一種重組質(zhì)粒及其在降解纖維素原料中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒及其在降解纖維素原料中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，由于石油的日益枯竭，玉米秸桿、麥桿和甘蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化成原油可 替代液體燃料（特別是生物乙醇）生產(chǎn)技術(shù)的研發(fā)被高度重視。該工藝，首先采用水熱處理 法、稀酸法、SPORL法等物理化學(xué)方法處理秸桿，然后用纖維素酶制劑酶解預(yù)處理后的原料， 轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性單糖，然后添加酵母、梭菌等微生物發(fā)酵成乙醇、丁醇等液體燃料/化工產(chǎn) 品。
[0003] 然而，市售的酶制劑大部分來(lái)源于里氏木霉發(fā)酵而得，酶系組成中beta-葡萄糖 苷酶活性較低，造成酶解過(guò)程產(chǎn)生較多的纖維二糖，阻礙了纖維素的有效降解，導(dǎo)致單糖轉(zhuǎn) 化率較低。同時(shí)，酵母不能利用纖維二糖，因此導(dǎo)致最終乙醇發(fā)酵得率也不高。
[0004] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102787104A(申請(qǐng)?zhí)?01210260079. 2)公開了一種高活性復(fù)合纖 維素酶及其制備和在木質(zhì)纖維酶解糖化中的應(yīng)用方法。利用爪哇正青霉ZN - 205進(jìn)行搖 瓶發(fā)酵產(chǎn)β -葡萄糖苷酶，最佳產(chǎn)酶條件：初始pH為6.0,蛋白胨濃度為0.75%，微晶纖 維素濃度為2. 5%，吐溫一 80的添加量為0. 05%，培養(yǎng)溫度為28°C，250ml三角瓶裝液量為 100ml，搖床轉(zhuǎn)速為175r/min，接種量為5%;最高β -葡萄糖苷酶活為2. 312IU/ml。將爪 哇正青霉ZN - 205生產(chǎn)的β -葡萄糖苷酶與里氏木霉Rut C - 30生產(chǎn)的纖維素酶進(jìn)行 酶系復(fù)合，獲得最優(yōu)β -葡萄糖苷酶活/濾紙酶活比值為1.4。該申請(qǐng)需要采用兩種不同 的微生物進(jìn)行生產(chǎn)酶液，然后進(jìn)行酶系復(fù)合。不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102286446A(申請(qǐng)?zhí)?01110162149. 6)公開了一種用于玉米芯廢 渣轉(zhuǎn)化制備單糖的復(fù)合酶，其包含：纖維素酶10~48FPU/g底物，果膠酶0~17. 2IU/g底 物，表面活性劑0~1% (v/v)。該發(fā)明利用不同來(lái)源纖維素酶的復(fù)配及其與表面活性劑的 協(xié)同作用，降低了生產(chǎn)中的用酶成本，大大提高了玉米芯廢渣的糖化率，高達(dá)74. 8%。
[0006] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102071223A(申請(qǐng)?zhí)?00910172724. 3)公開了一種秸桿類原料的 復(fù)合酶解方法，秸桿類原料先經(jīng)稀酸水解降解木質(zhì)素，然后加入木聚糖酶、纖維素酶、淀粉 酶、果膠酶和β -葡聚糖酶，用酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)調(diào)整混合物pH為4. 3~5. 5,然后在 40~55°C下進(jìn)行酶解24~72h。本發(fā)明采用復(fù)合酶的方法使秸桿類酶解轉(zhuǎn)化為還原糖，選 擇合適的復(fù)合酶配比，使得酶之間產(chǎn)生相互作用，使得水解達(dá)到最大化，酶解產(chǎn)生的還原糖 濃度高，得糖率高，酶解條件溫和，對(duì)后期發(fā)酵無(wú)不良影響，不會(huì)抑制后期發(fā)酵的菌種生長(zhǎng)， 發(fā)酵時(shí)的乙醇產(chǎn)量高。但上述技術(shù)方案需要將幾種酶制劑木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果 膠酶和β-葡聚糖酶進(jìn)行酶系復(fù)配。
[0007] 目前，制備纖維素酶和半纖維素酶往往利用絲狀真菌進(jìn)行生產(chǎn)，而改造絲狀真菌 工業(yè)菌株提高纖維素酶和半纖維素酶酶活的方法有誘變育種技術(shù)，原生質(zhì)體融合技術(shù)，基 因重排技術(shù)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組質(zhì)粒及其在降解纖維素原料中的應(yīng) 用。通過(guò)改造絲狀真菌工業(yè)菌株，提高酶系中beta-葡萄糖苷酶酶活性，改善酶系的成分， 從而提高木質(zhì)纖維素制備可發(fā)酵單糖以及酒精產(chǎn)率的方法。
[0009] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0010] 一種重組質(zhì)粒PUG6-XYN2-GLU-HPH，其特征在于，利用NotI酶將pUG6質(zhì)粒切成線 性質(zhì)粒，然后將PCR擴(kuò)增獲得的里氏木霉木聚糖解酶II啟動(dòng)子（XYN2upStream)、β -葡萄 糖苷酶的編碼基因（Glucosidase)以及終止子（Terminator)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的編碼基 因片段（HPH)和里氏木霉木聚糖解酶II終止子（XYN2downstream)依次與上述線性質(zhì)粒連 接，制得重組質(zhì)粒PUG6-XYN2-GLU-HPH(如圖1所示）；
[0011] 所述葡萄糖苷酶的編碼基因核苷酸序列（Glucosidase)如SEQ ID NO. 1所 示，其終止子（Terminator)如SEQ ID NO. 5所示；里氏木霉木聚糖解酶II啟動(dòng)子的核苷 酸序列（XYN2upStream)如SEQ ID NO. 2所示；里氏木霉木聚糖解酶II終止子的核苷酸序 列（XYN2downstream)如SEQ ID NO. 3所示；潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的編碼基因的核苷酸序列 (HPH)如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述連接采用Clotech公司的In-Fusion PCR Cloning試劑 盒進(jìn)行。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的重組質(zhì)粒PUG6-XYN2-GLU-HPH核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0014] -株重組工程菌，以里氏木霉（Trichoderma reesei)QM9414或其變異菌種為原始 菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化上述重組質(zhì)粒PUG6-XYN2-GLU-HPH后制得。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述里氏木霉（Trichoderma reesei)QM9414來(lái)源于美國(guó)模式 培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC)，菌種保藏號(hào)ATCC 26921。
[0016] 上述重組工程菌在降解纖維素原料中的應(yīng)用。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的降解為利用上述重組工程菌經(jīng)培養(yǎng)后制備纖維素酶解 液，然后利用纖維素酶解液處理纖維素原料。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的纖維素酶解液，按如下步驟制備：
[0019] (1)取上述重組工程菌，接種于種子培養(yǎng)基中，經(jīng)種子培養(yǎng)后，制得種子液；
[0020] (2)將步驟（1)制得的種子液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，制得發(fā)酵液；
[0021] 所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
[0022] 玉米芯粉1. 0~3. 0%，蛋白胨0. 5~2. 0%，麩皮1. 0~4. 0%，微晶纖維素0~ 1. 〇%，硝酸鈉0~1. 〇%，硫酸銨〇· 1~〇· 5%，磷酸二氫鉀0· 1~0· 5%，硫酸鎂0· 04~ 0. 1 %，尿素0~0. 4%，吐溫800~0. 4%，余量水；
[0023] (3)將步驟（2)制得的發(fā)酵液經(jīng)固液分離，取上清，制得纖維素酶解液。
[0024] 所述步驟（1)中的種子培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
[0025] 葡萄糖0· 5~2. 0%，蛋白胨0· 5~2. 0%，麩皮L 0~4. 0%，硝酸鈉 0~L 0%， 硫酸銨〇· 1~0.5%，磷酸二氫鉀0· 1~0.5%，硫酸鎂0.04~0· 1%，尿素0~0.4%，余 量水。
[0026] 所述步驟（1)中，種子培養(yǎng)條件為：在25~32°C的條件下，培養(yǎng)20~30小時(shí)。
[0027] 所述步驟⑵中，按體積百分比5~10%的比例進(jìn)行接種。
[0028] 所述步驟（2)中，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：在25~30°C的條件下，培養(yǎng)5~7天。
[0029] 所述步驟（3)中，固液分離為離心，條件為10000~15000r/min離心12~18min。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述利用纖維素酶解液處理纖維素原料的步驟如下：
[0031] (i)對(duì)含纖維素的生物質(zhì)原料進(jìn)行前處理，按15~25% (質(zhì)量百分比）固形物終 濃度將前處理后的生物質(zhì)原料和水進(jìn)行混合，然后調(diào)節(jié)PH值范圍至5. 0~6. 0,再按每克 絕干生物質(zhì)原料添加8~15FPU的比例加入纖維素酶解液，在45~50°C溫度下振蕩反應(yīng) 32~40h，經(jīng)固液分離，制得水解液；
[0032] (ii)取步驟⑴制得的水解液，按照質(zhì)量百分比1~5%的比例接種高溫酵母，在 28~32°C進(jìn)行厭氧發(fā)酵培養(yǎng)45~50小時(shí)，經(jīng)純化分離，制得乙醇。
[0033] 所述步驟（i)中，前處理為酸處理、堿處理、水熱處理、亞臨界水處理、微粉碎處 理、蒸煮處理、干燥處理、亞硫酸鹽處理、水熱處理；優(yōu)選，亞硫酸鹽處理、水熱處理、稀硫酸 處理。
[0034] 所述步驟⑴中，固液分離為離心分離，離心分離條件為8000rpm離心30min。
[0035] 所述步驟（ii)中，純化分離為蒸餾分離。
[0036] FPU是指濾紙酶活力單位。向試管中加入50mg濾紙（用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）， I. 5ml醋酸緩沖液（50mM，ρΗ4· 8)，加入(λ 5ml酶液，50°C水浴60min，后加入2. 5ml DNS終 止反應(yīng)，煮沸10分鐘后，定容到25ml，搖勻后OD54ffI定吸光度值。截取在60min釋放2. Omg 葡萄糖當(dāng)量的還原糖（轉(zhuǎn)化率4% )計(jì)算濾紙酶活力（FPA)，單位以FPU表示。
[0037] 有益效果
[0038] 1、本發(fā)明首次構(gòu)建了能夠表達(dá)高酶活的beta-葡萄糖苷酶的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì) 粒表達(dá)的高酶活beta-葡萄糖苷酶能夠改善纖維素酶降解木質(zhì)纖維素的效率。
[0039] 2、將本發(fā)明構(gòu)建的高酶活的beta-葡萄糖苷酶的重組質(zhì)粒導(dǎo)入絲狀真菌里氏木 霉（Trichoderma reesei)QM9414(ATCC26921)中，能夠有效提高beta-葡萄糖苷酶酶活性， 改善酶系的成分，提高纖維素酶降解木質(zhì)纖維素的效率及酒精產(chǎn)率。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為里氏木霉重組表達(dá)載體PUG6-XYN2-GLU-HPH的構(gòu)建圖；
[0041] 其中：XYN2upstream為啟動(dòng)子；Glucosidase為來(lái)源于黑曲霉的β -葡萄糖苷酶 表達(dá)的基因；Terminator和XYN2downstream為終止子；HPH為潮霉素基因篩選標(biāo)記盒； BamHI、HindIII、BglII 和 NotI 為酶切位點(diǎn)；
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說(shuō)明