一種類芽孢桿菌β?1,3?1,4?葡聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種類芽孢桿菌β?1,3?1,4?葡聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)具有β?1,3?1,4?葡聚糖酶活性，比酶活力431.8U·mg?1，最適反應(yīng)pH為6.0，在pH 3.5—9保持穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度為55℃，在55℃以下保持較高酶活力，具有較好的耐熱性；底物專一性較強(qiáng)，具有良好的β?1,3?1,4?葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)；在食品、飼料行業(yè)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。該蛋白質(zhì)在麥芽糖化過(guò)程中可以顯著降低粘度、縮短過(guò)濾時(shí)間；在燕麥麩皮β?葡聚糖水解過(guò)程中可以顯著提高β?葡寡糖得率,對(duì)外源酶失活的燕麥麩皮水解時(shí)，可以獲得相對(duì)含量較高的葡三糖和葡四糖；作為β?1,3葡聚糖酶還可以用于制備可得然寡糖。
【專利說(shuō)明】
一種類芽孢桿菌β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種類芽孢桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶及其編 碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] β-葡聚糖酶是一類能夠降解谷物中β-葡聚糖的酶類，包括β-1，3-1，4-葡聚糖酶 (地衣多糖酶，EC 3.2.1.73)、β-1，4-葡聚糖酶(纖維素酶，EC 3.2.1.4)、β-1，3-葡聚糖酶 (昆布多糖酶，EC 3.2.1.39)和 β-l, 3(4)-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6)(McCarthy，et al·， International Journal of Biological Macromolecules，2003，33:141-148) 〇其中，β_1， 3- 1，4-葡聚糖酶具有嚴(yán)格的底物特異性，其水解β-葡聚糖的3-0-取代葡萄糖殘基上的β-1， 4- 糖苷鍵，生成主要包含3-0-β-纖維二糖基-D-葡萄糖和3-0-β-纖維三糖基-D-葡萄糖的水 解產(chǎn)物（Yang,et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56:5345-5351)〇
[0003] 0-1，3-1，4-葡聚糖酶廣泛應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)和飼料工業(yè)中。在啤酒生產(chǎn)中，0_1，3-1，4-葡聚糖酶能夠?qū)Ｒ环纸獯篼湨?葡聚糖，使大麥胚乳細(xì)胞壁疏松，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物外溢， 進(jìn)而提高大麥的利用率，同時(shí)使糖化醪粘度降低，大大減少麥芽汁的過(guò)濾時(shí)間，使啤酒產(chǎn)量 增加，改善了啤酒的混池度，提高啤酒的質(zhì)量(Furtado，et al ·，Process Biochemistry， 2011,46(5): 1202-1206.)。在飼料工業(yè)中，β-l，3-l，4-葡聚糖酶能特異性地將β-1，3-l，4-葡聚糖水解為低分子糖，使植物細(xì)胞壁的構(gòu)造遭到破壞，進(jìn)而釋放出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。由于不具有 親水性和黏性，降解后的葡聚糖在畜禽腸道中不會(huì)發(fā)生膨脹黏連，因此使食糜的消化率 和飼料的能量利用率均有所提高（Smits，et al.，Worlds Poultry Science Journal 1996,52(2) :203-221 )。另外，β-葡聚糖水解物可以提高腸道益生菌的生長(zhǎng)(Jaskari，et al.Applied Microbiology and Biotechnology, 1998,49(2):175_181)，還可以減緩衰老， 改善營(yíng)養(yǎng)物吸收速率并提供抗高膽固醇作用(Bode，2009，67( 11): S183-S191)。
[0004] 由于β-l，3-1，4-葡聚糖酶具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)其進(jìn)行了大 量研究。目前，已從多種微生物中分離并鑒定了 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其中大多數(shù)來(lái)源于細(xì) 菌，包括芽孢桿菌（Bacillus species)，如枯草芽孢桿菌（Β · subtil is) (Tang，et al ·， Bioresource Technology ,2004 ,93(2) : 175-181)、解淀粉芽抱桿菌 (Β · amyloliquefaciens) (Hofemeister，et al ·，Gene，1986,49:177-187)、地衣芽抱桿菌 (B.licheniformis)(Chaari,et al.,Process Biochemistry,2012,47(3):509-516)等；或 其它細(xì)菌，如熱纖梭菌（Clostridium thermocellum)(Ribeiro，et al·,British Poultry Science ,2012,53(2) :224-234)等。在一些真菌中也分離和鑒定了β-1,3-1,4-葡聚糖酶，如 嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila) (Yang,et al. , Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008,56( 13): 5345-5351)、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei) (Tang，et al.，Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(9):2354-2361)等。
[0005] 為了提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的產(chǎn)量和熱穩(wěn)定性，在不同的宿主和載體中表達(dá)了 細(xì)菌或真菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因。例如，在大腸桿菌中表達(dá)了來(lái)自枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)(Qiao,et al.,Applied Biochemistry and Biotechnology,2009,152(2): 334-342)、解淀粉芽抱桿菌（B.amyloliquefaciens)(Sun, et al·, Annals of Microbiology ,2012,62(3): 1235-1242)、多粘類芽抱桿菌（Paenibacci llus polymyxa) (Wen，et al.，Scientia Agricultura Sinica,2010,43(22):4614-4623)的β_1,3-1,4-葡 聚糖酶基因；在畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)了來(lái)自枯草芽孢桿菌(B. subtilis) (Qiao，et al.，Biologia, 2010,65(2):191-196)、產(chǎn)琥泊酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes)(Huang,et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2008,78(1): 95-103)和嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila)(Hua,et al·,Applied Microbiology and Biotechnology ,2010,88(2) :509-518)的β_1,3-1,4-葡聚糖酶基因。一些專利公開了 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因及其表達(dá)。例如，在CN 104561060 Α中公開了來(lái)自枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因及其在大腸桿菌中的表達(dá);在CN 101775385 A中 公開了來(lái)自嗜熱擬青霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其在畢赤酵母(P.pastoris)中的表 達(dá)。為了使β-1，3-1，4-葡聚糖酶能夠更好的適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件，一些專利進(jìn)一步公開了改 善β-1，3-1，4_葡聚糖酶的性質(zhì)的方法。例如，CN 103045560 Α公開了定向突變獲得的酸性 β-l，3-1，4-葡聚糖酶，在保持其它酶學(xué)性質(zhì)基本不變的情況下，其最適pH由7.0改變?yōu)?.0; CN 101684475 A中公開了在畢赤酵母（P.pastoris)中表達(dá)由解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)P-l ,3-1,4-葡聚糖酶基因的氨基端107個(gè)氨基酸殘基和浸麻芽孢 桿菌(B.macerans)P-l ,3-1,4-葡聚糖酶基因的羧基端107個(gè)氨基酸殘基組成的雜合基因， 使其在酸性環(huán)境中的熱穩(wěn)定性大大高于單一野生型葡聚糖酶。
[0000]類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)是自然界廣泛分布的一類兼性厭氧細(xì)菌，目前 已報(bào)道從Paenibacillus sp.S09(Cheng，et al.，2014，Biotechnology Letters,36:797-803)、Paenibacillus sp.X4(Na，et al.，2015，Biotechnology Letters,37:643-655)和 Paenibacillus sp.F_40(Yang，et al.,Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007，17 : 58-66)中克隆和表達(dá)了一些β_1，3-1，4-葡聚糖酶。Osman等人（Osman，et al ·， International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2006,56: 1509-1514)從噴氣推進(jìn)實(shí)驗(yàn)室飛行器組裝廠（Jet Propulsion Laboratory Spacecraft Assembly Facility)分離出了巴倫葛茲類芽抱桿菌(Paenibacillus barengoltzii)。本研 究組從南海海水中分離出了巴倫葛茲類芽孢桿菌CAU904,并從中克隆和表達(dá)了兩種幾丁質(zhì) 酶（Yang，et al.，F(xiàn)ood Chemisty，2016，192:1041_1048;Fu et al.，Biotechnology for Biofuels,2014,7)〇
[0007] 盡管目前已開展了許多β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究，但由于食品、飼料等行業(yè)生 產(chǎn)的實(shí)際需要，克隆和表達(dá)具有良好酶學(xué)性質(zhì)和底物特異性的新型β-1，3-1，4-葡聚糖酶對(duì) 上述行業(yè)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種類芽孢桿菌β-l，3-1，4-葡聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所提供的β-1，3_1，4-葡聚糖酶，來(lái)自巴倫葛茲類芽孢桿菌(Paenibacillus barengoltzii)，是以下（1)或(2)或(3)或(4)的蛋白質(zhì)：
[0010] ⑴序列表序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0011] (2)序列表序列2自氨基末端第31至416位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0012] (3)在所述(2)的羧基末端添加 Poly-His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)；具體為在所述(2)的羧基 末端添加了 ΑΑΑΙ?ΗΗΗΗΗΗ的蛋白質(zhì)；
[0013] (4)將所述（1)或(2)或(3)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加所獲得的具有相同功能的由（1)或(2)或(3)衍生的蛋白質(zhì)。
[0014] 為了使（1)或（2)或（3)或(4)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表序列2所示的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0015] 表1標(biāo)簽的序列
[0016]
[0017]上述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述蛋白 質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼 子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo) 簽的編碼序列得到。
[0018] 本發(fā)明保護(hù)上述蛋白質(zhì)的編碼基因。
[0019] 所述編碼基因?yàn)橐韵?a)或(b)或(c)或(d)的DNA分子：
[0020] (a)序列表序列1所示的DNA分子；
[0021] (b)序列表序列1的第91至1248位所示的DNA分子；
[0022] (c)在嚴(yán)格條件下與（a)或（b)所限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分 子；
[0023] (d)與(a)或(b)或(c)限定的DNA分子具有至少75%的序列同一性且編碼所述蛋白 質(zhì)的DNA分子。
[0024] 上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0025]本發(fā)明保護(hù)含有以上任一所述編碼基因的重組載體（即重組質(zhì)粒）、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞系或重組菌。
[0026] 所述重組載體具體可為在載體pET_28a( + )的Nco I和Not I位點(diǎn)間插入了序列表 序列1中第91至1248位所示的DNA片段后獲得側(cè)重組質(zhì)粒；
[0027]所述重組菌具體可為含有所述重組載體的大腸桿菌DH5a或大腸桿菌BL21(DE3)。
[0028] 本發(fā)明保護(hù)以上任一所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
[0029] 本發(fā)明保護(hù)以上任一所述蛋白質(zhì)在作為β-1，3_1，4-葡聚糖酶中的應(yīng)用。
[0030] 該應(yīng)用包括對(duì)β-l，3-1，4-葡聚糖進(jìn)行水解的步驟；
[0031]和/或，所述β-1，3_1，4-葡聚糖為大麥β-葡聚糖、燕麥β-葡聚糖和地衣多糖中的至 少一種。
[0032]本發(fā)明保護(hù)以上任一所述蛋白質(zhì)在作為β-1，3_葡聚糖酶中的應(yīng)用。
[0033] 該應(yīng)用包括對(duì)β-l，3-葡聚糖進(jìn)行水解的步驟；
[0034] 和/或，所述β-1，3_葡聚糖為昆布多糖和可得然多糖中的至少一種。
[0035] 在上述應(yīng)用中，
[0036]所述水解的pH 值可為3-10.5，或3.5-9.0，如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5〇
[0037]和/或，所述水解的溫度可為40-75 °C，或40-55 °C，如40°C、45 °C、50°C、55 °C、60 Γ、65Γ、70Γ、75Γ。
[0038] 在上述應(yīng)用中，所述應(yīng)用為在麥芽糖化中的應(yīng)用；
[0039] 和/或，在燕麥麩皮水解中的應(yīng)用；
[0040] 和/或，在制備可得然寡糖中的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明保護(hù)所述編碼基因及所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制 備β-l，3-1，4-葡聚糖酶和/或β-l，3-葡聚糖酶中的應(yīng)用。
[0042]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)（在實(shí)施例中具體為重組蛋白R(shí)_PbBglul6A)具 有β-l，3-1，4-葡聚糖酶活性，具有431.8U · mg4的比酶活力，最適反應(yīng)pH為6.0，并且在較寬 的pH范圍內(nèi)（pH3.5-9)保持穩(wěn)定;最適反應(yīng)溫度為55°C，并且在55°C以下保持較高酶活力， 具有較好的耐熱性;底物專一性較強(qiáng)，在麥芽糖化過(guò)程中加入該蛋白質(zhì)可以顯著降低粘度、 縮短過(guò)濾時(shí)間；在燕麥麩皮β-葡聚糖水解過(guò)程中加入該蛋白質(zhì)，可以顯著提高β-葡寡糖得 率，該蛋白質(zhì)對(duì)外源酶失活的燕麥麩皮水解時(shí)，可以獲得相對(duì)含量較高的葡三糖和葡四糖； 另外，該蛋白質(zhì)作為β_1，3葡聚糖酶還可以用于制備可得然寡糖。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)具有 良好的β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì);在食品、飼料行業(yè)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0043]本發(fā)明有如下附圖：
[0044]圖1為SDS-PAGE電泳圖，其中泳道Μ:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道1:粗酶液;泳道2:純 化的重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的溶液。
[0045] 圖2為重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的最適pH測(cè)定結(jié)果。
[0046] 圖3為重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。
[0047]圖2和圖3中的"?"表示檸檬酸-檸檬酸緩沖液；" ▲"表示MES緩沖液；" "表示 MOPS緩沖液；"〇"表示Tris-HCl緩沖液；"□"表示甘氨酸-NaOH緩沖液。
[0048]圖4為重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的最適溫度測(cè)定結(jié)果。
[0049] 圖5為重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的溫度穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。
[0050] 圖6為不同水解時(shí)間下重組蛋白R(shí)-PbBglul6A水解燕麥麩皮和內(nèi)源酶失活的燕麥 麩皮的葡寡糖得率測(cè)定結(jié)果。其中，"?"表示加入150U/g燕麥麩皮的重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)，燕麥麩皮水解后β-葡寡糖得率；"〇"表示加入150U/g燕麥麩皮的重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)，內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮水解后β-葡寡糖得率；"·"表示不加重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)，燕麥麩皮水解后β-葡寡糖得率；"□"表示不加重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)，內(nèi)源 酶失活的燕麥鼓皮水解后β_匍寡糖得率。
[0051 ]圖7為重組蛋白R(shí)-PbBglul6A水解燕麥麩皮后水解產(chǎn)物的薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)分析結(jié)果。其中，G1、G2、G3和G4分別表示葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖 和纖維四糖;Gn表示寡糖標(biāo)準(zhǔn);0B+表示加入重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)燕麥麩皮的水解產(chǎn)物； 0B-表示未加重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)燕麥麩皮的水解產(chǎn)物；D0B+表示加入重組蛋白R(shí)-PbBg lu 16A時(shí)內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮的水解產(chǎn)物。
[0052]圖8為重組蛋白R(shí)-PbBglul6A水解可得然多糖后水解產(chǎn)物的TLC分析結(jié)果。其中， 61、1^、1^、1^丄5和1^分別表示葡萄糖、昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖、昆布五糖和昆布六 糖；Μ表示寡糖標(biāo)準(zhǔn)；0、15、30、60、120、240min分別指在不同水解時(shí)間下重組蛋白R(shí)-pbBglul6A水解可得然多糖的水解產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0053]以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0054] 以下實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明均為可從商業(yè)途徑獲得。
[0055] 以下實(shí)施例中，參照 Yang 等（Yang, et al·，Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2014,41(10): 1487-1495)的方法，測(cè)定β-l，3_1，4_葡聚糖 酶的酶活力：添加50yL 1 % (w/v)的大麥β-葡聚糖于小試管中，55°C預(yù)熱3min，然后加入150 yL適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液（即待測(cè)蛋白的溶液），55°C反應(yīng)10min后加入200yL DNS試劑(每1L 水溶液包含1(^3,5-二硝基水楊酸(0吧），1(^似0!1和28苯酚），煮沸151^11后加入20(^飽 和酒石酸鉀鈉溶液，冷卻后于540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)。
[0056] β-l，3-1，4-葡聚糖酶活力單位的定義為:在上述條件下每分鐘水解大麥β-葡聚糖 生成Ιμπιο?葡萄糖所需要的酶量。
[0057]巴倫葛茲類芽抱桿菌（Paenibacillus barengoltzii)CAU904在文獻(xiàn)"Fu X.et al.，Biotechnology for Biofuels.2014,7:174"中公開，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。 [0058] 瓊脂糖Ni-IDA親和柱購(gòu)自美國(guó)GE公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-0575-01。
[0059] 實(shí)施例1.基因 PbBglul6A及蛋白PbBglul6A的獲得
[0060]設(shè)計(jì)上游引物 PbBglul6AncoF:
[0061 ] 5 ' -TGACTCCATGGGCGCTCCCAACTGGCAGTTG-3 '（下劃線示Nco 頂每切位點(diǎn)，下劃線后 前兩個(gè)堿基用來(lái)補(bǔ)全目的載體上的甘氨酸讀碼框，第3位至最后堿基與序列表序列1中第 91一108位相同）；
[0062] 和下游引物 PbBglul6AnotR:
[0063] 5 ' -TGACTGCGGCCGCGTTTACCTTCGTAAACATCCACTT-3 '（下劃線示Not I酶切位點(diǎn)，下 劃線后序列與序列表序列1中的第1225-1248位相匹配）；
[0064]并以巴倫葛茲類芽孢桿菌CAU904的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增成熟蛋白的氨基酸 的編碼基因序列。
[0065] PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸80s，循環(huán) 35次；最后72°C后延伸5min。
[0066] PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，以Nco I和Not I雙酶切。將該雙酶切后的 產(chǎn)物與經(jīng)相同雙酶切過(guò)的原核表達(dá)載體pET-28a(+)的載體骨架片段以T4 DNA連接酶進(jìn)行 連接，轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌DH5a。挑選菌落PCR(PCR所用的引物和擴(kuò)增條件與本段前述PCR 的相同）驗(yàn)證為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子測(cè)序。
[0067]結(jié)果：陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒為在載體pET_28a( + )的Nco I和Not I位點(diǎn)間插入 了序列表序列1中第91至1248位所示的DNA片段，所述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即重組菌A為含有所述重 組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a。
[0068] 將序列表序列1中第1至1251位所示的基因命名為基因 PbBglul6A，將該基因所編 碼的蛋白命名為蛋白PbBglul6A，其氣基酸序列如序列表序列2所不。
[0069] 實(shí)施例2.重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的表達(dá)和純化
[0070]提取實(shí)施例1獲得的重組菌A中的所述重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)至宿主大腸桿菌BL21 (DE3)。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種至1L LB液體培養(yǎng)基(含50yg ml/1卡那霉素）。在37°C，200rpm條件 下培養(yǎng)至〇D6qq在0.6-0.8之間，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為ImM，30 °C 誘導(dǎo)過(guò)夜。離心收集菌體后，將菌體按照1:10(v/v)的比例，用緩沖液A(20mM pH 8.0磷酸緩 沖液，0.5M NaCl，20mM咪唑）重懸浮，然后于冰水浴中超聲破碎(200W，超聲3s，間歇4s，120 次），再離心收集上清液即為粗酶液。
[0071]基于載體pET28-a( + )中有編碼His-Tag標(biāo)簽蛋白的序列，使用瓊脂糖Ni-IDA親和 柱純化重組蛋白R(shí)-PbBglul6A(其氨基酸序列為在序列表序列2中第31至416位所示氨基酸 序列的羧基末端添加了AAALEHHHHHH)。具體純化步驟如下：
[0072]將粗酶液上樣于Ni-IDA柱進(jìn)行純化。純化過(guò)程為(流速為lmL mirT1):先用緩沖液A (20mM pH 8.0磷酸緩沖液，0.5M NaCl，20mM咪唑）洗脫至0D28q小于0.05,然后用緩沖液B (20mM pH 8.0磷酸緩沖液，0.5M NaCl，50mM咪唑）洗脫至0D，小于0.1，最后用緩沖液C (50mM pH 8.0磷酸緩沖液，0.5M NaCl，200mM咪唑）洗脫。收集緩沖液C洗脫部分，得到純化 的重組蛋白R(shí)-PbBglul 6A的溶液。
[0073] 經(jīng)SDS-PAGE(Laemmli，U.K.Nature ,1970,227(5259) :680-685)檢測(cè)蛋白純度（圖 1)。測(cè)定純化的重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的溶液以及未經(jīng)純化的相應(yīng)粗酶液中總蛋白量、β-1， 3-1，4-葡聚糖酶的酶活力以及比酶活力；以粗酶液的總酶活力為100%，計(jì)算純化回收率； 以粗酶液的純化倍數(shù)為1，計(jì)算純化倍數(shù)，結(jié)果如表2所示。
[0074] 其中，蛋白含量的測(cè)定米用lowry法（Lowry，0.H.et al ·，Journal of Biological Chemistry，1951,193(1) :265-275)，并使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
[0075] 表2重組蛋白R(shí)_PbBglul6A純化表
[0076]
[0077]實(shí)施例3.重組蛋白R(shí)_PbBglul6A作為β-1，3_1，4-葡聚糖酶的性質(zhì)
[0078] -、最適pH測(cè)定
[0079] 將重組蛋白R(shí)_PbBglul6A和底物大麥β-葡聚糖分別溶于以下5種具有不同pH值的 緩沖體系：檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.〇-6.〇);腿3(2-0-嗎啉代）乙磺酸)緩沖液(？!1 5.5-7.0) ;M0PS(2-(N-嗎啉代）丙磺酸）緩沖液(pH 6.0-8.5) ;Tris-HCl緩沖液(pH 7.0- 9.0);甘氨酸/NaOH緩沖液(pH 8.5-10.5)。然后，55°C下測(cè)定β_1，3-1，4_葡聚糖酶酶活力， 以酶活力最高值作為100%，分別計(jì)算各pH下測(cè)定的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖2所示。
[0080] 圖2顯示:重組蛋白R(shí)-PbBglul6A作為β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適pH值為6.0(檸檬 酸/檸檬酸鈉緩沖液)。
[0081 ] 二、pH穩(wěn)定性測(cè)定
[0082] 分別用步驟一中5種具有不同pH值的緩沖體系稀釋重組蛋白R(shí)-PbBglul6A，將稀釋 好的重組蛋白R(shí)_PbBglul6A溶液進(jìn)行如下處理:在50°C恒溫水浴鍋中保溫30min，然后在冰 水浴中冷卻30min;
[0083] 在55°C和pH 6.0條件下測(cè)定β-1，3-1，4_葡聚糖酶酶活力，以經(jīng)相同緩沖體系稀釋 但未經(jīng)上述處理的稀釋好的重組蛋白R(shí)-PbBglul6A溶液的β-l，3-1，4_葡聚糖酶酶活力為對(duì) 照;分別計(jì)算經(jīng)不同緩沖體系處理后的殘余酶活力。以殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百分比 計(jì)算相對(duì)酶活力。
[0084] 結(jié)果如圖3所示。圖3表明：重組蛋白R(shí)-PbBglul6A作為β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有較 寬的pH穩(wěn)定范圍，當(dāng)pH為3.5-9.0時(shí)，殘余的相對(duì)酶活力都在80%以上。
[0085] 三、最適反應(yīng)溫度測(cè)定
[0086]將重組蛋白R(shí)_PbBglul6A在50mM檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中適當(dāng)稀釋，然 后分別在40-75Γ溫度下測(cè)定β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶活力，以酶活力的最高值作為 100%，分別計(jì)算各個(gè)溫度下測(cè)定的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖4所示。
[0087]圖4表明：重組蛋白R(shí)-PbBglul6A作為β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適溫度為55°C。 [0088]四、溫度穩(wěn)定性測(cè)定
[0089]將重組蛋白R(shí)-PbBglul6A在50mM的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中適當(dāng)稀釋 后，進(jìn)行如下熱處理:分別在40_75°C下保溫30min，隨后立即在冰水浴中冷卻30min;
[0090] 最后在55°C和pH 6.0條件下測(cè)定β-l，3-1，4_葡聚糖酶的酶活力，以未經(jīng)熱處理的 經(jīng)上述稀釋后的重組蛋白R(shí)-PbBglul6A溶液作為對(duì)照，分別計(jì)算不同溫度下熱處理后經(jīng)上 述稀釋后的重組蛋白R(shí)_PbBglul6A溶液中的殘余酶活力。以殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百 分比計(jì)算相對(duì)酶活力。結(jié)果如圖5所示。
[0091] 圖5顯示：重組蛋白R(shí)-PbBglul6A作為β-1，3-1，4-葡聚糖酶在55°C以下較為穩(wěn)定， 相對(duì)酶活力能保持80%以上。
[0092] 五、底物特異性
[0093]使用多種聚糖和人工合成的對(duì)硝基苯酚-糖苷(pNP-糖苷)作為底物測(cè)定重組蛋白 R-PbBglul6A的底物特異性。
[0094]聚糖包括:大麥β-葡聚糖、地衣多糖、燕麥β-葡聚糖、昆布多糖、樺木木聚糖、普魯 蘭糖、可溶性淀粉、刺槐豆膠和羧甲基纖維素鈉；
[0095] pNP-糖苷包括:ρΝΡ-β-木吡喃糖苷、ρΝΡ-β-半乳糖吡喃糖苷、ρΝΡ-α-半乳糖吡喃糖 苷、ρΝΡ-β-吡喃葡萄糖苷和ρΝΡ-α-吡喃葡萄糖苷。
[0096]具體測(cè)定方法如下：
[0097]對(duì)于聚糖作為底物，將上述不同的聚糖作為測(cè)試底物用50mM pH 6.0檸檬酸/檸檬 酸鈉緩沖液配制為l%(w/v)的濃度，根據(jù)上述β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力的測(cè)定方法測(cè) 定；
[0098]對(duì)于人工合成的ρΝΡ-糖苷作為底物，將上述不同的人工合成的ρΝΡ-糖苷用50mM pH 6.0檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液配制成5mM濃度，在55°C下反應(yīng)lOmin，測(cè)定410nm處的吸光 值，此時(shí)酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘水解底物釋放Ιμπιο? ρΝΡ所需要的 酶量。
[0099] 以大麥β-葡聚糖為底物時(shí)測(cè)定的酶活力為對(duì)照（100%)，計(jì)算其它底物條件下的 相對(duì)酶活力，結(jié)果如表3所示，其中未在表3中列出的上述底物表示以其為底物時(shí)，重組蛋白 R-PbBglul6A的相對(duì)酶活力低于5%。
[0100] 表3中的結(jié)果表明：重組蛋白R(shí)-PbBglul6A對(duì)由β-1，3糖苷鍵和β-1，4糖苷鍵組成的 大麥β-葡聚糖、燕麥β-葡聚糖及地衣多糖表現(xiàn)出較高活性，相對(duì)酶活力分別為100 %、 92.3%及49.8%。重組蛋白1?-?匕8811116六也能水解由0-1，3糖苷鍵連接的昆布多糖，其相對(duì) 酶活力為20.5%。但是重組蛋白1?-?匕8811 116六不能水解木聚糖、羧甲基纖維素鈉、普魯蘭糖、 可溶性淀粉和刺槐豆膠等其他聚糖，同時(shí)也不能水解人工合成的ρΝΡ-糖苷。
[0101] 表3重組蛋白R(shí)-PbBglul6A作為β-1，3-1，4-葡聚糖酶的底物特異性
[0102]
[0103]實(shí)施例4.重組蛋白R(shí)-PbBglul6A在麥芽糖化中的應(yīng)用
[0104] -、麥芽汁的制備
[0105] 麥芽汁制備采用協(xié)定糖化，具體如下：
[0106] 稱取50.0g麥芽細(xì)粉(粒徑〈0.2mm)于已知重量的糖化杯中，加入200mL 45°C的水， 于45°C水浴鍋中保溫30min(實(shí)驗(yàn)組按照表4加入一定量的重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的水溶 液），不斷攪拌。然后使醪液以l°C/min的速度在25min內(nèi)升溫至70°C，再往糖化杯中加入 100mL 70°C的水，并在70°C下保溫lh。糖化結(jié)束后，將醪液在10-15min內(nèi)迅速冷卻至室溫， 用蒸餾水將醪液補(bǔ)重至450.0g，然后用中速濾紙過(guò)濾，將最初收集的100ml濾液倒回重濾， 直至濾層表面沒有液體為止，所收集的濾液即為協(xié)定麥芽汁。
[0107] 二、麥芽汁過(guò)濾時(shí)間的測(cè)定
[0108]在步驟一中的協(xié)定糖化結(jié)束后，將補(bǔ)重至450.0g的醪液迅速傾倒在罩有中速濾紙 的漏斗中（濾紙共18折，漏斗直徑15cm)，將最初收集的100mL濾液倒回重濾，記錄收集200mL 濾液所需的時(shí)間即為麥芽汁的過(guò)濾時(shí)間。
[0109]三、麥芽汁比重及浸出物含量的測(cè)定
[0110]根據(jù)EBC(歐洲釀造協(xié)會(huì))標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定麥芽汁浸出物含量，具體如下：
[0111]將煮沸后冷卻至15°C的水注滿干燥、恒重的比重瓶(m)，并置于20°C水浴鍋中至恒 溫，稱量裝滿水的比重瓶的重量(nu)。在相同的比重瓶中，加入"實(shí)施例4步驟一"中制備好 的麥芽汁，以相同方法稱量裝滿麥芽汁的比重瓶的重量(m2)。麥芽汁在20°C的比重根據(jù)下 式(1)計(jì)算：
[0112]
[0113] 其中，表示麥芽汁20°C的比重。
[0114] 根據(jù)比重查相對(duì)密度與浸出物含量對(duì)照表可得麥芽汁浸出物含量G。
[0115] 四、麥芽汁粘度的測(cè)定
[0116]采用HAAKE落球式粘度計(jì)測(cè)定，記錄落球從落球管上端刻度線到落至下端刻度線 所需的時(shí)間。麥芽汁的粘度根據(jù)下式(2)計(jì)算：
[0117] n=K(pi-P2)t (2)
[0118] 其中，K表示落球式粘度計(jì)的落球系數(shù)，0.01006mPa · S · cm3/g · S;P1表示落球式 粘度計(jì)的落球密度，2.221g/cm3;p2表示麥芽汁的密度(g/cm3)，其可以通過(guò)乘以水的密 度獲得;t表示落球時(shí)間（s)。
[0119] 按照下式(3)，將以上計(jì)算獲得的粘度換算成為麥芽汁百分濃度為8.6時(shí)的粘度：
[0120]
[0121] 其中，E表示麥芽汁百分濃度為8.6時(shí)的粘度(mPa · s);n表示落球式粘度計(jì)測(cè)定出 來(lái)的麥芽汁粘度(mPa · s);G表不麥芽汁的浸出物含量(g)。
[0122] 五、結(jié)果
[0123] 重組蛋白R(shí)-PbBglul6A對(duì)麥芽糖化的影響如表4所示。結(jié)果表明隨著重組蛋白R(shí)-PbBglul6A用量的增大，麥汁的過(guò)濾時(shí)間和粘度均有所降低，當(dāng)該重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的 添加量為80U/g麥芽時(shí)，麥芽汁粘度減少了3.38%，過(guò)濾速度提高了 14.04%。
[0124] 表4重組蛋白R(shí)-PbBglul6A對(duì)麥芽糖化的影響
[0125]
[0126]
[0127]實(shí)施例5.重組蛋白R(shí)_PbBglul6A在水解燕麥麩皮β-葡聚糖中的應(yīng)用
[0128] 本實(shí)施例所用的燕麥麩皮為常規(guī)脫油燕麥麩皮，粒徑在10-200目之間。
[0129] -、酶解燕麥麩皮β-葡聚糖的方法
[0130] 本實(shí)施例比較了重組蛋白R(shí)-PbBglu 16Α水解燕麥麩皮以及內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮 中葡聚糖的效果。其中，內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮是通過(guò)將燕麥麩皮以l:l〇(w/v)加入80% 乙醇，并在75°C下加熱回流2h制備獲得的。
[0131]水解過(guò)程具體如下：將1.5g燕麥麩皮或內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮加入30ml 50mM檸 檬酸/檸檬酸鈉沖液(pH 6.0)中，然后不加或以150U/g燕麥麩皮的比例加入重組蛋白尺-PbBglul 6A。將混合物置于50°C水浴振蕩12h進(jìn)行水解。
[0132] 二、水解產(chǎn)物檢測(cè)
[0133] 于步驟一水解時(shí)間為0、0.5、1、2、4、8和12h時(shí)分別取樣。將樣品在沸水浴中保持 5min使酶失活，然后離心去上清液通過(guò)DNS法測(cè)定還原糖含量。將β-葡寡糖得率定義為lg燕 麥麩皮所獲得的還原糖，并根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算：
[0134]
[0135] 通過(guò)TLC分析比較水解產(chǎn)物。TLC分析操作如下：取lyL不同水解液分別點(diǎn)樣于TLC 層析板，將TLC層析板置于展層劑(正丁醇：乙酸:水=2:1:1)中。待展層結(jié)束后用顯色劑(硫 酸：甲醇=5:95) 130 °C烘烤顯色。
[0136]三、結(jié)果
[0137] 如圖6所示，對(duì)于燕麥麩皮，加入重組蛋白R(shí)_PbBglul6Al 50U/g燕麥麩皮水解燕麥 麩皮8h可獲得最高的β-葡寡糖得率(9.5% )，不加重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)，β-葡寡糖得率 為5.3 % (由于內(nèi)源酶的作用）。而對(duì)于內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮，加入150U/g燕麥麩皮的重組 蛋白R(shí)-PbBglul6A水解燕麥麩皮8h可獲得最高的β-葡寡糖得率(7.0% )，而不加重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)的β-葡寡糖得率小于1 %。
[0138] 如圖7所示，對(duì)于燕麥麩皮水解產(chǎn)物，加重組蛋白R(shí)-PbBglul6A時(shí)的水解產(chǎn)物包括 二糖、三糖和四糖等一系列寡糖，而不加重組蛋白R(shí)_PbBglul6A時(shí)的水解產(chǎn)物主要為二糖和 三糖，并包含少量四糖；而對(duì)于內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮，加入重組蛋白R(shí)_PbBglul6A的水解 產(chǎn)物以三糖和四糖為主。
[0139] 以上結(jié)果表明：對(duì)于燕麥麩皮中β-葡聚糖的水解過(guò)程來(lái)說(shuō)，通過(guò)加入重組蛋白R(shí)-PbBglul6A可以有效提高β-葡寡糖得率，而對(duì)于內(nèi)源酶失活的燕麥麩皮中β-葡聚糖的水解 過(guò)程來(lái)說(shuō)，通過(guò)加入重組蛋白R(shí) _PbBglul6A可以獲得相對(duì)$父尚的β-匍寡糖得率，同時(shí)β-匍寡 糖的組成以功能性三糖和四糖為主，因而對(duì)于β-葡寡糖的生產(chǎn)具有較好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0140] 實(shí)施例6.重組蛋白R(shí)-PbBglul6A在制備可得然寡糖中的應(yīng)用
[0141] -、酶解可得然多糖方法
[0142] 重組蛋白R(shí)-PbBglul6A具有較寬泛的底物特異性，不僅對(duì)β-1，3_1，4-葡聚糖(如大 麥葡聚糖、地衣多糖)有很高水解活力，也對(duì)β-1，3_葡聚糖(如昆布多糖)有水解活力。本 實(shí)施例是利用重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的β-1，3-葡聚糖酶活性水解可得然多糖（英文名 Curdlan，中文譯名有可得然多糖、可的蘭多糖、可得然膠、可的蘭膠、凝膠多糖、熱凝膠多 糖)制備低聚糖。
[0143] 具體操作為，將5g可得然多糖加入100ml 20mM醋酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，lOOrpm 條件下，50°C預(yù)熱30min，使得混合物成為膠狀懸液，隨后加入重組蛋白R(shí)-PbBglul6A的水溶 液，使重組蛋白R(shí)_PbBglul6A的初始濃度為0.5U/mL(以昆布多糖酶活力計(jì)，昆布多糖酶的活 力測(cè)定方法及定義與上述β-l，3-1，4-葡聚糖酶的酶活力測(cè)定方法及定義相同，但將底物換 為昆布多糖），混勻后將混合物置于50°C水浴4h進(jìn)行水解。
[0144] 二、水解產(chǎn)物檢測(cè)
[0145] 于步驟一水解時(shí)間為0、15、30、60、120、240min分別從水解液中取樣，將樣品在沸 水浴中保持5min使酶失活，然后離心去上清液，通過(guò)TLC分析比較水解產(chǎn)物。TLC分析操作： 取UiL不同水解液分別點(diǎn)樣于TLC層析板，將TLC層析板置于展層劑(正丁醇：乙酸:水= 2:1: 1)中。展層結(jié)束后用顯色劑(硫酸：甲醇= 5:95)130°C烘烤顯色。
[0146]三、結(jié)果
[0147] 如圖8所示，5%(w/v)的可得然多糖懸液在加入重組蛋白R(shí)_PbBglul6A后，4h左右 可以被完全水解。TLC分析顯示重組蛋白R(shí)-PbBglul6A水解可得然多糖獲得的寡糖水解產(chǎn)物 隨著水解反應(yīng)進(jìn)行逐漸積累，最終水解產(chǎn)物主要含葡萄糖、昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖 和少量的更高聚合度寡糖。
[0148] 本說(shuō)明書中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白質(zhì)，是以下（1)或(2)或(3)或(4)的蛋白質(zhì)： (1) 序列表序列2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2) 序列表序列2自氨基末端第31至416位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (3) 在所述(2)的羧基末端添加 Po ly-Hi s標(biāo)簽的蛋白質(zhì)； (4) 將所述（1)或(2)或(3)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加所獲得的具有相同功能的由（1)或(2)或(3)衍生的蛋白質(zhì)。2. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。3. 如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因?yàn)橐韵?a)或(b)或(c)或 (d)的DNA分子： (a) 序列表序列1所示的DNA分子； (b) 序列表序列1的第91至1248位所示的DNA分子； (c) 在嚴(yán)格條件下與（a)或(b)所限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的 DNA分子； (d) 與（a)或(b)或（c)限定的DNA分子具有至少75%的序列同一性且編碼權(quán)利要求1所 述蛋白質(zhì)的DNA分子。4. 含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在作為β_1,3-1,4-葡聚糖酶中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用包括對(duì)β-l，3-1，4-葡聚糖進(jìn)行水解 的步驟； 和/或，所述β-1，3-1，4-葡聚糖為大麥β-葡聚糖、燕麥β-葡聚糖和地衣多糖中的至少一 種。7. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在作為β_1,3-葡聚糖酶中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用包括對(duì)β-l，3-葡聚糖進(jìn)行水解的步 驟； 和/或，所述β-1，3-葡聚糖為昆布多糖和可得然多糖中的至少一種。9. 如權(quán)利要求5-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述水解的pH值為3-10.5; 和/或，所述水解的溫度為40-75°C ; 和/或，所述應(yīng)用為在麥芽糖化中的應(yīng)用； 和/或，所述應(yīng)用為在燕麥麩皮水解中的應(yīng)用； 和/或，所述應(yīng)用為在制備可得然寡糖中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2和3所述編碼基因及權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或 重組菌在制備β-l，3-1，4-葡聚糖酶和/或β-l，3-葡聚糖酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK106085989SQ201610416008
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日 公開號(hào)201610416008.5, CN 106085989 A, CN 106085989A, CN 201610416008, CN-A-106085989, CN106085989 A, CN106085989A, CN201610416008, CN201610416008.5
【發(fā)明人】閆巧娟, 江正強(qiáng), 張彬, 劉瑜, 楊紅葉
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)