一種牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌、其分離方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌、其分離方法及應(yīng)用，所述牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Mdgb45，該菌株已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號是GDMCC NO：60009。本發(fā)明的牡丹內(nèi)生細菌菌株對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，可用于防治金黃色葡萄球菌。而牡丹內(nèi)生細菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白粗提物可作為抑制金黃色葡萄球菌的活性物質(zhì)，該活性物質(zhì)經(jīng)過植物體內(nèi)的篩選，對人畜無毒、無傷害，可直接開發(fā)為新型抗菌藥物。GDMCC 6000920160125
【專利說明】
一種牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌、其分離方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種牡丹內(nèi)生抑制金黃色葡萄球菌的枯草芽孢桿菌、其分離方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物內(nèi)生菌是指生活在植物組織內(nèi)，但不破壞宿主細胞而引起植物病害的一類微生物，它包括細菌、放線菌和真菌。植物內(nèi)生菌可以從植物組織內(nèi)部分離出來。目前藥用植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生多種抑菌、抗氧化的生物學(xué)活性物質(zhì)，在生物制藥，生物防治等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景，成為許多學(xué)者爭相研究的熱點。
[0003]牡丹(Paeofiia suffruticosa Andrews)是我國特有的傳統(tǒng)花奔，具有極高的觀賞價值和藥用價值，其藥用栽培品種以‘鳳丹’(Paeofiia OsiiitFeng Dan’)為主，其根入藥，名為“丹皮”，丹皮中含有牡丹酚、芍藥甙、苯甲酸、揮發(fā)油及植物留醇等多種藥用活性物質(zhì)，在抗菌、消炎、治療心血管疾病、保肝、降血糖、降血脂、抗腫瘤等方面具有較好療效。目前國內(nèi)僅有一些關(guān)于牡丹內(nèi)生真菌及次生代謝產(chǎn)物的研究。
[0004]金黃色葡萄球菌(SiapAWococcus aureus)是一種較為常見的，易引起食物中毒的食源性致病菌，常會導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗和疾病傳染，對食品安全構(gòu)成巨大的威脅。隨著抗生素和防腐劑的大量使用，耐藥性菌株大量產(chǎn)生，開發(fā)新的抑菌活性物質(zhì)迫在眉睫。
[0005]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在自然界廣泛存在，對營養(yǎng)的要求不高且具有高度的耐鹽性，它是人類化膿感染中最常見的病原菌，由于抗生素的廣泛使用，已使90%多的金葡菌產(chǎn)生了耐藥性，而且隨著食品工業(yè)的快速增長，人們對食品防腐劑的安全性以及食品的保質(zhì)期問題提出了更高的要求。一些食品腐敗菌如金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)等嚴(yán)重危害著食品安全，如何防止食品腐敗變質(zhì)及開發(fā)安全的食品防腐劑越來越受到重視目前，篩選金葡菌拮抗菌株的來源主要有土壤和海洋兩個途徑，而牡丹內(nèi)生菌的研究也僅在內(nèi)生真菌及次生代謝產(chǎn)物的研究方面。將兩者結(jié)合起來關(guān)于藥用牡丹內(nèi)生細菌拮抗金葡的研究幾乎沒有，本專利以藥用植物牡丹根部內(nèi)生細菌為材料，從中篩選能夠抑制金黃色葡萄球菌生長的內(nèi)生細菌菌株，并探討其活性代謝產(chǎn)物的抑菌活性，從而開發(fā)出抑制金黃色葡萄球菌的新的活性物質(zhì)，避免耐藥性菌株的產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的在于提供一種牡丹內(nèi)生抑制金黃色葡萄球菌的枯草芽孢桿菌、其分離方法及應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。
[0007]為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括:
一種牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌，所述牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(feciDusst//?ii2is)Mdgb45，該菌株已在2016年I月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號是GDMCC NO:60009o
[0008]本發(fā)明提出了一種分離純化所述的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌的方法，其包括:
步驟①:從生長狀態(tài)良好的牡丹根上剝?nèi)「?，之后將根皮漂洗、沖洗、消毒、再沖洗后晾干作為樣品，備用；
步驟②:將最后一次沖洗用的液體涂布于平板中作為對照組，并在溫度為28°C下恒溫培養(yǎng)；
步驟③:將步驟①制得的樣品放入無菌研缽中研磨至均勻，靜置后取上清液并按1:9的比例稀釋為2個梯度，之后把兩個梯度的溶液涂布于固體平板上，并在溫度為28°C的條件下培養(yǎng)，把每一個梯度再做3個重復(fù)，然后將對照組和樣品組的兩個梯度分別在平板上培養(yǎng)，用平板劃線法對不同的菌落進行分離、純化，即獲得分離純化后的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌。
[0009]其中優(yōu)選的一種分離方法為，步驟①中漂洗根皮所用乙醇的質(zhì)量百分比濃度為75%;步驟②中消毒根皮的具體方法是將根皮置于質(zhì)量百分比濃度30%的次氯酸鈉中浸泡3min0
[0010]本發(fā)明提出了一種收集所述牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的方法，其包括:將牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌放于溫度為28°c的NA培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移到I3DA培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h，然后收集培養(yǎng)液，并在溫度為4 °C、轉(zhuǎn)速為1000g的情況下離心2min，收集上清液并用0.22μ m的無菌濾膜過濾除菌即得所述的發(fā)酵液。
[0011]本發(fā)明還提出了一種將所述的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌于防治金黃色葡萄球菌病原菌中的應(yīng)用。
[0012]此外，本發(fā)明還提出了一種防治金黃色葡萄球菌病原菌的生防菌，其包括以上所述的拮抗金黃色葡萄球菌的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌。
[0013]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is) Mdgb45，保藏單位:廣東省微生物菌種保藏中心；地址:廣州市先烈中路100號59號樓5樓，廣東省微生物研究所;保藏日期:2016 年I 月25 日；保藏號GDMCC NO: 600090
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括:
本發(fā)明提出了一種牡丹內(nèi)生抑制金黃色葡萄球菌的枯草芽孢桿菌、其分離方法及應(yīng)用，本發(fā)明的牡丹內(nèi)生細菌菌株對金黃色葡萄球菌具的良好的抑菌效果，可用于防治金黃色葡萄球菌。而牡丹內(nèi)生細菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白粗提物可作為抑制金黃色葡萄球菌的活性物質(zhì)，該活性物質(zhì)經(jīng)過植物體內(nèi)的篩選，對人畜無毒、無傷害，可直接開發(fā)為新型抗菌藥物。
【附圖說明】
[0015]圖1是枯草芽胞桿菌Mdgb45菌株對金黃色葡萄球菌的拮抗作用結(jié)果圖；其中，B圖是枯草芽胞桿菌Mdgb45菌株，A、C、D圖是其他沒有拮抗作用的菌株；
圖2是枯草芽胞桿菌Mdgb45菌株的菌落特征和菌體特征；其中，A圖是枯草芽胞桿菌Mdgb45菌株的菌落特征，B圖是菌體革蘭氏染色結(jié)果，C圖是鞭毛染色結(jié)果；
圖3是枯草芽胞桿菌Mdgb45菌株發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的拮抗作用結(jié)果圖；
圖4是枯草芽胞桿菌Mdgb45菌株發(fā)酵液中粗蛋白提取液對金黃色葡萄球菌的拮抗作用結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0016]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本案發(fā)明人經(jīng)長期研究和大量實踐，得以提出本發(fā)明的技術(shù)方案。如下將對該技術(shù)方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。
[0017]本實施方式中大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)由胰蛋白胨15g、大豆胨5g、NaCl5g、瓊脂17g和100mL蒸餾水組成，pH7.3;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、瓊脂17g和100mL蒸饋水組成，pH7.2;
PDA培養(yǎng)基由土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂17g和100mL蒸餾水組成，自然pH值。
[0018]實施例1:牡丹內(nèi)生細菌的分離方法I
運用5點取樣法隨機取洛陽理工學(xué)院西校區(qū)3、4月份牡丹根部組織，立即帶回實驗室作為內(nèi)生細菌的分離材料。具體的分離純化操作步驟如下:在自來水下將牡丹根表面刷洗干凈晾干，將其根皮剝下混勻，隨機取切好的根皮3g放于培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺中用70%的乙醇漂洗30s后，立即用滅菌水沖洗3次，再用20%的次氯酸鈉表面消毒3min，最后用滅菌水沖洗5次，無菌條件下晾干。吸取最后一次沖洗后的滅菌水0.2mL涂布于(TSA)平板中作為對照組，于28°C恒溫培養(yǎng)48h。將經(jīng)過表面消毒后的樣品放入無菌研缽中，加入1mL的滅菌水，研磨至均勻。靜置1min后，取上清液按1:9的比例稀釋2個梯度，分別取0.2mL溶液涂布于(TSA)固體平板，于28°C恒溫培養(yǎng)48h，每一梯度設(shè)置3個重復(fù)，共3個梯度。待分離平板上長出菌落，定期觀察分離平板，記錄每個平板上的菌落數(shù)量，對各菌落形態(tài)進行觀察記錄并挑選出不同菌落。如果對照組平板上生長有菌落，則在實驗組中剔除相應(yīng)的菌落。進一步用(TSA)平板劃線將不同的菌落進行分離、純化，獲得牡丹內(nèi)生細菌菌株。
[0019]實施例2:牡丹內(nèi)生細菌的分離方法2
運用5點取樣法隨機取洛陽理工學(xué)院西校區(qū)3、4月份牡丹根部組織，立即帶回實驗室作為內(nèi)生細菌的分離材料。具體的分離純化操作步驟如下:在自來水下將牡丹根表面刷洗干凈晾干，將其根皮剝下混勻，隨機取切好的根皮3g放于培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺中用75%的乙醇漂洗30s后，立即用滅菌水沖洗3次，再用30%的次氯酸鈉表面消毒3min，最后用滅菌水沖洗5次，無菌條件下晾干。吸取最后一次沖洗后的滅菌水0.2mL涂布于(TSA)平板中作為對照組，于28°C恒溫培養(yǎng)48h。將經(jīng)過表面消毒后的樣品放入無菌研缽中，加入1mL的滅菌水，研磨至均勻。靜置1min后，取上清液按1:9的比例稀釋2個梯度，分別取0.2mL溶液涂布于(TSA)固體平板，于28°C恒溫培養(yǎng)48h，每一梯度設(shè)置3個重復(fù)，共3個梯度。待分離平板上長出菌落，定期觀察分離平板，記錄每個平板上的菌落數(shù)量，對各菌落形態(tài)進行觀察記錄并挑選出不同菌落。如果對照組平板上生長有菌落，則在實驗組中剔除相應(yīng)的菌落。進一步用(TSA)平板劃線將不同的菌落進行分離、純化，獲得牡丹內(nèi)生細菌菌株。
[0020]實施例3:牡丹內(nèi)生細菌的分離方法3
運用5點取樣法隨機取洛陽理工學(xué)院西校區(qū)3、4月份牡丹根部組織，立即帶回實驗室作為內(nèi)生細菌的分離材料。具體的分離純化操作步驟如下:在自來水下將牡丹根表面刷洗干凈晾干，將其根皮剝下混勻，隨機取切好的根皮3g放于培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺中用80%的乙醇漂洗30s后，立即用滅菌水沖洗3次，再用40%的次氯酸鈉表面消毒3min，最后用滅菌水沖洗5次，無菌條件下晾干。吸取最后一次沖洗后的滅菌水0.2mL涂布于(TSA)平板中作為對照組，于28°C恒溫培養(yǎng)48h。將經(jīng)過表面消毒后的樣品放入無菌研缽中，加入1mL的滅菌水，研磨至均勻。靜置1min后，取上清液按1:9的比例稀釋2個梯度，分別取0.2mL溶液涂布于(TSA)固體平板，于28°C恒溫培養(yǎng)48h，每一梯度設(shè)置3個重復(fù)，共3個梯度。待分離平板上長出菌落，定期觀察分離平板，記錄每個平板上的菌落數(shù)量，對各菌落形態(tài)進行觀察記錄并挑選出不同菌落。如果對照組平板上生長有菌落，則在實驗組中剔除相應(yīng)的菌落。進一步用(TSA)平板劃線將不同的菌落進行分離、純化，獲得牡丹內(nèi)生細菌菌株。其中以實施例2的方法分離出的菌種數(shù)目最多，效果最好。
[0021]實施例4:牡丹內(nèi)生細菌Mdgb45分離和對金黃色葡萄球菌a ureus)的平板抑菌作用
從指示菌株的菌種斜面上挑取一環(huán)接入3 mL (NA)培養(yǎng)基，37°C，轉(zhuǎn)速160 r/min，過夜培養(yǎng)，制備出指示菌液。采用平板對峙法對上述實施例2分離出的內(nèi)生菌進行抑菌實驗。向培養(yǎng)皿(90mm)中倒入20 mL已滅菌的NA培養(yǎng)基，待其凝固后，加入10yL指示菌液(濃度調(diào)整為1.0 XlO7 cfu/mL)，均勻涂布，靜置5min。從純化出的內(nèi)生菌平板上挑取一環(huán)以對角的位置接入已經(jīng)涂布指示菌的平板上，靜置5min，培養(yǎng)皿于37°C培養(yǎng)24h后測量抑菌圈大小。每處理重復(fù)三次。試驗結(jié)果如圖1所示，內(nèi)生細菌菌株Mdgb45菌株對金黃色葡萄球菌具有強烈的抑菌作用，抑菌圈平均直徑值為7mm。
[0022]實施例5:牡丹內(nèi)生細菌Mdgb45的鑒定
實施主要采用菌體形態(tài)觀察，生理生化特征測定和分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法對內(nèi)生細菌Mdgb45進行鑒定。結(jié)果如圖2所示，菌株Mdgb45在NA培養(yǎng)基上生長良好，菌落前期突起，干燥，乳白色，邊緣鋸齒狀，后期菌落成褶皺。革蘭氏染色均為陽性，菌體均為桿狀，有鞭毛，產(chǎn)生芽孢。
[0023]16S ”熟的？0財廣增結(jié)果表明，菌株1(^&45擴增產(chǎn)物為1511 bp，具體如如序列表SEQ ID N0.1所示，委托上海生工生物工程公司測序，獲得菌株Mdgb45 16S rRNA基因全序列，序列登錄號分別為KU570452。利用GenBank中的BLAST軟件對菌株的16S rRNA基因序列進行分析，菌株Mdgb45的16S rRNA序列與枯草芽孢桿菌(feciHus具有較高的同源性，其相似性都高達99%。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，將菌株Mdgb45鑒定為枯草芽孢桿菌(ifeciDus subtilis)。
[0024]實施例6:不同條件下牡丹內(nèi)生細菌Mdgb4 5發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的平板抑菌作用。
[0025]對篩選得到的拮抗菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測其發(fā)酵液的抑菌活性。挑取拮抗菌株單菌落于NA培養(yǎng)基中28°C過夜振蕩培養(yǎng)，取600yL加入20 mL新鮮液體PDA培養(yǎng)基中25 °C振蕩培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液10 OOOXg 4°C離心2 min后，取上清用0.22μ m的無菌濾膜過濾除菌。平板擴散法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性，無菌操作取ΙΟΟμ?Χ?.0 X 17 cfu/mL)金黃色葡萄球菌均勻涂布于倒有固體NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心放上3個無菌牛津杯，然后在每個牛津杯中分別加入10yL的拮抗菌株的發(fā)酵上清液，37°C恒溫培養(yǎng)24h后，測定抑菌圈直徑，每處理重復(fù)三次。試驗結(jié)果抑菌圈平均直徑值為5mm。
[0026]實施例7:不同條件下牡丹內(nèi)生細菌Mdgb4 5發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的平板抑菌作用。
[0027]對篩選得到的拮抗菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測其發(fā)酵液的抑菌活性。挑取拮抗菌株單菌落于NA培養(yǎng)基中28°C過夜振蕩培養(yǎng)，取600yL加入20 mL新鮮液體PDA培養(yǎng)基中32 °C振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液10 OOOXg 4°C離心2 min后，取上清用0.22μ m的無菌濾膜過濾除菌。平板擴散法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性，無菌操作取ΙΟΟμ?Χ?.0 X 17 cfu/mL)金黃色葡萄球菌均勻涂布于倒有固體NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心放上3個無菌牛津杯，然后在每個牛津杯中分別加入10yL的拮抗菌株的發(fā)酵上清液，37°C恒溫培養(yǎng)24h后，測定抑菌圈直徑，
每處理重復(fù)三次。
[0028]試驗結(jié)果如圖3所示，內(nèi)生細菌菌株Mdgb45菌株的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌具有強烈的抑菌作用，抑菌圈平均直徑值為10.5mm。
[0029]實施例8:不同條件下牡丹內(nèi)生細菌Mdgb4 5發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的平板抑菌作用。
[0030]對篩選得到的拮抗菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測其發(fā)酵液的抑菌活性。挑取拮抗菌株單菌落于NA培養(yǎng)基中28°C過夜振蕩培養(yǎng)，取600yL加入20 mL新鮮液體PDA培養(yǎng)基中55 °C振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液10 OOOXg 4°C離心2 min后，取上清用0.22μ m的無菌濾膜過濾除菌。平板擴散法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性，無菌操作取ΙΟΟμ?Χ?.0 X 17 cfu/mL)金黃色葡萄球菌均勻涂布于倒有固體NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心放上3個無菌牛津杯，然后在每個牛津杯中分別加入10yL的拮抗菌株的發(fā)酵上清液，37°C恒溫培養(yǎng)24h后，測定抑菌圈直徑，每處理重復(fù)三次。試驗結(jié)果抑菌圈平均直徑值為4mm。其中以實施例7的方法進行培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液抑制效果最好。
[0031 ] 實施例9:牡丹內(nèi)生細菌Mdgb45的蛋白粗提液對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的平板抑菌作用。
[0032]將篩選得到的菌株于NA液體培養(yǎng)基中活化過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)液3mL接種于80mLPDA培養(yǎng)基中32°C振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液10000r/min離心20 min去菌體，取上清液，按分級沉淀法加入不同飽和度的硫酸銨，混勻，4°C靜置過夜。鹽析液1000r /min、4°C下離心15min，收集沉淀。磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH 7)溶解沉淀，裝入透析袋(透析袋截流分子量為8 kDa)中透析48 h。透析袋內(nèi)溶液即為拮抗菌株的胞外蛋白粗提液。用孔徑為0.22 μπι的無菌濾膜過濾蛋白粗提液，平板擴散法測定其抑菌活性，無菌操作取ΙΟΟμ?Χ?.0 XlO7 cfu/mL)金黃色葡萄球菌均勻涂布于倒有固體NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心放上3個無菌牛津杯，然后在每個牛津杯中分別加入10yL的拮抗菌株的蛋白粗提液，37°C恒溫培養(yǎng)24h后，測定抑菌圈直徑，每處理重復(fù)三次。
[0033]試驗結(jié)果如圖4所示，內(nèi)生細菌菌株Mdgb45菌株的蛋白粗提液對金黃色葡萄球菌具有強烈的抑菌作用，抑菌圈平均直徑值為30.5mm。
[0034]以上所述的僅是本發(fā)明的一些實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出其它變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌st//?ii7is)Mdgb45，該菌株已在2016年I月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號是GDMCC NO:60009o2.—種分離純化權(quán)利要求1所述的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于包括: 步驟①:從生長狀態(tài)良好的牡丹根上剝?nèi)「?，之后將根皮漂洗、沖洗、消毒、再沖洗后晾干作為樣品，備用； 步驟②:將最后一次沖洗用的液體涂布于平板中作為對照組，并在溫度為28°C下恒溫培養(yǎng)； 步驟③:將步驟①制得的樣品放入無菌研缽中研磨至均勻，靜置后取上清液并按1:9的比例稀釋為2個梯度，之后把兩個梯度的溶液涂布于固體平板上，并在溫度為28°C的條件下培養(yǎng)，把每一個梯度再做3個重復(fù)，然后將對照組和樣品組的兩個梯度分別在平板上培養(yǎng)，用平板劃線法對不同的菌落進行分離、純化，即獲得分離純化后的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述分離純化牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于:步驟①中漂洗根皮所用乙醇的質(zhì)量百分比濃度為70-80%。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述分離純化牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于:步驟②中消毒根皮的具體方法是將根皮置于質(zhì)量百分比濃度20-40%的次氯酸鈉中浸泡2-4min。5.一種收集權(quán)利要求1-4中任一項所述的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的方法，其特征在于包括:將牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌放于溫度為28 0C的NA培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基中25-55 °C振蕩培養(yǎng)24-72h，然后收集培養(yǎng)液，并在溫度為4 °C、轉(zhuǎn)速為1000g的情況下離心2min，收集上清液并用0.22μ m的無菌濾膜過濾除菌即得所述的發(fā)酵液。6.如權(quán)利要求1所述的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌于防治金黃色葡萄球菌病原菌中的應(yīng)用。7.—種防治金黃色葡萄球菌病原菌的生防菌，其特征在于包括權(quán)利要求1-6中任一項所述的拮抗金黃色葡萄球菌的牡丹內(nèi)生枯草芽孢桿菌。
【文檔編號】A61K35/742GK105907658SQ201610174473
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年3月25日
【發(fā)明人】王祖華, 楊瑞先, 宋根娣, 劉萍, 王佳偉, 萬珊
【申請人】洛陽理工學(xué)院