿拉伯糖苷酶EC 3.2.1.99。在本發(fā)明中，阿拉伯聚糖-內(nèi)切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶EC 3.2.1.99具有至少10U/mg蛋白質(zhì)、優(yōu)選至少15U/mg蛋白質(zhì)、進(jìn)一步優(yōu)選至少20U/mg蛋白質(zhì)、 特別優(yōu)選至少40U/mg蛋白質(zhì)以及最優(yōu)選至少50U/mg蛋白質(zhì)的阿拉伯聚糖降解活性。進(jìn)一步 優(yōu)選的是，阿拉伯聚糖降解活性選自如下的范圍：l〇-l〇〇U/mg蛋白質(zhì)，優(yōu)選10-65U/mg蛋白 質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)選20-65U/mg蛋白質(zhì)以及20-50U/mg蛋白質(zhì)。
[0018] 在本發(fā)明的酶組合物中使用的阿拉伯聚糖-內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶可以通 過(guò)細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源進(jìn)行表達(dá)。阿拉伯聚糖-內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶優(yōu)選源自真 菌，例如土曲霉(Aspergillus terreus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)、7K[^jl^LlSi(Fomes fomentarius)、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum)、棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)、Cylindro carponcongoense、紅球叢 赤殼菌（Nectria haematococca)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophile)、球毛殼菌 (Chaetomium globulosum)、變色檢菌（Trametes versicolor)或者構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)。阿拉伯聚糖-內(nèi)切-l，5_a-L-阿拉伯糖苷酶可以通過(guò)在內(nèi)源生物中表達(dá)而制備， 或者可以通過(guò)在異源生物中表達(dá)而制備。優(yōu)選地，主要酶和輔助酶(accessory enzyme)通 過(guò)在里氏木霉中表達(dá)而制備。
[0019] 在除了阿拉伯聚糖-內(nèi)切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶之外根據(jù)本發(fā)明的酶組合物還 包含一種或多種另外的半纖維素酶的情況下，該一種或多種半纖維素酶優(yōu)選選自葡聚糖 酶(EC 3.2.1.-)、內(nèi)切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、0_木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯 酶（EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶（3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73)、葡糖醛酸酯酶(EC 3.1.1. _)、a-L_阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、a-阿拉伯 吡喃糖苷酶(3.2.1._)、a-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、0_半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、a-葡 糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、0_甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、0_甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘 露聚糖1，4-甘露二糖苷酶(EC 3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-0-1，4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、內(nèi)切-0-1，3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖內(nèi)切-0-1，3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181)、葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖內(nèi)切-1，4-0-木聚糖酶化〇3.2.1.136)、(^-巖藻 糖苷酶（EC 3.2.1.51)、松柏苷葡糖苷酶（EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶（EC 3.2.1.150，151，155)、木聚糖<1-1，2-葡糖苷酸酶（8111(3證〇11〇81(^86)(￡0 3.2.1.131)、內(nèi)切 木糖半乳糖醛酸聚糖水解酶(EC 3.2.1，-;GH28)、a-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1，4-a-葡 糖苷酶（EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1，3-半乳糖苷酶（61143)、-1，4，-內(nèi)切半乳聚糖酶（￡〇 3.5.1.89 ;GH53)、a-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、0_鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)、木質(zhì)素過(guò)氧 化物酶江(：1.11.1.14)、1111過(guò)氧化物酶(￡(：1.11.1.13)、芳基醇氧化酶江(：1.1.3.7)、乙二 醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9，10)、以及纖維二糖脫氫酶(EC 1.1.99.18)〇
[0020] 在優(yōu)選的酶組合物中，術(shù)語(yǔ)"半纖維素酶"包括至少一種選自木聚糖酶、木糖苷酶、 酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、過(guò)氧化物酶和氧化酶的半纖維素酶。特別優(yōu)選的是， 根據(jù)本發(fā)明的酶組合物包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或半乳糖聚酶的至少一種。
[0021] 如在本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)"果膠酶"是指任何能夠降解果膠或支持其降解的酶或 酶混合物。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的酶組合物中的至少一種果膠酶優(yōu)選選自聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.15,67,82;61128)、果膠/果膠酸酯裂解酶(￡〇4.2.2.2,6,9，10)、果膠甲酯酶(￡〇 3.1.1.11)、果膠乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1. -; GH28)、鼠李糖 半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶（EC 3. 1 . 1 .86)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖內(nèi)切裂解酶（EC 4.2.2.23)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶(EC 4.2.2.-，）、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖半乳糖 酸酸水解酶（rhamnogalacturonan galacturonohydrolase) (EC 3 ? 2 ? 1 ? _)、木糖半乳糖酸 酸聚糖水解酶（E C 3.2 . 1.-)、果膠甲酯酶（E C 3 . 1. 1 . 11)、0 -阿拉伯呋喃糖苷酶（E C 3 ? 2 ? 1 ? 55)、0-1，4-半乳聚糖酶(EC 3 ? 2 ? 1 ? 89)、0-1，3-半乳聚糖酶(EC 3 ? 2 ? 1 ? 90)、0_半乳 糖苷酶(EC 3.2.1.23)、a-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、阿魏酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、a-巖 藻糖苷酶(￡〇3.2.1.51)、0-巖藻糖苷酶(￡〇3.2.1.38)、0-洋芹糖苷酶(￡〇3.2.1.-)、€1-鼠 李糖苷酶（EC 3.2. 1.40)、0_鼠李糖苷酶（EC 3.2. 1.43)、a-阿拉伯吡喃糖苷酶（EC 3.2.1. - )、0_葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、a-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、0_木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和〇-木糖苷酶(￡〇3.2.1.-)〇
[0023] 在優(yōu)選的酶組合物中，術(shù)語(yǔ)"果膠酶"包括選自果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠裂 解酶、甘露糖苷酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶的至少一種果膠酶。
[0024] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99) 的阿拉伯聚糖降解活性為至少一種纖維素酶的纖維素降解活性的至少8倍，優(yōu)選 為至少一種纖維素酶的纖維素降解活性的至少18倍，最優(yōu)選至少36倍。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí) 施方式中，阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性 為至少一種纖維素酶的纖維素降解活性的8-100倍，優(yōu)選10-70倍。
[0025] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99) 的阿拉伯聚糖降解活性為至少一種果膠酶的果膠降解活性的至少10倍，優(yōu)選為 至少一種果膠酶的果膠降解活性的至少25倍，還優(yōu)選至少50倍，最優(yōu)選至少100倍。在進(jìn)一 步優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚 糖降解活性為至少一種果膠酶的果膠降解活性的10-250倍，優(yōu)選12-100倍，進(jìn)一步優(yōu)選15-70倍。
[0026] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)組合物中存在另一種半纖維素酶時(shí)，阿拉 伯聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性為至少一種半 纖維素酶的半纖維素降解活性的至少0.25倍，優(yōu)選為至少一種半纖維素酶的半纖維素降解 活性的至少0.5倍，最優(yōu)選與之差不多。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性為至少一種半纖維素酶的半纖維 素降解活性的〇. 25-5倍，優(yōu)選0.5-2倍。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的酶組合物優(yōu)選缺乏任何轉(zhuǎn)化酶(E. C. 3.2.1.26)的酶。這在生物質(zhì)水 解過(guò)程中酶組合物的使用是旨在生產(chǎn)用于食品應(yīng)用的砂糖的情況下是特別優(yōu)選的。
[0028] 根據(jù)基于國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)的酶的命名和分類(lèi)（http:// www. chem. qmul ? ac ? uk/iubmb/enzyme/)或者基于碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（http : // www. cazy. org/)的命名法對(duì)本發(fā)明中提及的酶進(jìn)行分類(lèi)。
[0029] 本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)酶的"活性"是指在酶充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)催化劑將特定的聚合或人 造底物轉(zhuǎn)化成特定的低聚或單體產(chǎn)物的合適條件下酶的催化活性。在上下文中，術(shù)語(yǔ)"合適 條件"對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的且可適用的。
[0030] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及如上文定義的酶組合物用于使生物質(zhì)水解的用途。
[0031] 本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"生物質(zhì)"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適用于本發(fā)明方法的任 何類(lèi)型的生物質(zhì)。特別優(yōu)選的是植物來(lái)源的生物質(zhì)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物質(zhì)的 初始干物質(zhì)含量選自5_50wt%、優(yōu)選10_45wt%、更優(yōu)選15_42wt%、最優(yōu)選20_40wt%。術(shù)語(yǔ) "干物質(zhì)是指在使用紅外平衡法（IR-balance)將水和其他揮發(fā)性化合物從新鮮組 織中移除之后測(cè)定的質(zhì)量與生物質(zhì)的比例。由此特別優(yōu)選的是選擇其中其干物質(zhì)包含至少 25wt%、更優(yōu)選至少40wt%、特別優(yōu)選至少60wt%、進(jìn)一步優(yōu)選至少80wt%的糖例如單糖、 二糖以及寡糖和/或多糖的生物質(zhì)。而且，合適的生物質(zhì)的任意混合物包涵在術(shù)語(yǔ)"生物質(zhì)" 中。
[0032] 特別優(yōu)選的生物質(zhì)是"甜菜生物質(zhì)"或"甘蔗生物質(zhì)"。術(shù)語(yǔ)"甜菜生物質(zhì)"是指甜菜 (Beta Vulgaris)的完整且未經(jīng)加工的根組織，包括其外皮和內(nèi)部果肉。甜菜的干組織包含 80wt %的可溶性蔗糖，而甜菜果肉包含大約7wt %的果膠、7wt %的纖維素、7wt %的半纖維 素、17wt%的阿拉伯糖、20wt%的葡萄糖和3.5wt%的果糖以及10wt%的蛋白質(zhì)，所有這些 均相對(duì)于生物質(zhì)的干物質(zhì)(d.m.)而言。術(shù)語(yǔ)"甜菜生物質(zhì)"還包括甜菜柏(甜菜片）。
[0033]術(shù)語(yǔ)"甘鹿生物質(zhì)"是指甘鹿（Saccharum sp.)的完整且未經(jīng)處理的莖，包括外皮 和內(nèi)部果肉。甘蔗的干組織包含80wt%的可溶性蔗糖，而干的甘蔗渣由大約70wt%的聚合 糖組成，包括45wt%的纖維素、23wt%的木質(zhì)素和25wt%的主要為木聚糖形式的半纖維素， 所有這些均相對(duì)于生物質(zhì)的干物質(zhì)(d.m.)而言。術(shù)語(yǔ)"甘蔗生物質(zhì)"還包括甘蔗壓餅(甘蔗 渣) 。
[0034] 適用于本發(fā)明方法的其它生物質(zhì)包括來(lái)自林業(yè)和農(nóng)業(yè)、食品加工和造紙業(yè)以及公 共廢料的廢產(chǎn)品。具體而言，如在本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)"生物質(zhì)"包括谷物秸桿和斯佩爾特 小麥(spelt)(如小麥、黑麥、大麥、燕麥）、玉米猜桿和紡錠(spindles)、廐肥、草本材料和草 例如Sericea lespedeza、柳枝稷（Panicum virgatum)、象草（芒草(Miscanthus);中國(guó)蘆 _)和蘇丹草(Sorghum sudananse，Sorghum drummondi)、樹(shù)皮、木片和木肩、水果果肉、龍 舌蘭殘余物、咖啡粉和來(lái)自榨油廠的廢料例如來(lái)自工廠的菜籽壓餅和污水，來(lái)自造紙廠的 造紙?jiān)?stock)和廢水、廢紙、蔬菜和水果的殘?jiān)?br>[0035] 在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物質(zhì)選自含有纖維素、半纖維素和/或木 質(zhì)素的生物質(zhì)。
[0036] 在本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物質(zhì)選自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、 木材、油籽及它們的混合物。
[0037] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于使生物質(zhì)水解的方法，其包括以下步驟：
[0038] a)使生物質(zhì)與如上定義的酶組合物接觸；
[0039] b)對(duì)至少一部分生物質(zhì)進(jìn)行過(guò)濾并將滲透物分離。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明，"接觸"可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適用于本發(fā)明方法的任何方法 實(shí)施。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物質(zhì)與酶組合物的"接觸"通過(guò)向生物質(zhì)加入酶組合物而實(shí) 施。優(yōu)選地，在接觸后將生物質(zhì)與酶組合物混合。
[0041] 在生物質(zhì)與酶組合物接觸期間，溫度優(yōu)選在25-80°C之間選擇，更優(yōu)選在45-75°C 之間選擇，特別優(yōu)選在48-70°C之間選擇。
[0042] 在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于使生物質(zhì)水解的方法進(jìn)行1分鐘至100小時(shí)、更優(yōu) 選10分鐘至80小時(shí)、特別優(yōu)選30分鐘至40小時(shí)、甚至更優(yōu)選1小時(shí)至30小時(shí)、還特別優(yōu)選2小 時(shí)至20小時(shí)、最優(yōu)選3至12小時(shí)。
[0043]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于使生物質(zhì)水解的方法的步驟(a)進(jìn)行1-80小時(shí)、優(yōu) 選2-40小時(shí)、更優(yōu)選3-20小時(shí)，其中溫度在45-75 °C之間或者48-70 °C之間選擇。
[0044]從而，在進(jìn)行本發(fā)明方法的步驟a)時(shí)能夠選擇不同的溫度進(jìn)行特定的時(shí)間段。在 用于使生物質(zhì)水解的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，方法的步驟a)優(yōu)選在35-45°C、優(yōu)選40°C 的溫度下進(jìn)行1-5小時(shí)、優(yōu)選2-3小時(shí)的第一時(shí)間段；隨后在45-55°C、優(yōu)選50°C的溫度下進(jìn) 行1-5小時(shí)、優(yōu)選2-3小時(shí)的第二時(shí)間段;然后在55-65°C、優(yōu)選60°C的溫度下進(jìn)行1-4小時(shí)、 優(yōu)選1.5-2小時(shí)的第三時(shí)間段。本發(fā)明的酶組合物的特別優(yōu)勢(shì)在于，如前概述，在方法溫度 隨時(shí)間逐漸升高之后，可以實(shí)現(xiàn)效率的進(jìn)一步提高和生物質(zhì)水解。酶組合物優(yōu)選以生物質(zhì) 初始干物質(zhì)的〇. 〇25-8wt %的量，更優(yōu)選以生物質(zhì)干物質(zhì)的0.05-4wt %、特別優(yōu)選以生物質(zhì) 干物質(zhì)的〇. 〇8_2wt %、最優(yōu)選以生物質(zhì)干物質(zhì)的0.1-0.2wt %加入生物質(zhì)中。
[0045]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物質(zhì)的初始干物質(zhì)含量選擇為5_50wt%、優(yōu)選10-45wt%、更優(yōu)選15-42wt%、最優(yōu)選20-40wt%。術(shù)語(yǔ)"干物質(zhì)(d.m.)"是指在使用紅外平衡法 將水和其他揮發(fā)性化合物從新鮮組織中移除之后測(cè)定的質(zhì)量與生物質(zhì)的比例。
[0046] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，將生物質(zhì)同時(shí)與本發(fā)明酶組合物的所有酶混合物和 阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)接觸，然而，也可以使生物質(zhì)逐步 地與本發(fā)明酶組合物的不同酶混合物和阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.99)接觸。
[0047] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于使生物質(zhì)水解的方法進(jìn)行至直到生物質(zhì)中殘留 的干燥不溶性固體的含量低于30wt%、優(yōu)選低于10wt%、甚至更優(yōu)選低于2.5wt%。在進(jìn)一 步優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于使生物質(zhì)水解的方法的步驟(a)進(jìn)行至直到生物質(zhì)中殘留的干 燥不溶性固體的含量為〇? 5-30wt%、優(yōu)選l-10wt%、最優(yōu)選1 ? 5-5wt%。
[0048] 術(shù)語(yǔ)"干燥不溶性固體"是指相對(duì)于包括液體部分和固體部分二者的總樣品的質(zhì) 量，用紅外平衡法將水和其他揮發(fā)性化合物從固體部分中除去之后確定的不溶性固體的質(zhì) 量?？梢酝ㄟ^(guò)例如離心將樣品的固體部分與液體部分分離。
[0049 ] 生物質(zhì)的pH優(yōu)選選擇為3-9、優(yōu)選為4-6、甚至更優(yōu)選為4.5-5.5。
[0050]在用于生物質(zhì)水解的方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，過(guò)濾為超濾或微濾。在特別優(yōu)選的 實(shí)施方式中，通過(guò)使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜進(jìn)一步優(yōu)選為陶瓷膜、不銹鋼膜、合成膜(優(yōu) 選包括聚砜)或者硅膜或含硅膜，或者它們的任意組合。在進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方式中， 膜的截留分子量（cut-off)選自0.5kDa_100kDa、更優(yōu)選lkDa_50kDa、甚至更優(yōu)選2kDa-25kDa。在進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)使用微濾膜進(jìn)行微濾，微濾膜進(jìn)一步優(yōu)選為 陶瓷膜、不銹鋼膜、合成膜(優(yōu)選包括聚砜)或者硅膜或含硅膜，或者它們的任意組合。
【具體實(shí)施方式】
[0051]本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式
[0052]以下實(shí)施方式僅被理解為特別優(yōu)選的實(shí)施方式，而不在任何方面限制本發(fā)明的范 圍。
[0053] A)酶組合物，其包括至少一種選自纖維二糖水解酶(EC 3.2.1. _)、內(nèi)切-1，4-0_葡 聚糖酶(EC 3.2.1.4)、0_葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水 解酶61(GH61 和CBM33)、Expansin、Swollenin、Loosinin和CIP蛋白（EC 3.1 ? 1 .-;CE15)的纖 維素酶，至少一種選自木聚糖酶、木糖苷酶、酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、過(guò)氧化 物酶和氧化酶的半纖維素酶，以及至少一種選自果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶、 甘露糖苷酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶的果膠酶，其中至少一種半纖維素酶包括阿拉伯聚糖降 解活性為至少l〇U/mg蛋白質(zhì)的阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。
[0054] 在這樣特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選的是，阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉 伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性為所述至少一種纖維素酶的纖維素降解活 性的至少8倍，優(yōu)選8-100倍;和/或?yàn)樗鲋辽僖环N果膠酶的蛋白質(zhì)降解活性的至少10倍、 優(yōu)選10-250倍;和/或?yàn)樗鲋辽僖环N半纖維素酶的半纖維素降解活性的至少0.25倍，優(yōu)選 0.25-5 倍。
[0055] B)酶組合物，其包括至少一種選自纖維二糖水解酶(EC 3.2.1. _)、內(nèi)切-1，4-0_葡 聚糖酶(EC 3.2.1.4)的纖維素酶，至少一種選自聚木糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和半乳聚糖 酶的半纖維素酶，以及至少一種選自聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶 的果膠酶，其中至少一種半纖維素酶包括阿拉伯聚糖降解活性為至少l〇U/mg蛋白質(zhì)的阿拉 伯聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。
[0056] 在這樣特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選的是，阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉 伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性為所述至少一種纖維素酶的纖維素降解活 性的至少8倍，優(yōu)選8-100倍;和/或?yàn)樗鲋辽僖环N果膠酶的蛋白質(zhì)降解活性的至少10倍、 優(yōu)選10-250倍;和/或?yàn)樗鲋辽僖环N半纖維素酶的半纖維素降解活性的至少0.25倍，優(yōu)選 0.25-5 倍。
[0057] C)用于使生物質(zhì)水解的方法，其包括以下步驟：
[0058] a)使生物質(zhì)與如上在實(shí)施方式A或B中定義的酶組合物接觸；
[0059] b)使至少一部分生物質(zhì)進(jìn)行過(guò)濾并將滲透物分離，
[0060] 其中方法的步驟a)在35-45°C、優(yōu)選40°C的溫度下進(jìn)行1-5小時(shí)、優(yōu)選2-3小時(shí)的第 一時(shí)間段;隨后在45-55°C、優(yōu)選50°C的溫度下進(jìn)行1-5小時(shí)、優(yōu)選2-3小時(shí)的第二時(shí)間段;隨 后在55-65°C、優(yōu)選60°C的溫度下進(jìn)行1-4小時(shí)、優(yōu)選1.5-2小時(shí)的第三時(shí)間段。
[0061] 并且/或者其中生物質(zhì)選自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、木材、油籽和它們的組合物，
[0062] 并且/或者其中生物質(zhì)的干物質(zhì)含量選自5_50wt%、優(yōu)選10_45wt%、更優(yōu)選15-42wt%，最優(yōu)選20_40wt%。
[0063] 越
[0064] 在本發(fā)明的實(shí)施例中使用以下方法。
[0065] 酶試驗(yàn)
[0066]阿拉伯糖酶-試驗(yàn)
[0067] 用紅色脫支阿拉伯聚糖（Red Debranched Arabinan)作為底物（S-RDAR*， Megazyme International，愛(ài)爾蘭)來(lái)確定阿拉伯糖酶的活性。反應(yīng)混合物(200此)包含100 yL的酶溶液和在50mM乙酸鈉緩沖液(pH 5)中的20mg/mL紅色脫支阿拉伯聚糖（終濃度），其 在50°C下培養(yǎng)0、5、10、15、20、25和30分鐘。在向反應(yīng)混合物加入95%￡切11并進(jìn)一步孵育10 分鐘之后，在A520處測(cè)定釋放的紅色染料的量。一單位(U)的紅色脫支阿拉伯聚糖水解活性 被定義為在上述條件(pH 5、50°C和20mg/mL的底物濃度)下每分鐘釋放1AU(吸收單位)紅色 染料的酶當(dāng)量。
[0068]蛋白質(zhì)-試驗(yàn)
[0069] 根據(jù)Bradford法(Bradford M.M. (1976) .Anal .Biochem.72,248-254)確定蛋白質(zhì) 的濃度。
[0070] 酶組合物
[0071 ]以下酶被用于制備酶組合物：
[0072] 阿拉伯糖酶（E - E A R A B，Megazymes* I n c .，愛(ài)爾蘭）、纖維素酶（ Cdluclast?，Novozymes?，丹麥）、葡糖苷酶（N〇v〇l88?，Novozymes?，丹麥）和 果膠酶（？6。1：；[11611]11：抑§?-1/馨4〇￥0271116 8，丹麥）。如果需要，用5〇11114111；[0011超濾裝置 (1 OkDa截留分子量；Millipote? ? Maidstone，UK)以45ml的乙酸鈉緩沖液（50mM，pH 5)對(duì)酶 進(jìn)行脫鹽和濃縮。
[0073] 參照酶組合物
[0074]使用以下的酶：43 ? 4wt % 的 Celluclast?、6 ? 3wt % 的Novo 188? 和50 ? 3wt % 的 Pectinex UltraSP-L1、?)。這些產(chǎn)品在50mM的NaAc緩沖液(pH 5)中進(jìn)行混合。
[0075]根據(jù)本發(fā)明的酶組合物(EC)
[0076]使用以下的酶：43 ? 4wt % 的 Celluclast?、6 ? 3wt % 的Novo 188? 和50 ? 3wt % 的 Pectinex UltraSP-L?與5wt %的阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(E-EARAB， Megazymes_inc.，愛(ài)爾蘭）。這些產(chǎn)品在50mM的NaAc緩沖液(pH 5)中進(jìn)行混合。
[0077] 實(shí)施例和附圖
[0078]現(xiàn)在通過(guò)以下實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。所有實(shí)施例和附圖僅是出于說(shuō)明 性的目的，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0079]圖1顯示在50°C下與參照酶組合物相比，本發(fā)明的酶組合物(EC)在第一個(gè)5小時(shí)內(nèi) 改善的甜菜根液化。
[0080] 圖2顯示在50°C下與參照酶組合物相比，本發(fā)明的酶組合物(EC)在第一個(gè)5小時(shí)內(nèi) 甜菜根釋放阿拉伯糖的改善。
[0081] 圖3顯示隨著向參照酶組合物中加入阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶，在 50°C下24小時(shí)后甜菜根液化的改善。
[0082]圖4顯示隨著向參照酶組合物中加入阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5_a-L-阿拉伯糖苷酶，在 50°C下24小時(shí)后甜菜根釋放阿拉伯糖的改善。
[0083]實(shí)施例1在50°C下完整甜菜的酶促液化
[0084]完整甜菜材料由采自德國(guó)Sulzemoos的新鮮甜菜根制備。沖洗甜菜根以除去殘留 的土并用Waring搗碎機(jī)切成大約10mmX 10mm的片。甜菜材料具有23%的平均d.m.含量。 [0085] 反應(yīng)混合物（20mL)包含0.1 %E/S的本發(fā)明酶組合物(EC)或者參照酶組合物以及 50mM乙酸鈉緩沖液(pH5)中d.m.含量為15%的甜菜。將反應(yīng)混合物在50°C下孵育30分鐘至5 小時(shí)。在液化和水解之后，將反應(yīng)混合物在3200g下離心30分鐘并將上清液分離和稱(chēng)重。將 lml上清液在95°C下熱失活 10分鐘，用配有.Aminex?_HPX 87(BioRad Labs，Hercules，USA) 離子交換柱（洗脫劑；100 %水，T: 85 °C，流速：0.6ml/min，RI檢測(cè)）的HPLC( Agilen戊，： Germany)分析釋放的糖的量。
[0086]根據(jù)下式測(cè)定液化：
[0088] 結(jié)果示于圖1和圖2。
[0089] 實(shí)施例2:在不同的阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶活性下完整甜菜的酶 促液化
[0090] 反應(yīng)混合物（20mL)包含0.05 % E/S的參照酶混合物和不同量的阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶。通過(guò)加入50mM的乙酸鈉緩沖液(pH 5)將d.m.含量設(shè)定為15 %。反 應(yīng)混合物在50 °C下孵育24小時(shí)。在液化和水解之后，將反應(yīng)混合物在3200g下離心30分鐘， 將上清液分離并稱(chēng)重。將lml上清液在95°C下熱失活10分鐘，并用配有Aminex>HPX 87 (BioRad Labs，Hercules，USA)離子交換柱(洗脫劑；100%水，T:85°C，流速:0? 6ml/min，RI 檢測(cè)）的HPLC( Agilent?，Germany)分析釋放的糖的量。
[0091] 枏據(jù)下式測(cè)定液化：
[0093] 結(jié)果示于圖3和圖4中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶組合物，其包括至少一種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和至少一種果膠酶， 其中所述至少一種半纖維素酶包括阿拉伯聚糖降解活性為至少?ου/mg蛋白質(zhì)的阿拉伯聚 糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中所述至少一種纖維素酶包括至少一種選自纖 維二糖水解酶和內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶的酶。3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中所述至少一種果膠酶包含至少一 種選自果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶、甘露糖苷酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶的酶。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中所述酶組合物還包括至少一種選 自木聚糖酶、木糖苷酶、酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、過(guò)氧化物酶和氧化酶的半纖 維素酶。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中所述阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性為所述至少一種纖維素酶的纖維素降 解活性的至少8倍。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中所述阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性為所述至少一種果膠酶的果膠降解活 性的至少10倍。7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中所述阿拉伯聚糖內(nèi)切-l，5-a_L-阿 拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)的阿拉伯聚糖降解活性為所述至少一種木聚糖酶、木糖苷酶、酯 酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、過(guò)氧化物酶和/或氧化酶的半纖維素降解活性的至少 0.25 倍。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中所述半纖維素酶、纖維素酶和/或 果膠酶通過(guò)在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表達(dá)而制備。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酶組合物用于使生物質(zhì)水解的用途。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述生物質(zhì)選自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、木材、油 籽和它們的組合物。11. 一種用于使生物質(zhì)水解的方法，其包括以下步驟： a) 使所述生物質(zhì)與權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所限定的酶組合物接觸； b) 對(duì)所述生物質(zhì)的至少一部分進(jìn)行過(guò)濾，并將滲透物分離。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述過(guò)濾是超濾或者微濾。
【文檔編號(hào)】C12P19/14GK105849259SQ201480070584
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2014年12月15日
【發(fā)明人】C·賴(lài)辛格, L·勒希爾, M·克勞斯, C·加莫夫
【申請(qǐng)人】科萊恩國(guó)際有限公司