專利名稱：一種植物中硫代葡萄糖苷總量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種植物中硫代葡萄糖苷總量的測(cè)定方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
ニ背景技術(shù)：
硫苷是十字花科植物中普遍存在的一類次生代謝產(chǎn)物，食用富含硫代葡萄糖苷(硫苷)的十字花科蔬菜可預(yù)防胰腺癌、肺癌及直腸癌等多種癌癥的發(fā)生。這一功能主要與硫苷的水解產(chǎn)物ー異硫氰酸鹽類物質(zhì)有關(guān)。植物組織遭受損傷后，硫苷與黑芥子酶接觸，水解產(chǎn)生異硫氰酸鹽、硫氰酸鹽、腈類和惡唑烷等物質(zhì)。目前，國(guó)際上硫苷的測(cè)定普遍采用X射線熒光分析法(XRF) (ISO 9167-2 1994(乜ノ · Rapeseed—Determination of glucosinolates content.Part 2 Method usingX-ray fluorescence spectrometry, 5 pp.)和高效液相色譜法(HPLC)(IS0 10633-1: 1995(L·ノ · Oilseed residues-Determination of glucosinolates content. Part I Methodusing high-performance liquid chromatography, 9 pp.)，雖然這兩種方法精確度高，但其設(shè)備昂貴，樣品前處理較復(fù)雜且耗時(shí)，難以普遍應(yīng)用。此外，硫苷種類有120多種，而可購(gòu)得的硫苷標(biāo)準(zhǔn)品僅sinigrin和glucotropaeolin兩種，故HPLC法還要對(duì)姆種硫苷進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，進(jìn)而提高了實(shí)驗(yàn)難度。其他測(cè)定硫苷的方法有硫酸-百里酚法(Tholen，J.T.，Shen, S. , TruscottS, R. J. ff. The Thymol Method for Glucosinolate Determination[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 1989,49 :157 165.),硫酸根離子沉 疋法(Mcghee,J. E. ,Kirk,L. D.，Mustakas,G. C. Methods for Determining Thioglucosidesin Crambe abyssinica. J. A0CS. 889 (42), 1965.),葡萄糖釋放一酶鑒定法(IS0/TC 34/Sし2 Rapeseed-Determination of glucosinolates Content-Part 2 SpectrometricMethod for Total Glucosinolates by Glucose Release.)以及酶聯(lián)免疫法(Doorn, H. E.,Hoist, G. G. C. KruK, v. N. C. Μ. E. Raaijmakers,Postma,E.Quantitative Determination ofthe Glucosinolates Sinigrin and Progoitrin by Specific Antibody ELISA Assays inBrussels Sprouts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998,46 :793 800.)，這些方法都有一定的局限性，如樣品中硫酸根離子及葡萄糖的干擾，硫酸根離子沉淀法需要高溫煅燒且測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫法的實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、成本高。此外，上述方法均需利用外源酶降解硫苷，酶難以獲得且硫苷降解不徹底。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、精密的總硫苷測(cè)定方法，對(duì)富含硫苷的十字花科蔬菜質(zhì)量控制和綜合開(kāi)發(fā)意義重大。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)硫苷的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在単一硫苷及其水解產(chǎn)物的分離提取方面，如專利(公開(kāi)號(hào)CN101100476A，
公開(kāi)日2008年I月9日)公開(kāi)了“從蘿卜籽中分離4-甲基亞磺酰基-3- 丁烯基硫代葡萄糖苷的方法”，專利(公開(kāi)號(hào)CN101831479A，
公開(kāi)日2010年9月15日)公開(kāi)了 “生物轉(zhuǎn)化制備4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法”等；錢驊等(錢驊，趙伯濤，黃曉德.西蘭花中β_硫代葡萄糖苷總量的測(cè)定[J].中國(guó)野生植物資源，2008，27 (2) 52 57.)通過(guò)3，5- ニ硝基水楊酸法測(cè)定硫苷水解產(chǎn)生的葡萄糖含量來(lái)計(jì)算西蘭花中總硫苷含量，但該法需要外源酶水解硫苷，且其測(cè)定結(jié)果比實(shí)際偏高。褚慶華等(褚慶華，倪昕路.油菜籽及其餅柏中硫代葡萄糖苷總量快速測(cè)定方法的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19 (I) :79 83.)采用葡萄糖釋放-酶鑒定法測(cè)定油菜籽中總硫苷含量，該法過(guò)程繁瑣，仍需要外源酶水解硫苷，且硫苷提取時(shí)需過(guò)離子交換柱，加大了實(shí)驗(yàn)成本。黃繼英等(黃繼英，王綏璋，李素梅.氯化鈀-分光光度法測(cè)定油菜籽硫苷含量的研究.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995, 23 (6) :104 107.)利用氯化把-分光光度法測(cè)定油菜籽硫苷含量，但該法準(zhǔn)確度低，氯化鈀價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受儀器、內(nèi)源酶的鈍化、硫昔提取時(shí)間、稱量及定容的準(zhǔn)確性等影響較大。

發(fā)明內(nèi)容
>技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種精確度高、重現(xiàn)性好、測(cè)定時(shí)間短，無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備和專門的色譜分離條件的硫苷測(cè)定方法，適于普通實(shí)驗(yàn)室及食品企業(yè)對(duì)蔬菜原料及其制品中總硫苷含量的快速檢測(cè)。 >技術(shù)方案本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)(I)硫苷的提取取適量植物樣品，粉碎后，按料液比(g/ml) I 100 I : 200加入こ酸鹽緩沖液(O. 2mol/L, pH 4. 2)，充分研磨勻漿，勻漿液于70 100°C水浴15min滅酶，冷卻后依次按每Ig樣品加入6g聚こ烯吡咯烷酮和60 IOOml醋酸鉛/醋酸鋇混合液，室溫靜置15min后，按姆Ig樣品加入60 IOOml飽和硫酸鈉溶液,振蕩混勻，于IOOOOg離心15min,收集上清液即為硫苷提取液。(2)硫苷的堿降解取上述硫苷提取液2 4ml與等體積2mol/L NaOH或KOH溶液混合，室溫反應(yīng)30min后用37%濃鹽酸中和反應(yīng)液。(3)硫苷的測(cè)定取上述中和后的反應(yīng)液2 4ml與等體積的2mmol/L溶于磷酸鹽緩沖液(O. 2mol/L，pH 7.0)的鐵氰化鉀溶液混合，室溫靜置15min后于15s內(nèi)測(cè)定420nm處吸光值。以烯丙基硫苷(Sinigrin)做硫苷標(biāo)準(zhǔn)曲線,橫坐標(biāo)為烯丙基硫苷濃度,縱坐標(biāo)為420nm處吸光值減少量AA42tl(A42tlmax-A42tl)，經(jīng)計(jì)算測(cè)得樣品中總硫苷含量。A420fflax為加入不含硫苷的提取液時(shí)鐵氰化鉀溶液吸光值，實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照為硫苷提取液與磷酸鹽緩沖液的混合液。(4)硫苷的計(jì)算根據(jù)測(cè)得的AA42tl代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，按下式計(jì)算樣品中總硫苷含量
A-VY=ぐ-..
MY :樣品中硫昔總量(ymol/g)；A :由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得硫苷濃度(μπιο /ml)；V :整個(gè)硫苷提取液體積(ml)；M :所取樣品質(zhì)量(g)。>有益效果
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明精確度高，重現(xiàn)性好，通過(guò)添加聚こ烯吡咯烷酮，醋酸鉛/醋酸鋇混合液及飽和硫酸鈉溶液極大地排除了中其他成分(如酚類，黃酮類，蛋白質(zhì)及糖類等)對(duì)硫苷測(cè)定的干擾。(2)本發(fā)明無(wú)需昂貴儀器、設(shè)備和專門的色譜分離條件，可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定大批量樣品，極大地提高了硫苷測(cè)定效率并降低測(cè)定成本。(3)本發(fā)明所需試劑價(jià)格低廉，且均環(huán)保無(wú)毒，適于普通實(shí)驗(yàn)室及食品企業(yè)對(duì)植物中硫苷的檢測(cè)。
四具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的描述，但實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。 實(shí)施例I取O. 05g甘藍(lán)種子，加入5mlこ酸鹽緩沖液(O. 2mol/L,pH 4. 2)充分研磨勻漿，混合液于80°C水浴15min滅酶，冷卻后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸鉛/醋酸鋇緩沖液，室溫靜置15min后加入I. 5ml飽和硫酸鈉溶液,振蕩混勻，于IOOOOg離心15min,收集上清液即為硫苷提取液。取硫苷提取液2ml與2ml NaOH溶液混合，室溫反應(yīng)30min，而后用37%濃鹽酸中和反應(yīng)液。之后取2ml中和后的反應(yīng)液與2ml 2mmol/L鐵氰化鉀溶液混合，靜置15min后于8000g離心5min,取上清液于15s內(nèi)測(cè)定420nm處吸光值,經(jīng)計(jì)算后得到樣品中總硫昔含量。 實(shí)施例2取O. Ig甘藍(lán)芽苗，加入IOmlこ酸鹽緩沖液(O. 2mol/L,pH 4. 2)充分研磨勻漿，混合液于100°C水浴15min滅酶，冷卻后加入O. 6g聚こ烯吡咯烷酮和5ml醋酸鉛/醋酸鋇緩沖液，室溫靜置15min后加入5ml飽和硫酸鈉溶液，振蕩混勻，于IOOOOg離心15min，收集上清液即為硫苷提取液。取硫苷提取液4ml與4ml NaOH溶液混合，室溫反應(yīng)30min，而后用37%濃鹽酸中和反應(yīng)液。之后取4ml中和后的反應(yīng)液與4ml 2mmol/L鐵氰化鉀溶液混合，靜置15min后于8000g離心5min,取上清液于15s內(nèi)測(cè)定420nm處吸光值,經(jīng)計(jì)算后得到樣品中總硫昔含量。 實(shí)施例3取O. 05g西蘭花，加入5mlこ酸鹽緩沖液(O. 2mol/L, pH 4. 2)充分研磨勻漿，混合液于80°C水浴15min滅酶，冷卻后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸鉛/醋酸鋇緩沖液，室溫靜置15min后加入I. 5ml飽和硫酸鈉溶液，振蕩混勻，于IOOOOg離心15min，收集上清液即為硫苷提取液。取硫苷提取液2ml與2ml NaOH溶液混合，室溫反應(yīng)30min，而后用37%濃鹽酸中和反應(yīng)液。之后取2ml中和后的反應(yīng)液與2ml 2mmol/L鐵氰化鉀溶液混合，靜置15min后于8000g離心5min,取上清液于15s內(nèi)測(cè)定420nm處吸光值,經(jīng)計(jì)算后得到樣品中總硫昔含量。 實(shí)施例4取O. 05g辣根，加入5mlこ酸鹽緩沖液(O. 2mol/L, pH 4. 2)充分研磨勻漿，混合液于80°C水浴15min滅酶，冷卻后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸鉛/醋酸鋇緩沖液，室溫靜置15min后加入I. 5ml飽和硫酸鈉溶液，振蕩混勻，于IOOOOg離心15min，收集上清液即為硫苷提取液。取硫苷提取液2ml與2ml NaOH溶液混合，室溫反應(yīng)30min，而后用37%濃鹽酸中和反應(yīng)液。之后取2ml中和后的反應(yīng)液與2ml 2mmol/L鐵氰化鉀溶液混合，靜置15min后于8000g離心5min,取上清液于15s內(nèi)測(cè)定420nm處吸光值,經(jīng)計(jì)算后得到樣品中總硫昔含量。 實(shí)施例5取O. 05g花椰菜,加入5mlこ酸鹽緩沖液(O. 2mol/L,pH 4. 2)充分研磨勻衆(zhòng),混合液于90°C水浴15min滅酶，冷卻后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸鉛/醋酸鋇緩沖液，室溫靜置15min后加入I. 5ml飽和硫酸鈉溶液,振蕩混勻，于IOOOOg離心15min,收集上清液即為硫苷提取液。取硫苷提取液2ml與2ml KOH溶液混合，室溫反應(yīng)30min，而后用37%濃鹽酸中和反應(yīng)液。之后取2ml中和后的反應(yīng)液與2ml 2mmol/L鐵氰化鉀溶液混合，靜置15min后于8000g離心5min,取上清液于15s內(nèi)測(cè)定420nm處吸光值,經(jīng)計(jì)算后得到樣品中總硫昔含量。 以上詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方式，但這只是為了便于理解而舉的實(shí)例，不應(yīng)被視為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。同樣，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員均可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其較佳實(shí)施例的描述，做出各種可能的等同改變或替換，但所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.ー種植物中硫代葡萄糖苷總量的測(cè)定方法，其特征在干以植物為試材，原料經(jīng)粉碎后，用こ酸鹽緩沖液勻漿，勻漿液高溫水浴滅酶后，依次添加聚こ烯吡咯烷酮、醋酸鉛/醋酸鋇混合液及飽和硫酸鈉溶液，經(jīng)振蕩混勻后離心制得硫苷提取液。硫苷提取液經(jīng)堿降解、37%濃鹽酸中和，中和液再與鐵氰化鉀溶液反應(yīng)后，用分光光度計(jì)在420nm處測(cè)定鐵氰化鉀吸光值的減少量。以烯丙基硫苷(Sinigrin)為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得到植物中總硫昔含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，ー種植物中硫代葡萄糖苷總量的測(cè)定方法包括以下步驟 (1)硫昔的提取 取適量植物樣品，粉碎后，按料液比(g/ml)l 100 I : 200加入こ酸鹽緩沖液(O. 2mol/L, pH 4. 2)，充分研磨勻漿，勻漿液于70 100°C水浴15min滅酶，冷卻后依次按每Ig樣品加入6g聚こ烯吡咯烷酮和60 IOOml醋酸鉛/醋酸鋇混合液，室溫靜置15min后，按姆Ig樣品加入60 IOOml飽和硫酸鈉溶液,振蕩混勻，于IOOOOg離心15min,收集上清液即為硫苷提取液。
(2)硫苷的堿降解 取上述硫苷提取液2 4ml與等體積2mol/L NaOH或KOH溶液混合，室溫反應(yīng)30min后用37%濃鹽酸中和反應(yīng)液。
(3)硫苷的測(cè)定 取上述中和后的反應(yīng)液2 4ml與等體積的2mmol/L溶于磷酸鹽緩沖液(O. 2mol/L,pH7.O)的鐵氰化鉀溶液混合，室溫靜置15min后于15s內(nèi)測(cè)定420nm處吸光值。以烯丙基硫苷(Sinigrin)做硫苷標(biāo)準(zhǔn)曲線,橫坐標(biāo)為烯丙基硫苷濃度,縱坐標(biāo)為420nm處吸光值減少量AA42tl(A42tlmax-A42tl)，經(jīng)計(jì)算測(cè)得樣品中總硫苷含量。A420fflax為加入不含硫苷的提取液時(shí)鐵氰化鉀溶液吸光值，實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照為硫苷提取液與磷酸鹽緩沖液的混合液。
(4)硫苷總量計(jì)算 根據(jù)測(cè)得的AA42tl代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，按下式計(jì)算樣品中總硫苷含量 Y= AV M Y:樣品中硫昔總量(umol/g)； A :由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得硫苷濃度(μπιο /ml)； V:整個(gè)硫苷提取液體積(ml)； M :所取樣品質(zhì)量(g)。
3.如權(quán)利要求1，2所述ー種植物中硫代葡萄糖苷總量的測(cè)定方法，其特征在于植物可以是甘藍(lán)、西蘭花、結(jié)球甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、花椰菜、芥菜、球莖甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、蘿卜、蕪菁和辣根等植物的種子，也可以是這些植物的芽苗及植株等營(yíng)養(yǎng)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物中硫代葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱硫苷)總量的測(cè)定方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征是以植物為試材，原料經(jīng)粉碎后，用乙酸鹽緩沖液勻漿，勻漿液高溫水浴滅酶后，依次添加聚乙烯吡咯烷酮、醋酸鉛/醋酸鋇混合液及飽和硫酸鈉溶液，經(jīng)振蕩混勻后離心制得硫苷提取液。硫苷提取液經(jīng)堿降解、37％濃鹽酸中和，中和液再與鐵氰化鉀溶液反應(yīng)后，用分光光度計(jì)在420nm處測(cè)定鐵氰化鉀吸光值的減少量。以烯丙基硫苷(Sinigrin)為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得到植物中總硫苷含量。本方法精確度高、重現(xiàn)性好、測(cè)定時(shí)間短，與高效液相色譜(HPLC)法相比，無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備和專門的色譜分離條件，適于普通實(shí)驗(yàn)室及食品企業(yè)對(duì)蔬菜原料及其制品中總硫苷含量的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102692387SQ201210197340
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者王志英, 郭強(qiáng)暉, 韓永斌, 顧振新, 顧穎娟 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)