一種枯草芽孢桿菌及其在淡雅型白酒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物白酒發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌的篩選分離及 在淡雅型白酒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 淡雅型白酒屬于濃香型白酒的分支，是一種在香氣上具有幽雅、飄逸、細(xì)膩、誘人 的自然發(fā)酵的復(fù)合香氣的香型白酒。淡雅型白酒在口感上表現(xiàn)為柔綿而不濃艷，細(xì)膩、圓 潤(rùn)，有柔軟而無(wú)骨之感；在風(fēng)格上既淡又雅，是淡和雅的高度和諧、高度統(tǒng)一；在生理反應(yīng) 上酒既要上得慢，又要去得快。目前，淡雅型白酒的酒體設(shè)計(jì)上通常采用降低骨架成分的含 量，相應(yīng)地增加復(fù)雜成分的含量和種類(lèi)的方式。
[0003] 濃香型白酒的生產(chǎn)采用泥窖固態(tài)發(fā)酵，原料一般選用高粱、大米、糯米、小麥、玉米 等含淀粉原料，經(jīng)糖化發(fā)酵后蒸餾而得。淡雅型白酒要求香氣淡雅，口感綿柔，而傳統(tǒng)的濃 香型白酒采用陳年老窖、混蒸續(xù)渣工藝，得到的白酒往往香氣濃郁，口感甘冽，不符合"淡 雅"的定位。因此目前淡雅型白酒的生產(chǎn)通常采用不同的香型酒來(lái)組合勾兌或者通過(guò)對(duì)原 酒的生產(chǎn)控制來(lái)解決（包括原料、糖化發(fā)酵劑、生產(chǎn)設(shè)備、發(fā)酵工藝和微生態(tài)環(huán)境等方面）。
[0004] 大曲是濃香型白酒的糖化發(fā)酵劑，通常以小麥、大麥為原料（少數(shù)加入一定比例 的豌豆、玉米），粉碎過(guò)后加水壓成的磚塊狀曲坯。曲塊自身原料中的微生物以及經(jīng)人工接 種或與自然環(huán)境接觸到的微生物開(kāi)始生長(zhǎng)，之后給予曲塊適宜的品溫和濕度使微生物自然 生長(zhǎng)繁殖富集并產(chǎn)生多種多樣的酶類(lèi)。微生物群落的多樣性和相互之間作用以及酶作用于 原料形成的風(fēng)味前驅(qū)物質(zhì)，使得大曲不僅成為大曲酒釀造過(guò)程的原料，也成為釀酒生產(chǎn)過(guò) 程的糖化劑、發(fā)酵劑、生香劑和酒化劑。目前盡管通過(guò)氣相色譜、質(zhì)譜分析等手段可檢測(cè)成 品白酒中的香氣成分，但仍存在著香味成分的形成是由哪些微生物參與以及哪一種微生物 起著主導(dǎo)作用等問(wèn)題。楚園春大曲中微生物的數(shù)量大，種類(lèi)多，且含有數(shù)量巨大的嗜熱微生 物，其中以耐高溫的芽孢桿菌為最多。
[0005] 科研人員在白酒風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生菌方面已經(jīng)做了一些研宄，如中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN 102268397A公開(kāi)了醬香特征香高效產(chǎn)生菌株及其在中國(guó)白酒釀造中的應(yīng)用，該發(fā)明利用 從中國(guó)白酒高溫大曲中選育的3株地衣芽孢桿菌單獨(dú)或混合應(yīng)用于醬香型白酒生產(chǎn)工藝 中，生產(chǎn)的白酒品質(zhì)得到提高，酒的特征香更突出且更持久。CN103789131A公開(kāi)了一種環(huán) 狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。該應(yīng)用是在醬香型白酒生產(chǎn)工藝不變的條件下再 使用環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株，將菌株液體或固體培養(yǎng)物接種到醬香型白酒蒸酒后的固體 料醅中，入池發(fā)酵，制得發(fā)酵酒醅，將酒醅蒸餾，制得醬香型白酒酒液。CN1390942A公開(kāi)了 一種地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis)BG05菌株及其在生產(chǎn)濃醬兼香型白酒中的 應(yīng)用。該菌株以大豆或麩皮為發(fā)酵基質(zhì)能夠產(chǎn)香，發(fā)酵底物中游離氨基酸含量較高，具有較 好的耐熱性能，適用于兼香型及醬香型固態(tài)法白酒發(fā)酵生產(chǎn)，能夠?yàn)樯a(chǎn)用高溫大曲增香， 提升濃醬兼香型白酒的典型風(fēng)味，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。
[0006] 上述研宄表明，從大曲中分離得到產(chǎn)香微生物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)再應(yīng)用到白酒生產(chǎn)過(guò)程 中，可以提高白酒中風(fēng)味物質(zhì)的含量，使酒的質(zhì)量得以提高。雖然一株或幾株產(chǎn)香微生物應(yīng) 用于大曲白酒生產(chǎn)過(guò)程中不能產(chǎn)生大曲白酒的所有風(fēng)味物質(zhì)，但對(duì)于提高其質(zhì)量卻有重要 作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于不同地區(qū)自然條件及企業(yè)制曲工藝的差別，白酒風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生菌 的種類(lèi)和數(shù)量也會(huì)有差別。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)分離純化篩選出一株枯草芽孢桿菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后加入淡雅型白酒糧醅 中參與微生物發(fā)酵，大量胞外酶系迅速水解糧醅中的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪等大分子 有機(jī)物，加快分解過(guò)程，并產(chǎn)生多種香味前體物質(zhì)，同時(shí)能提高糧食利用率，縮短淡雅型白 酒發(fā)酵周期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供了一種枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)CYC18,該細(xì)菌已于2015年1月16日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分 類(lèi)命名：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)CYC18;保藏編號(hào)：CCTCCN0.M2015037,地址 中國(guó)武漢武漢大學(xué)。該細(xì)菌具有酶活力高、生長(zhǎng)迅速、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和纖 維素等大分子有機(jī)物有很強(qiáng)降解力。
[0009] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)CYC18 在淡雅型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，利用本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)CYC18制 備的淡雅型白酒，出酒率高，發(fā)酵周期短，淡雅風(fēng)格典型。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0011] 一種枯草芽孢桿菌，通過(guò)以下步驟篩選得到：
[0012] 1)從湖北楚園春酒業(yè)股份有限公司取釀酒大曲，在80°C水浴鍋中處理15min以殺 死非芽孢菌，適當(dāng)稀釋后涂平板，根據(jù)菌落形態(tài)挑取典型單菌落（菌落近圓形，3-4. 5mm，無(wú) 光澤，中央隆凸，邊緣鈍齒狀，灰白色），通過(guò)鏡檢粗篩出芽孢桿菌。
[0013] 2)通過(guò)生理生化及16SrDNA序列鑒定，最終篩選到一株枯草芽孢桿菌，枯草芽孢 桿菌（Bacillussubtilis)CYC18,該細(xì)菌已于2015年1月16日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心進(jìn)行保藏，分類(lèi)命名：枯草芽孢桿菌CYC18BacillussubtilisCYC18;保藏編號(hào)： CCTCCNO.M2015037，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0014] CYC18菌株具體有典型的枯草芽孢桿菌生理生化特征：該菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂（LB)培 養(yǎng)基上繁殖生長(zhǎng)形成的菌落為近圓形，3-4. 5_，無(wú)光澤，中央隆凸，邊緣鈍齒狀，灰白色，通 過(guò)鏡檢G+，菌體桿狀，單個(gè)排列，芽孢柱狀，次端生，孢囊不膨大。生理生化特征為：明膠液 化。發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和麥芽糖，不發(fā)酵半乳糖、阿拉伯糖和海藻糖。V.P陽(yáng)性， M.R.陽(yáng)性，H2S弱陽(yáng)性，脲酶陰性，接觸酶陽(yáng)性，好氧，耐7 %NaCl。最適溫度28~32 °C，最 高溫度50°C。石蕊牛奶反應(yīng)產(chǎn)堿，胨化，還原。利用硝酸鹽。
[0015]LB培養(yǎng)基的配方（1L):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g;LA再加瓊脂15g。
[0016] 一種枯草芽孢桿菌CYC18在淡雅型白酒中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程為：
[0017] 將枯草芽孢桿菌CYC18發(fā)酵液，按0.1%~1% (w/w)比例添加到釀酒大曲中，接 種糧醅發(fā)酵生產(chǎn)淡雅型白酒。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 1、本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌，該菌株適用于淡雅型固態(tài)法白酒發(fā)酵生產(chǎn)，能 夠?yàn)樯a(chǎn)用高溫大曲增香，提升淡雅型白酒的典型風(fēng)味，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。
[0020] 2、利用本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌，可縮短發(fā)酵周期20d左右，同時(shí)酒醅中 2, 3-丁二醇、丙三醇、己六醇等多元醇大量生成，賦予產(chǎn)品綿甜甘爽的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為枯草芽孢桿菌CYC18菌落和顯微照片（1000X)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)方法及條件如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] 菌株分離
[0025] 從湖北楚園春酒業(yè)股份有限公司取釀酒大曲，在80°C水浴鍋中處理15min以殺死 非芽孢菌，適當(dāng)稀釋后涂平板，根據(jù)菌落形態(tài)挑取典型單菌落（菌落近圓形，3-4. 5mm，無(wú)光 澤，中央隆凸，邊緣鈍齒狀，灰白色），通過(guò)鏡檢粗篩出芽孢桿菌。
[0026]LB培養(yǎng)基的配方（1L):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g;LA再加瓊脂15g。
[0027] 復(fù)篩及鑒定
[0028] 通過(guò)生理生化及16SrDNA序列鑒定，最終篩選到一株枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿 菌（Bacillussubtilis)CYC18,該細(xì)菌已于2015年1月16日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心進(jìn)行保藏，分類(lèi)命名：枯草芽孢桿菌CYC18BacillussubtilisCYC18;保藏編號(hào)：CCTCC NO.M2015037，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0029]CYC18菌株具體有典型的枯草芽孢桿菌生理生化特征：該菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂（LB)培 養(yǎng)基上繁殖生長(zhǎng)形成的菌落為近圓形，3-4. 5_，無(wú)光澤，中央隆凸，邊緣鈍齒狀，灰白色，通 過(guò)鏡檢G+，菌體桿狀，單個(gè)排列，芽孢柱狀，次端生，孢囊不膨大（圖1所示）。生理生化特 征為：明膠液化。發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和麥芽糖，不發(fā)酵半乳糖、阿拉伯糖和海藻 糖。V.P陽(yáng)性，M.R.陽(yáng)性，H2S弱陽(yáng)性，脲酶陰性，接觸酶陽(yáng)性，好氧，耐7 %NaCl。最適溫度 28~32°C，最高溫度50°C。石蕊牛奶反應(yīng)產(chǎn)堿，胨化，還原。利用硝酸鹽。
[0030] 實(shí)施例2 :
[0031] 枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)CYC18的放大培養(yǎng)
[0032]按葡萄糖 20g/L、酵母膏 10g/L、蛋白胨 10g/L、NaCl5g/L、、KH2P04 3g/L，以 65% (V/V)裝液量配制發(fā)酵液，經(jīng)121°C高溫蒸汽消毒30min，降溫至30°C，向其中接種 菌齡l〇h的枯草芽孢桿菌種子液1 % (v/v)，在30 °C培養(yǎng)，控制攪拌轉(zhuǎn)速維持溶氧（DO值 30 % -90 % )。發(fā)酵24h放罐，平板計(jì)數(shù)枯草芽孢桿菌CYC18活菌量為4. 8X109cfu/ml。
[0033] 實(shí)施例4:
[0034]CYC18菌株酶活性檢測(cè)
[0035] 準(zhǔn)備好淀粉、酪蛋白和纖維素瓊脂平板（以上三種培養(yǎng)基均為市售青島海博商品 化培養(yǎng)基），將CYC18菌株在PA瓶中復(fù)蘇，取5y1點(diǎn)接于平板上，培養(yǎng)。觀察酪素和纖維素 平板是否有水解環(huán)，往淀粉平板點(diǎn)接菌的四周滴加碘液，觀察是否有水解環(huán)，并測(cè)定水解環(huán) 直徑。
[0036] 表1 CYC18菌株降解能力
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的枯草芽孢桿菌，其特征在于：枯草芽孢桿菌（AaciBy1S CYC18 ;保藏編號(hào)：CCTCC N0.M2015037。
2. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在在淡雅型白酒發(fā)酵中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的枯草芽孢桿菌在縮短淡雅性白酒 發(fā)酵周期中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的枯草芽孢桿菌在提高白酒發(fā)酵多 元醇含量中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的多元醇為2, 3- 丁二醇、丙三醇、己 六醇中的一種或多種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的枯草芽孢桿菌在同時(shí)縮短淡雅性 白酒發(fā)酵周期和提高白酒多元醇中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌及其在淡雅型白酒中的應(yīng)用，申請(qǐng)人從酒曲中篩選出了一株耐高溫的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） CYC18；保藏編號(hào)：CCTCC NO.M2015037。將該枯草芽孢桿菌發(fā)酵液按0.1%～1%（w/w）比例添加到釀酒大曲中，可明顯縮短生產(chǎn)淡雅型白酒的發(fā)酵周期，同時(shí)提高多元醇的含量， 2,3-丁二醇、丙三醇、己六醇等多元醇大量生成，賦予產(chǎn)品綿甜甘爽的特點(diǎn)。CCTCC NO.M20150372015.01.16
【IPC分類(lèi)】C12N1-20, C12G3-02, C12R1-125
【公開(kāi)號(hào)】CN104745503
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510058118
【發(fā)明人】楊華, 趙述淼, 余祥虎, 馮舉耀, 鄧德政
【申請(qǐng)人】湖北楚園春酒業(yè)有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日