專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其制劑和制備方法以及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌菌種、利用所述菌種制成的制劑、所述制劑的制備方法、所述菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用和所述制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人們對于食品安全和環(huán)境保護的日益關(guān)注，“有機農(nóng)業(yè)”已成為農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向，而開發(fā)出低毒、高效、低殘留的純天然生物農(nóng)藥已經(jīng)成為近來農(nóng)藥研究的新方向。但由于生物農(nóng)藥的局限性，其通常藥效較低，作用緩慢，價格高，所以難于被農(nóng)民接受。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，具有顯著的抗菌活性和極強的抗逆能力?？莶菅挎邨U菌菌體生長過程中會產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。同時枯草芽孢桿菌還能分泌大量幾丁質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶可分解病原真菌的細胞壁而抑制真菌病害。枯草芽孢桿菌生長快、營養(yǎng)簡單，能產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽孢，其芽孢具有抗逆性強、 利于保藏的特點，又能忍受極端的外部環(huán)境而長期存活，可以制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型或與化學(xué)農(nóng)藥混用而不失活。因此有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，而且批量生產(chǎn)工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。國內(nèi)外學(xué)者在枯草芽孢桿菌防治植物病害方面進行了大量研究。一些枯草芽孢桿菌優(yōu)勢菌株已經(jīng)作為生物農(nóng)藥投入到植物病害應(yīng)用中。目前，該菌已在黃瓜、 辣椒、水稻、小麥、玉米、棉花等農(nóng)作物上應(yīng)用并顯現(xiàn)出很好的病害防治效果。如申請?zhí)枮?200910148250. 9的中國發(fā)明專利，公開了一種枯草芽孢桿菌微生物菌劑和復(fù)合微生物菌劑，該微生物菌劑和該復(fù)合微生物菌劑可以抑制茄子菌核菌和番茄灰霉菌等病原菌，克服現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)農(nóng)藥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全性差等缺陷，以實現(xiàn)環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安全性好的優(yōu)點。該微生物菌劑和復(fù)合微生物菌劑的抗菌譜較廣，但是抗菌效果并不是很好，尤其是針對作物霉菌特別是霜霉菌的殺滅或抑制效果有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問題提供一種枯草芽孢桿菌。一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌的菌株已于2012年12月沈日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址北京市朝陽區(qū)人屯路，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5652。該枯草芽孢桿菌的生物學(xué)命名為feciB^s subtilis。本發(fā)明的另一個目的是提供一種枯草芽孢桿菌制劑，它是由所述的枯草芽孢桿菌菌株經(jīng)過發(fā)酵制成，包含有枯草芽孢桿菌菌體及其次生代謝產(chǎn)物。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述制劑為可濕性粉劑。本發(fā)明的再一個目的是，提供所述的一種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法。
一種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，包括以下步驟
①將取出的菌株進行轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基選擇為LB或PSA；
②挑選活化的單菌落，再進行培養(yǎng)；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按0.5 4%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④20 30°C培養(yǎng)1 3天；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，麥芽糖0. 0.4%，玉米粉0. 5% 0. 8%，黃豆粉0. 4% 0. 9%，胰蛋白胨0. 5% 1. 0%, CaCl2 0. 02% 0. 08%,MnSO4 0. 05% 0. 08%, K2HPO4 0. 1% 0. 6%，余下為水。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，它還包括以下步驟
⑤將經(jīng)過步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護劑經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述比例為按質(zhì)量百分比計，發(fā)酵液60 70%，助劑5 15%，穩(wěn)定劑1 5%，保護劑 0. 05 0. 2%，載體填料補足100% ；
所述助劑為縮聚萘磺酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙二醇、烷基萘磺酸鹽、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽、SDS、DBS中的一種或多種；
所述穩(wěn)定劑為CaC03、K2HP04、K3PO4、羧甲基纖維素鈉、CaCl2、NaCl中的一種或多種； 所述保護劑為玉米淀粉、大米粉、維生素C、羧甲基纖維素、糊精、熒光增白劑中的一種或多種；
所述載體填料為硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣、白炭黑、膨潤土、滑石粉、高嶺土中的一種或多種。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述液體培養(yǎng)基的pH為6. 0 8. 0。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟②中，在挑選出活化的單菌落后，在新的LB或PSA 液體培養(yǎng)基中，在觀 35°C，培養(yǎng)15 48小時。本發(fā)明的再一個目的是提供所述的菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的是提供所述制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用。本發(fā)明的還有一個目的是提供所述制劑在防治作物霜霉菌病害方面的應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌制劑主要來自枯草芽孢桿菌發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)處理后得到枯草芽孢桿菌制劑產(chǎn)品。通過體外植物活體試驗表明，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌制劑對防治作物霉菌病害方面具有一定的作用；尤其是對農(nóng)作物的霜霉菌病具有顯著的防治作用。
具體實施例方式本具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。實施例一
一種可濕性粉劑，它是通過以下方法制備的 1、液體發(fā)酵培養(yǎng)①菌種活化
菌株自-70°C冰箱取出后，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基PSA ；
②種子菌液制備
挑取單菌落，在新的液體種子培養(yǎng)基PSA中，28°C，ISOrpm，培養(yǎng)15小時；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按0.5%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④200rpm，20°C培養(yǎng) 3 天；
⑤將經(jīng)過步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護劑，經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，麥芽糖0. 2% ；玉米粉，0. 5% ；黃豆粉，0. 4% ； 胰蛋白胨，0. 5% ；CaCl2,0. 02% ；MnSO4,0. 05% ;Κ2ΗΡ04，0· 1% ；余下為水；所述液體培養(yǎng)基的ρΗ 為 7.0 ；
所述比例為按質(zhì)量百分比計，發(fā)酵液60%，助劑5%，穩(wěn)定劑1%，保護劑0. 05%,載體填料補足100% ；
所述助劑為縮聚萘磺酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉三種； 所述穩(wěn)定劑為羧甲基纖維素鈉； 所述保護劑為糊精和熒光增白劑兩種； 所述載體填料為硅藻土和輕質(zhì)碳酸鈣。實施例二
一種可濕性粉劑，它是通過以下方法制備的 1、液體發(fā)酵培養(yǎng)
①菌種活化
菌株自-70°C冰箱取出后，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基LB ；
②種子菌液制備
挑取單菌落，在新的液體種子培養(yǎng)基LB中，30°C，200rpm，培養(yǎng)18小時；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④230rpm，25°C 培養(yǎng) 2 天；
⑤將經(jīng)過步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護劑經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，麥芽糖0. 3% ；玉米粉，0. 6% ；黃豆粉，0. 6% ； 胰蛋白胨，0. 8% ；CaCl2,0. 05% ；MnSO4,0. 06% ;Κ2ΗΡ04，0· 4% ；余下為水；所述液體培養(yǎng)基的ρΗ 為 6.5 ；
所述比例為按質(zhì)量百分比計，發(fā)酵液65%，助劑10%，穩(wěn)定劑3%，保護劑0. 1%，載體填料補足100% ；
所述助劑為聚乙烯醇、聚乙二醇兩種； 所述穩(wěn)定劑為CaC03、CaCl2^NaCl三種； 所述保護劑為大米粉； 所述載體填料為白炭黑。實施例三
一種可濕性粉劑，它是通過以下方法制備的1、液體發(fā)酵培養(yǎng)
①菌種活化
菌株自-70°C冰箱取出后，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基PSA ；
②種子菌液制備
挑取單菌落，在新的液體種子培養(yǎng)基PSA中，35°C，220rpm，培養(yǎng)20小時；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按4%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④250rpm，30°C培養(yǎng) 1 天；
⑤將經(jīng)過步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護劑經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，麥芽糖0. 4% ；玉米粉，0. 8% ；黃豆粉，0. 9% ； 胰蛋白胨，1. 0% ；CaCl2,0. 08% ；MnSO4,0. 08% ;Κ2ΗΡ04，0· 6% ；余下為水；所述液體培養(yǎng)基的ρΗ 為 7.5 ；
所述比例為按質(zhì)量百分比計，發(fā)酵液70%，助劑15%，穩(wěn)定劑5%，保護劑0. 2%，載體填料補足100% ；
所述助劑為烷基萘磺酸鹽、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽兩種； 所述穩(wěn)定劑為Κ2ΗΡ04、K3PO4兩種； 所述保護劑為玉米淀粉、維生素C兩種； 所述載體填料為膨潤土和滑石粉。使用上述制劑對作物霜霉病進行測試，方法如下 稱取0. 5g干粉菌劑溶于IOOml水中，攪拌均勻得菌懸液。選擇一株真葉期長勢一致盆栽植株，用油性記號筆寫上標(biāo)簽編號，按序排放，供實驗用。分別將實驗組和陽性對照(嘧菌脂500倍液)的藥液噴在植株真葉上，空白照組將清水噴在植株真葉上，以剛好不滴下液滴為準(zhǔn)。噴霧處理后將試材在通風(fēng)處陰干。孢子液制備，將葉片背面的孢子洗下后，觀察，一個視野在100倍鏡下大約有10 50個孢子左右即可使用。將孢子液均勻地噴到試材上，放在黑暗處處理M小時，之后正常的開關(guān)燈。培養(yǎng)溫度25 °C左右，濕度80%左右。一般發(fā)病5 10天，可以查病。結(jié)果統(tǒng)計分級 0級無??；
1級病斑面積占整片葉面積的5%以下； 3級病斑面積占整片葉面積的6-10% ； 5級病斑面積占整片葉面積的11-20% ； 7級病斑面積占整片葉面積的21-40% ； 9級病斑面積占整片葉面積的40%以上。結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌的菌株已于2012年12月沈日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No. 5652。
2.一種枯草芽孢桿菌制劑，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株經(jīng)過發(fā)酵制成，包含有枯草芽孢桿菌菌體及其次生代謝產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑，其特征在于所述制劑為可濕性粉劑。
4.權(quán)利要求2所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，包括以下步驟①將取出的菌株進行轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基選擇為LB或PSA；②挑選活化的單菌落，再進行培養(yǎng)；③將培養(yǎng)好的液體菌種，按0.5 4%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；④20 30°C培養(yǎng)1 3天；所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，麥芽糖0. 0.4%，玉米粉0.5% 0. 8%,黃豆粉0. 4% 0. 9%,胰蛋白胨0. 5% 1. 0%, CaCl2 0. 02% 0. 08%,MnSO4 0. 05% 0. 08%, K2HPO4 0. 1% 0. 6%，余下為水。
5.權(quán)利要求4所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在干，它還包括以下步驟⑤將經(jīng)過步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護劑，經(jīng)粉碎制得所述制劑；所述比例為按質(zhì)量百分比計，發(fā)酵液60 70%，助劑5 15%，穩(wěn)定劑1 5%，保護劑 0. 05 0. 2%，載體填料補足100% ；所述助劑為縮聚萘磺酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙ニ醇、烷基萘磺酸鹽、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽、SDS、DBS中的ー種或多種；所述穩(wěn)定劑為CaC03、K2HPO4, K3PO4、羧甲基纖維素鈉、CaCl2、NaCl中的ー種或多種； 所述保護劑為玉米淀粉、大米粉、維生素C、羧甲基纖維素、糊精、熒光增白劑中的ー種或多種；所述載體填料為硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣、白炭黑、膨潤土、滑石粉、高嶺土中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基的PH值為6.0 8.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于步驟②中， 在挑選出活化的單菌落后，在新的LB或PSA液體培養(yǎng)基中，在觀 35°C，培養(yǎng)15 48小時。
8.權(quán)利要求1所述的菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2或3所述的制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2或3所述的制劑在防治作物霜霉菌病害方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌菌種、利用所述菌種制成的制劑、所述制劑的制備方法、所述菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用和所述制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌的生物學(xué)命名為Bacillussubtilis，已于2012年12月26日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址:北京市朝陽區(qū)人屯路，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.5652。通過體外植物活體試驗表明，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌制劑對防治作物霉菌病害方面具有一定的作用；尤其是對農(nóng)作物的霜霉菌病具有顯著的防治作用。
文檔編號C12R1/125GK102533608SQ20121001712
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者張海風(fēng), 張鵬, 沈婷婷, 榮躍文, 高丙利 申請人:高丙利