一株對多種植物病原真菌具有拮抗作用的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌及其分離方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenifomis）菌株，保藏編號為CGMCC No.9048，標(biāo)記為TG119。菌株為真菌特異性生防菌，在NA培養(yǎng)基上菌落呈扁平圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不產(chǎn)生色素，全株為乳白色，革蘭氏染色為陽性；掃描電鏡觀察為棍棒狀，大小為（0.7~0.9）μm×（3~6）μm。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)和16S rRNA序列綜合分析結(jié)果，將TG116菌株初步鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。試驗顯示，TG119菌株對供試的七種植物病原菌均有良好抑制作用，為廣譜型抑制菌，適用于農(nóng)業(yè)生防菌加以開發(fā)利用。CGMCC NO.904820140414
【專利說明】
一株對多種植物病原真菌具有拮抗作用的獨角蓮內(nèi)生地衣芽 孢桿菌及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一株地衣芽孢桿菌菌株，尤其涉及一種對多種植物病原真菌具有拮抗 作用的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌菌株;本發(fā)明同時涉及該獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌菌株的 分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 獨角蓮（7>j〇Ao/3it/? Engl)為中國特有植物，屬于天南星科 (Araceae)、犁頭尖屬（7yAo/3it/?)，它的干燥塊莖被用作藥材，常稱為"禹白附"；其化學(xué)成分 豐富且藥理作用廣泛，具有抗菌抗炎、抗腫瘤、抗破傷風(fēng)毒素、免疫調(diào)節(jié)、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、祛風(fēng) 痰等功效;且獨角蓮在生長過程中幾乎不感染病蟲害，根據(jù)藥用植物內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主 相似甚至相同的活性物質(zhì)，且某些活性物質(zhì)可能參與到了植物的抗菌過程中，推測與獨角 蓮協(xié)同進(jìn)化的內(nèi)生菌也具有其獨特性。
[0003] 從獨角蓮塊莖中分離得到一株對多種植物病原真菌均有良好抑制作用的內(nèi)生菌 ，并命名為TGI 19。植物內(nèi)生菌與宿主植物在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中形成 了十分密切的關(guān)系，內(nèi)生菌在從宿主植物獲得穩(wěn)定生活環(huán)境的同時也會通過產(chǎn)生水解酶 類、抗生素類和生物堿類等代謝產(chǎn)物，與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性 以及增強植物的抵抗力等途徑發(fā)揮生物防治作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株對多種植物病原真菌具有拮抗作用的獨角蓮內(nèi)生地衣 芽孢桿菌； 本發(fā)明的另一目的是提供一種上述獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌的分離方法。
[0005] -、獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌 本發(fā)明的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌菌株歸于芽孢桿菌屬，記為 TG119。保藏編號為CGMCC No.9048，保藏日期為2014年4月14日，保藏單位：中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編 100101。
[0006] 本發(fā)明的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌TG119，為真菌特異性生防菌，菌株在NA培養(yǎng)基 上菌落呈扁平圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不產(chǎn)生色素，全株為乳白色，革蘭氏染色為陽 性;掃描電鏡觀察為棍棒狀，大小為(〇 · 7~0 · 9)μL? X (3~6)μL?(見圖1)。
[0007] 二、獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌的分離及純化 獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌的分離方法:對獨角蓮塊莖進(jìn)行表面清毒處理后，在無菌條 件下切成大小約〇.5cmXO.5cm的組織塊，置于分離培養(yǎng)基上，使切口面與培養(yǎng)基接觸;置于 37°C培養(yǎng)2~5天;待組織塊周圍長出菌落后，挑取轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，劃線法純化，得到純 的真菌菌株，保存?zhèn)溆谩?br>[0008] 獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)、分離、純化采用的培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (NA)，其組成成分為：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂18g，加水定容至1000mL， ρΗ7·0~7·2〇
[0009] 三、獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌TGI 19的生理生化鑒定 1、 生理生化鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對TG119進(jìn)行生理生化鑒定，實驗結(jié)果見表1:
2、 16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用細(xì)菌通用引物PCR擴增16S rRNA，擴增片段純化后克隆并測序，將TG119菌株的16S rRNA序列向GenBank提交，其序列登錄號為KJ145796。測序結(jié)果同源比對顯示，TG119菌株 16S rRNA序列與芽孢桿菌屬16S rRNA高度相似?；蛐蛄幸娦蛄斜??；?6S rRNA序列構(gòu) 建的TG116菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。
[0010] 上述分離的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌TG119的生長曲線（圖3)顯示，0~8 h生長緩 慢，處于遲緩期;8~20h活菌數(shù)增長迅速，處于對數(shù)生長期；20h之后曲線平穩(wěn)，生長進(jìn)入穩(wěn)定 期，20~48h處于穩(wěn)定生長期;接種48h后進(jìn)入衰退期。 上述分離的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌可在PDA培養(yǎng)基上生長，溫度對TG119菌株的生長 影響較大，其在20~60°C范圍內(nèi)均能生長，生長溫度范圍較廣，最適生長溫度為45°C (見圖 4)〇
[0011] 結(jié)合上述形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)和16S rRNA序列綜合分析結(jié)果，將TG116菌株初步 鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。在菌種保藏的過程中，中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心也對菌種進(jìn)行了進(jìn)一步的確證，確認(rèn)為地衣芽孢桿菌。
[0012] 四、獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌TG119對植物病原真菌的抑制作用 采用異步培養(yǎng)法、平板對峙法研究TGI 19菌株對植物病原真菌的抑制能力:將活化和擴 大培養(yǎng)后的供試植物病原真菌打成直徑為6mm的菌餅，并分別將其移入PDA平板培養(yǎng)基上， 等其長到2cm時將牛津杯放在兩個對稱的位置，里面接入0.2ml細(xì)菌菌懸液，28 °C培養(yǎng)7d。按 下式計算TG119菌株對植物病原真菌的抑制率： 抑菌率(％)=(對照的菌落直徑-產(chǎn)生抑菌圈的菌落直徑)/對照的菌落直徑X 1 〇〇% 圖5為異步培養(yǎng)法用本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌 菌株發(fā)酵液處理組供試植物病原菌與對照組的平板培養(yǎng)狀況圖；圖6為平板對峙法用本發(fā) 明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌2ide/3i/〇ffii\s)TG119菌株菌液處理供試植物病原 菌的平板培養(yǎng)狀況圖。圖5、6顯示，異步培養(yǎng)法處理組供試植物病原菌與對照組相比也幾乎 不生長，表明TG119菌株發(fā)酵液中含有對供試植物病原菌有強抑制作用的物質(zhì)。通過平板對 峙法(圖7)對菌株的抑制能力做了定量評價，結(jié)果如表2所示。顯示TG119菌株對供試的七種 植物病原菌均有良好抑制作用，為廣譜型抑制菌，適用于農(nóng)業(yè)生防菌加以開發(fā)利用。
[0013] 五、TG119菌株的應(yīng)用 本實驗從獨角蓮塊莖內(nèi)分離到的TG119菌株對7種供試植物病原真菌均有良好的抑制 作用，為廣譜型植物病原真菌拮抗菌，能夠使病原菌菌絲扭曲、變形等。對TG119進(jìn)行形態(tài) 學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，其形態(tài)學(xué)和生理生化反應(yīng)與芽孢桿菌屬特征基本相 似，16S rRNA序列的比對分析顯示TG119菌株屬于芽孢桿菌屬，與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)同源性高達(dá)99%，與形態(tài)學(xué)和生理生化反應(yīng)結(jié)果一致，因而確定TG119菌株 為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。地衣芽孢桿菌能夠代謝產(chǎn)生抗生素和抗菌蛋 白等多種物質(zhì)，在工業(yè)及醫(yī)藥業(yè)應(yīng)用廣泛，在植物病害的防治中也具有利用價值，是一種具 有極高應(yīng)用價值的微生物。TG119豐富了內(nèi)生地衣芽孢桿菌的資源，為生物防治作物病害提 供了新的微生物資源，且本研究表明，TG119菌株生長繁殖快，酸堿條件和溫度環(huán)境適應(yīng)范 圍廣泛，抑菌譜廣，這些都顯示了該菌在植物病害生物防治方面的潛在應(yīng)用價值，其防病機 理、促生作用、實用發(fā)酵條件及田間應(yīng)用效果等還需做進(jìn)一步研究。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌(feciDus 2icAe/3i/〇ffiis)TG119菌株在電 鏡下的圖片； 圖2為本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌菌株和相近菌 株的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖； 圖3為本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌2ide/3i/o/w\s)TG119菌株生長曲線 圖； 圖4為本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌菌株最適溫度 圖； 圖5為異步培養(yǎng)法用本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌 菌株發(fā)酵液處理組供試植物病原菌與對照組的平板培養(yǎng)狀況圖； 圖6為平板對峙法用本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌2ide/3i/〇ffii\s)TG119 菌株菌液處理供試植物病原菌的平板培養(yǎng)狀況圖； 圖7為本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌2ide/3i/〇ffii\s)TG119菌株的抑菌率 圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面通過具體實施例對本發(fā)明獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌的分離鑒定作進(jìn)一步說 明。該方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0016] 1、材料 健康獨角蓮(T. giganteun Engl.)植株，采自甘肅隴南文縣。供試植物病原真菌為辣 椒疫霉病菌（Phytophthora capsici)、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici)、馬鈴薯 立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、黃瓜枯萎病 菌（Fusarium oxysporum)、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea)、番瓜綿疫病菌（Pythium aphanidermatum)，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈。
[0017] 獨角蓮內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化和培養(yǎng)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)，植物病原真菌的 培養(yǎng)及拮抗性實驗采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA):牛肉浸膏3 g，蛋白胨l〇g，氯化鈉5g，瓊脂18g，加水定容至1000mL，pH7.0~7.2;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng) 基(PDA):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0018] 2、枯草芽孢桿菌TG119的分離與純化 對獨角蓮塊莖進(jìn)行表面清毒，取表面消毒處理后的獨角蓮塊莖，無菌條件下切成大小 約0.5cm X 0.5cm的組織塊，置于分離培養(yǎng)基上，使切口面與培養(yǎng)基接觸，置于37 °C培養(yǎng)2~ 5d，待組織塊周圍長出菌落后，挑取轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，劃線法純化后在低溫冰箱作短期 保存或長期保存。利用漂洗液檢驗法和組織印跡法設(shè)兩種空白對照。TG119為分離菌株中的 一株。
[0019] 3、枯草芽孢桿菌TG119的形態(tài)觀察及生理生化分析 圖1為本發(fā)明分離的TG119菌株的電鏡電鏡圖片。掃描電鏡顯示，TG119菌株為棍棒狀， 大小為(0.7~〇·9)μηι X(3~6)ym。
[0020] TG119菌株在ΝΑ培養(yǎng)基上菌落呈扁平圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不產(chǎn)生色素， 全株為乳白色，革蘭氏染色為陽性，為真菌特異性生防菌。
[0021] 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對TG119進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見表1。
[0022] 4、枯草芽孢桿菌TG119的16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用菌落PCR的方法擴增TG119的16S rRNA片段。將30yL無菌水加入1.5mL離心管中并 挑取少量菌體于水中制成懸液，先煮沸l(wèi)〇min，再迅速放入冰中5min，以I^OOOrmirT1離心 l〇min后的上清液作為PCR模板，采用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴增菌株TG119的16S rRNA。 所得序列經(jīng)校對后與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行BLAST比對分析，用MEGA6.0軟件采 用鄰接(Neighbor-Joining)聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0023] PCR擴增引物序列如下： 27F (5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '） 1492R(5'-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3'） ?〇財廣增條件為：95°(：預(yù)變性51^11，95°(：變性3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸9〇8,30個循 環(huán);72°C終延伸lOmin。
[0024] 地衣芽抱桿菌_/icAe/3i/b?is)TGl 19的 16SrRNA序列見序列表。
[0025] 結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)和16S rRNA序列綜合分析結(jié)果，將TG116菌株初步鑒定 為地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)〇
【主權(quán)項】
1. 一株對多種植物病原真菌具有拮抗作用的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌，保藏編號為 CGMCC No .9048,標(biāo)記為TGl 19。2. 如權(quán)利要求1所述對多種植物病原真菌具有拮抗作用的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌， 其特征在于:菌株為真菌特異性生防菌，在NA培養(yǎng)基上菌落呈扁平圓形，邊緣不規(guī)則，表面 較光滑，不產(chǎn)生色素，全株為乳白色，革蘭氏染色為陽性；掃描電鏡觀察為棍棒狀，大小為 (0·7~0·9)μηιΧ(3~6)μηι。3. 如權(quán)利要求1所述對多種植物病原真菌具有拮抗作用的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌的 分離方法，將獨角蓮塊莖進(jìn)行表面清毒處理后，在無菌條件下切成大小約0.5cmX0.5cm的 組織塊，置于分離培養(yǎng)基上，使切口面與培養(yǎng)基接觸;置于37°C培養(yǎng)2~5天，待組織塊周圍長 出菌落后，挑取轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，劃線法純化后保存。4. 如權(quán)利要求1所述對多種植物病原真菌具有拮抗作用的獨角蓮內(nèi)生地衣芽孢桿菌的 分離方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，其組成成分為:牛肉浸膏3g，蛋白胨 10區(qū)，氯化鈉58，瓊脂18 8，加水定容至10001^，？!17.0~7.2。
【文檔編號】C12N1/02GK105907655SQ201610117215
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年3月2日
【發(fā)明人】令利軍, 白雪, 姚彥敏, 何楠
【申請人】西北師范大學(xué)