專利名稱：實時定量pcr技術檢測人21號染色體數(shù)目的方法
技術領域：
本發(fā)明屬分子生物學，涉及檢測染色體數(shù)目的方法，尤其涉及應用多重實時定量PCR技術檢測人21號染色體數(shù)目的方法。
背景技術：
21三體綜合征(簡稱21三體，又稱唐氏綜合征或先天愚型)是人類最常見的染色體病，在活產嬰中發(fā)病率約為1/600[1]，表現(xiàn)為21號染色體數(shù)目異常，即患者在正常兩條的基礎上多了一條(或多了部分21號易位染色體)。該病患者有嚴重的智力發(fā)育遲緩，且易并發(fā)心臟病、白血病，免疫功能低下，患兒早期死亡率高。目前該病尚無有效的治療方法，主要是通過產前診斷來避免缺陷兒的出生。經典的先天愚型的產前診斷主要是依靠細胞遺傳學的方法，即對培養(yǎng)的羊水細胞、絨毛間葉細胞或胎兒血細胞進行核型分析，準確但效率低，難以滿足臨床的需求。
隨著分子生物學技術的發(fā)展，出現(xiàn)了幾種快速分子診斷21三體的方法，如熒光原位雜交(FISH)、同源基因定量PCR方法(HGQ-PCR)、基于多態(tài)性位點的PCR檢測(STR-PCR)等新技術。其中，F(xiàn)ISH操作復雜，通常是作為一種輔助性檢測方法用于疑難病例的分析[2]；HGQ-PCR雖然快捷，但準確性較差，且需要昂貴的光密度掃描儀，普及應用有障礙[3]；STR-PCR目前研究較多，但該法對純合子診斷困難[4][5]，且需要電泳來判斷，容易受到主觀因素的影響。因此，臨床仍期待著準確、實用、易于普及、能滿足大規(guī)模臨床應用的21三體綜合征的實驗檢測方法問世。
實時熒光定量PCR技術是近年發(fā)展起來的PCR定量新技術，該技術借助于熒光信號來檢測PCR產物，可以做到每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據，建立實時擴增曲線，從而準確地確定ct值，并根據ct值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到真正意義上的定量。其方法可分為Taqman探針法和SYBR Green熒光染料法兩種，比較而言，探針法在原理上更為嚴格，所得數(shù)據更為精確。實時熒光定量PCR技術因其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應，能夠檢測普通PCR不能識別的微小的基因量的差異，目前已成為分子生物學研究中的重要工具[6][7][8]，除此之外，它還具有高通量和自動化的特點，這使之在臨床也具有極好的應用前景。
從理論上講，21三體患者存在21號染色體(或21號部分易位染色體)數(shù)目的固定改變，可以分別標記21號染色體及其它染色體上的特異性單拷貝序列(分別為目標序列和內參序列)，通過實時定量PCR測定標記序列的基因量的相對倍性改變，并由此確定21號染色體的數(shù)目及作出診斷(正常人兩序列基因量相對倍性為1，而21三體為1.5)。但由于21三體與正常人在21號染色體基因量上的差異僅1.5倍，要穩(wěn)定地從定量結果上獲得這種差異并非易事，這對實時定量PCR的方法學有很高要求。已有研究者通過分管擴增目標基因及內參基因、采用絕對定量的方法在21三體分子診斷上進行了探索[9]。但分管實驗中的一些因素，如孔間差異、模板加樣差異等，都可以導致結果完全不同；另外，絕對定量的方法不僅影響檢測通量，用不同于模板的標準品繪制的標準曲線還有可能得到錯誤的結果。
對于21三體檢測來說，只需要確定21號染色體數(shù)目相對于其它染色體(無單體或三體改變)數(shù)目的差異，因此更為理想的方法是能準確可靠地測定這種相對差異。測定相對差異的Delta ct方法與一般使用的基于標準曲線的絕對定量方法在理論上是一致的，是由公式Rn＝Ro(1+E)Ct推導而來(其中Ro是起始模板量，ct是到達閾值時的循環(huán)數(shù)，Rn是擴增進行到ct循環(huán)時的拷貝數(shù)，E為擴增效率)。從該公式可看到，當用于比較的目標序列和內參序列擴增效率一致時，兩序列基因量的相對倍性取決于ct值的差異(即delta ct)，換句話說，可根據不同的delta ct值(或范圍)來判斷基因量的相對倍性并由此確定21號染色體的數(shù)目。相對于建立在標準曲線基礎上的絕對定量方法，基于delta ct值檢測的相對定量方法由于無需建立標準曲線，不僅檢測通量更大，而且更加準確、方便。另外，由于目前實時定量儀器已可以進行多色檢測，采用多重實時定量PCR方法同管擴增目標序列和內參序列，可避免加樣和孔間差異導致的檢測誤差，也使結果更加真實、可信。
迄今為止，國內外尚未見采用多重實時定量PCR檢測21號染色體數(shù)目并由此檢測21三體的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明應用基因組特異性單拷貝序列作為染色體的分子標記，在21號染色體的唐氏綜合征關鍵區(qū)域選擇DSCR4基因的部分非多態(tài)性片段為目標序列(目標分子標記)，在1號染色體上不易發(fā)生缺失或三體的區(qū)域選擇RABIF基因的部分片段為內參序列(內參分子標記)。設計兩對引物及相應的Taqman探針，采用多重實時定量PCR技術同管擴增這兩個序列，通過反映相對量的delta ct(相對定量方法)來確定21號染色體的數(shù)目并由此檢測21三體。
具體步驟如下1.染色體的分子標記選擇21號染色體上的目標序列(目標分子標記)GTTGATGGGC TTGCGCTTAT CTGCTTGTCC CTTCTCCCAT CTGATTTCTT GTGGAGCCCA TGG其中，上游引物序列5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探針序列5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1號染色體上的內參序列(內參分子標記)TCAACATGGG CCCCACATGG TCCTAGTTTC CCCGGCTCAT TATGCTTCAG GCACACTGGCTTTCTTGC其中，上游引物序列5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探針序列5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’2.標本制備標本為0.2ml新鮮EDTA抗凝全血或10ml羊水(1000rpm 15min離心沉淀胎兒細胞，并稀釋于0.2ml PBS緩沖液中)，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)提取DNA，用紫外分光光度計(Biorad)檢測DNA純度及濃度。
3.多重實時定量PCR擴增采用ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀同管擴增目標序列及內參序列。反應體系25μl，含基因組500～25000拷貝，加入兩對引物各500nM，相應Taqman探針各200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX200nM。反應條件95℃5min預變性；95℃ 30S，60℃ 30S，兩步法40個循環(huán)。
4.定量分析方法采用ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀隨機附帶軟件進行定量分析。分析參數(shù)設定閾值設定原則以閾值線剛好超過無規(guī)則的噪音線的最高點，本發(fā)明體系設置為0.14；基線范圍起點為第6個循環(huán)，終點為同板反應最小ct值的前1-3個循環(huán)。
軟件自動輸出在設定條件下的各擴增片段的ct值，計算delta ct值(21號目標序列ct值減去1號內參序列ct值)。正常人(或胎兒)與21三體患者(或胎兒)有截然不同的delta ct范圍(具體范圍與標本制備方法、探針來源及反應體系成分有關，本發(fā)明體系設置為delta ct在-0.6～0.4時為正常；delta ct在-1.8～-0.7時為21三體)，以此判定21號染色體數(shù)目。
本發(fā)明的有益之處是利用特異性單拷貝基因與染色體數(shù)目的1∶1對應關系，從21號染色體唐氏綜合征關鍵區(qū)域選取無多態(tài)性的單拷貝基因序列為目標序列，以及從1號染色體上不易發(fā)生缺失或三體區(qū)域選取另一單拷貝基因序列為內參序列，應用多重實時定量PCR技術同管擴增這兩個序列，通過判斷它們基因量的相對倍性(delta ct方法)來確定21號染色體數(shù)目并由此檢測21三體。本發(fā)明將染色體的數(shù)目分析轉化為分子信號檢測，充分利用分子定量的優(yōu)勢，能夠快速、簡便、靈敏、準確、高通量和自動化地檢測21三體綜合征。
具體實施例方式
實施例一1.染色體的分子標記選擇21號染色體上的目標序列為GTTGATGGGC TTGCGCTTA TCTGCTTGTCC CTTCTCCCAT CTGATTTCTT GTGGAGCCCA TGG其中，上游引物序列5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探針序列5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1號染色體上的內參序列為TCAACATGGG CCCCACATGG TCCTAGTTTC CCCGGCTCAT TATGCTTCAG GCACACTGGCTTTCTTGC其中，上游引物序列5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探針序列5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’2.標本制備標本為0.2ml新鮮EDTA抗凝全血或10ml羊水(1000rpm 15min離心沉淀胎兒細胞，并稀釋于0.2ml PBS緩沖液中)，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)提取DNA，用紫外分光光度計(Biorad)檢測DNA純度及濃度。
3.多重實時定量PCR擴增采用ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀同管擴增目標序列及內參序列。反應體系(日本Takara公司)25μl，含基因組500～25000拷貝，加入兩對引物各500nM(上海生工合成)，相應Taqman探針(美國ABI公司)各200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX(英國Abgene公司)200nM。反應條件95℃ 5min預變性；95℃ 30S，60℃ 30S，兩步法40個循環(huán)。
4.定量分析方法采用ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀隨機附帶軟件進行定量分析。分析參數(shù)設定閾值設定原則以閾值線剛好超過無規(guī)則的噪音線的最高點，本發(fā)明體系設置為0.14；基線范圍起點為第6個循環(huán)，終點為同板反應最小ct值的前1-3個循環(huán)。
軟件自動輸出在設定條件下的各擴增片段的ct值，計算delta ct值(21號目標序列ct值減去1號內參序列ct值)。正常人(或胎兒)與21三體患者(或胎兒)有截然不同的delta ct范圍(具體范圍與標本制備方法、探針來源及反應體系成分有關，本發(fā)明體系設置為delta ct在-0.6～0.4時為正常；delta ct在-1.8～-0.7時為21三體)，以此判定21號染色體數(shù)目。
實施例二采用本發(fā)明檢測方法對250例正常血標本、38例21三體血標本、400例正常羊水標本、11例21三體羊水標本(羊水標本中有胎兒細胞)進行了多批次反復試驗，以同期進行的染色體G帶分析為檢測標準，結果見表1

按照我們確定的檢測范圍，本發(fā)明方法對21三體的檢測靈敏度達100％，特異性95.6％，假陽性率4.4％，假陰性率為0。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發(fā)明。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻1.Connor M.1993.Biochemical screening for Down’s syndrome.Bmj 3061705-1706.
2.Yurov YB，Laurent AM，Marcais B，et al.1995.Analysis of per icentromeric chromosome 21specific YAC clones by FISHidentification of new markers for molecular cytogeneticapplication.Hum Genet，95287-292.
3.Hsien-Hsiung Lee，Jan-Gowth Chang，Shuan-Pei Lin，et al.1997.Rapid detection of trisomy21 by homologous gene quantitative PCR(HGQ-PCR).Hum Genet，99364-367.
4.Yang YH，Kim IK，Oh SH.1998.Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 by polymerase chainreaction-associated analysis of small tandem repeats and S100 B in chromosome 21.FetalDiagn Ther，！3361-366.
5.王修海，劉雪霞。2003。快速檢測21三體綜合征基因診斷方法的研究。中華檢驗醫(yī)學雜志，26559-561。
6.Heid CA，Stevens J，Livak KJ，et al.1996.Real time quantitative PCR.Genome Res.6986-994.
7.Chiu RW，Murphy MF，et al.2001.Determination of RHD zygositycomparison of a doubleamplification refractory mutation system approach and multiplex real-time quantitative PCRapproach.Clin Chem.47667-672.
8.Bieche l，Olivi M，et al.1998.Novel approach to quantitative polymerase chain reaction usingreal-time detectionL application to the detection of gene amplification in breast cancer.Int JCancer.78661-666.
9.鄭明明，胡婭莉等。2004。實時熒光定量聚合酶鏈反應技術在產前診斷唐氏綜合征中的應用。中華婦產科雜志，39678-681。
權利要求
1.檢測人21號染色體數(shù)目的方法，其特征是通過應用基因組特異性單拷貝序列作為染色體的分子標記，在21號染色體的唐氏綜合征關鍵區(qū)域選擇DSCR4基因的部分非多態(tài)性片段為目標分子標記，在1號染色體上不易發(fā)生缺失或三體的區(qū)域選擇RABIF基因的部分片段為內參分子標記，分別設計兩對引物及相應的Taqman探針，采用多重實時定量PCR技術對目標分子標記和內參分子標記進行同管擴增，通過delta ct值來確定21號染色體數(shù)目并由此診斷21三體綜合征，通過以下步驟實現(xiàn)(1)選擇染色體的分子標記21號染色體上的目標分子標記為GTTGATGGGC TTGCGCTTAT CTGCTTGTCC CTTCTCCCAT CTGATTTCTT GTGGAGCCCA TGG其中上游引物序列5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探針序列5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1號染色體上的內參分子標記為TCAACATGGG CCCCACATGG TCCTAGTTTC CCCGGCTCAT TATGCTTCAG GCACACTGGCTTTCTTGC其中上游引物序列5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探針序列5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’(2)標本制備取新鮮EDTA抗凝全血或羊水，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取DNA，用紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度；(3)多重實時定量PCR擴增采用ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀同管擴增目標分子標記及內參分子標記，反應體系25μl，含基因組500-25000拷貝，加入兩對引物各500nM，相應Taqman探針200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX200nM，反應條件為95℃5分鐘預變性；95℃30秒，60℃30秒，兩步法40個循環(huán)；(4)定量分析采用ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀隨機附帶軟件進行定量分析，分析體系設置為0.14，基線范圍起點為第6個循環(huán)，終點為同板反應最小ct值的前1-3個循環(huán)，軟件自動輸出各擴增片段的ct值，計算delta ct值，根據不同的delta ct范圍來判斷21號染色體數(shù)目。
2.根據權利要求1所述的檢測21染色體數(shù)目的方法，其特征是步驟(4)中delta ct值等于21號目標分子標記ct值減去1號內參分子標記ct值，其中ct值是指達到閾值時的循環(huán)數(shù)。
3.根據權利要求1所述的檢測21染色體數(shù)目的方法，其特征是步驟(4)中判斷21號染色體數(shù)目的依據是delta ct在-0.6～0.4范圍時為21號染色體數(shù)目正常；delta ct在-1.8～-0.7范圍時為21三體。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測人21號染色體數(shù)目的方法，是應用基因組特異性單拷貝序列作為染色體的分子標記，在21號染色體的唐氏綜合征關鍵區(qū)域選擇DSCR4基因的部分非多態(tài)性片段為目標分子標記，在1號染色體上不易發(fā)生缺失或三體的區(qū)域選擇RABIF基因的部分片段為內參分子標記。設計兩對引物及相應的Taqman探針，采用多重實時定量PCR技術同管擴增這兩個序列，通過反映相對量的delta ct值來確定21號染色體的數(shù)目并由此診斷21三體綜合征。本發(fā)明將染色體的數(shù)目分析轉化為分子信號檢測，充分利用分子定量的優(yōu)勢，不僅方法簡便、高度敏感、穩(wěn)定和檢測率高，而且還具有高通量和自動化的特點，在臨床有極好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1693480SQ20051004960
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月20日 優(yōu)先權日2005年4月20日
發(fā)明者呂時銘, 朱宇寧, 裘儉, 朱波, 尤建飛 申請人:浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院