多肽及其胰菠酶片組合物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)或多肽技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及新的多肽及其藥物組 合物，優(yōu)選還涉及其與其他活性成分組成的胰菠酶片等。另外，本發(fā)明還涉及上述化學(xué)產(chǎn)品 的制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用等。
【背景技術(shù)】
[0002] Phlogenzym片，也稱二酶片或胰菠酶片，其活性成分主要由蛋白質(zhì)組成，用于減輕 創(chuàng)傷后和手術(shù)后水腫，縮短血塊凝聚時間，減緩腫脹和炎癥引起的疼痛，并可用于諸如血栓 性靜脈炎、泌尿生殖道炎癥、關(guān)節(jié)炎（如，慢性關(guān)節(jié)炎）和軟組織風濕病等疾病的治療。然 而，由于在制備片劑時通常需要高溫壓片，對于含蛋白質(zhì)的制劑來說，特別容易使得蛋白質(zhì) 活性降低，因此需要加入更大量的活性蛋白質(zhì)。而且，高溫變性的蛋白質(zhì)也更容易引起過敏 反應(yīng)，增加了潛在的安全性隱患。
[0003] 為此，中國專利申請第200410030650. 7號等現(xiàn)有技術(shù)通過直接裝入腸溶性膠囊 來避免高溫壓片，但是這并沒有從根本上改變活性蛋白質(zhì)的性質(zhì)，尤其是長時間高溫儲存 的穩(wěn)定性。
[0004] 然而，本發(fā)明人沒有受現(xiàn)有技術(shù)"走捷徑"的方式影響而通過制劑類型和配方等方 式來入手，而是從更為本質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造入手，經(jīng)過艱苦的研宄和長期的實踐，令人意外地研 發(fā)出一種新的多肽，其相對于野生型蛋白質(zhì)（參見GenBank登錄號BAA21929. 1)，具有更好 的穩(wěn)定性，特別適合實際的儲運和保存。另外，本發(fā)明人還研發(fā)了一種新的二酶片的生產(chǎn)工 藝，充分利用了其高溫儲存的穩(wěn)定性，可以直接采用現(xiàn)有高溫噴霧包衣的設(shè)備，這與現(xiàn)有的 腸溶膠囊的改進方向正好相反，也不必額外購買制備Ph 1 〇genzym片的低溫設(shè)備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題在于提供新的多肽及其藥物組合物，優(yōu)選是胰菠酶 片。另外，本發(fā)明還涉及上述化學(xué)產(chǎn)品的制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用等。
[0006] 具體而言，在第一個方面，本發(fā)明提供了多肽，其氨基酸序列
[0007] (1)如 SEQIDNO :2 所示；或
[0008] (2)是在SEQIDNO :2所示序列上添加、缺失和/或取代一個或幾個氨基酸殘基 而得的。
[0009] 本發(fā)明的第一個方面的多肽的氨基酸序列可以是在SEQIDNO :2所示序列上添 加、缺失和/或取代一個或幾個（優(yōu)選一個至五個，更優(yōu)選一個至三個）氨基酸殘基而得的 氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達載 體，可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實 驗指南》（北京：科學(xué)出版社，2002年）等本領(lǐng)域公知的文獻中。在取代的氨基酸殘基中，優(yōu) 選取代為與原氨基酸殘基側(cè)鏈性質(zhì)相似的其他氨基酸，從而更得以保持原有功能活性。側(cè) 鏈性質(zhì)相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸仏、1、1』4、？、1、￥、￥)、親水性氨基酸〇?、0、隊 C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側(cè)鏈的氨基酸（G、A、V、L、I、P)、含羥基側(cè)鏈的氨基酸（S、T、 Y)、含硫原子側(cè)鏈的氨基酸（C、M)、含羧酸和酰胺側(cè)鏈的氨基酸（D、N、E、Q)、含堿性基團側(cè) 鏈的氨基酸（R、K、H)、含芳香族側(cè)鏈的氨基酸（H、F、Y、W)。在本發(fā)明的【具體實施方式】中，多 肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 本發(fā)明的第一個方面的多肽具有GenBank登錄號BAA21929. 1所述的野生型蛋白 質(zhì)的酶活性，例如可以根據(jù)Harrach等（J Protein Chem, 14:41-52)所述的蛋白酶活性檢 測方法來進行。
[0011] 優(yōu)選本發(fā)明的第一個方面的多肽相對于GenBank登錄號BAA21929. 1所述的野生 型蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性提高，優(yōu)選是耐高溫穩(wěn)定性和/或長期保存穩(wěn)定性的提高。在經(jīng)歷高溫 和/或一段時間后測定本發(fā)明的第一個方面的多肽和野生型蛋白質(zhì)各自的酶活性，可以方 便地顯示出本發(fā)明的第一個方面的多肽的優(yōu)勢。其中，GenBank登錄號BAA21929. 1是記錄 于公共數(shù)據(jù)庫的現(xiàn)有技術(shù)，其描述了提取自植物的野生型蛋白質(zhì)（酶），目前多直接采用從 植物中提取的方法來獲得，幾乎沒有現(xiàn)有技術(shù)對其進行基因工程改造，所以更加無法通過 該野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列來獲得本發(fā)明的第一個方面的多肽。
[0012] 在第二個方面，本發(fā)明提供了多核苷酸，其編碼本發(fā)明的第一個方面的多肽。本發(fā) 明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優(yōu)選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA 和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、重組法或人 工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得編碼本發(fā)明的第一個方面的多肽的核酸分子或其 片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細胞，然后通過 培養(yǎng)宿主細胞進行增殖。優(yōu)選本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。該優(yōu) 選序列優(yōu)化了在酵母中的分泌表達。
[0013] 在第三個方面，本發(fā)明提供了一種載體，其含有本發(fā)明第二個方面所述的多核苷 酸。本文中的術(shù)語"重組表達載體"、"表達載體"或"載體"，在此可以交互替換使用，是指本 領(lǐng)域中常用的細菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒 載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于：在細菌中表達用的載體（原核表達載體）、在酵 母中表達用的載體（如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等）、在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒載 體、在哺乳動物細胞中表達用的載體（痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴 病毒載體等）、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。 總之，只要能在宿主細胞中穩(wěn)定復(fù)制，任何質(zhì)粒和載體都可使用。優(yōu)選表達載體包含選擇標 記基因，如細菌的氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性 基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標 志，如His, Leu, Trp等；真核細胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基 因及熒光蛋白標記基因等。本發(fā)明的載體優(yōu)選為真核載體，更優(yōu)選是酵母表達載體。
[0014] 在第四個方面，本發(fā)明提供了細胞，其含有本發(fā)明第二個方面所述的多核苷酸。該 細胞可以用本發(fā)明第三個方面所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染而獲得。細胞可以是原核細胞，也可 以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。細胞在轉(zhuǎn)化 或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化細胞或細胞株，可用于生 產(chǎn)所需融合蛋白。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法包括但不限于：用于細菌細胞，如氯化鈣法、電穿 孔法；用于酵母細胞，如電穿孔法和原生質(zhì)體融合法；用于哺乳動物細胞等，如質(zhì)體包裹、 磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法。優(yōu)選本發(fā)明的細胞是酵母細胞。
[0015] 在第五個方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的第一個方面的多肽的方法，其包括在 適合蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明第四個方面所述的細胞，然后從培養(yǎng)物中分離出本發(fā) 明的第一個方面的多肽。分離的方法包括但不限于：裂菌（超聲波裂菌、滲透壓裂菌），離 心，鹽析，分子篩色譜（又稱為分子尺寸排阻色譜），離子交換色譜，吸附色譜（親和層析、金 屬鏊合層析），反向色譜，高效液相色譜，毛細管電泳，等電聚焦以及變性/復(fù)性處理等。
[0016] 在第六個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明的第一個方面的多肽和 藥學(xué)上可接受的載體。本文中所用的"藥物組合物"或"藥物"或"藥品"，如不特別指明，指 的是人用的藥物組合物或藥物或藥品。本文中使用的藥學(xué)上可接受的載體指無毒的填充 劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、佐劑或其他制劑輔料。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)治療目的、給藥途 徑（如注射或口服）的需要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該組合物為單位劑量形式，如 凍干劑、片劑、膠囊、粉劑、乳液劑、注射劑或噴霧劑，