專利名稱：水稻的一種線狀微小染色體及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物染色體及其獲得方法，特別涉及水稻的一種線狀微小染色體及其獲得方法。
背景技術(shù)：
染色體具有3個(gè)基本元素①自主復(fù)制序列(autonomously replicating DNAsequence，ARS)，是DNA復(fù)制的起點(diǎn)，酵母基因組含200-400個(gè)ARS，大多數(shù)具有一個(gè)11bp富含AT的一致序列(ARS consensus sequence，ACS)；②著絲粒序列(centromere DNA sequence，CEN)，由大量串聯(lián)的重復(fù)序列組成，如α衛(wèi)星DNA，其功能是參與形成著絲粒，使細(xì)胞分裂中染色體能夠準(zhǔn)確地分離；③端粒序列(telomere DNA sequence，TEL)，不同生物的端粒序列都很相似，由長5-10bp的重復(fù)單位串聯(lián)而成，人的重復(fù)序列為GGGTTA。1983年，A.W.Murray等人首次成功構(gòu)建了包括ARS、CEN、TEL和外源DNA，總長度為55kb的酵母人工染色體(yeastartificial chromosome，YAC)。YAC可用于轉(zhuǎn)基因和構(gòu)建基因文庫，容納插入片段的能力遠(yuǎn)高于質(zhì)粒。
著絲粒是真核生物染色體的重要組成部分，它既是姊妹染色單體的結(jié)合點(diǎn)，又是紡錘絲的附著點(diǎn)，因而在染色體配對及維系生物體遺傳信息穩(wěn)定傳遞中均起重要作用。現(xiàn)有研究表明，不同類型生物體都擁有其獨(dú)特的著絲粒序列，只有芽殖酵母的著絲粒有125bp左右特異DNA序列構(gòu)成，而其它模式生物包括裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)、果蠅(Drosophila Melanogaster)以及人類，它們的著絲粒均由高度重復(fù)的DNA序列構(gòu)成。在人類中，每一著絲粒均由重復(fù)單元為171bp的α串連重復(fù)序列構(gòu)成的，不同染色體所含有的α串連重復(fù)序列在250Kb到4Mb之間，通過人工合成或直接克隆的α串連重復(fù)序列組建著絲粒，成功地構(gòu)建了人類的人工染色體。在植物上，目前對于玉米及擬南芥的著絲粒序列已有較多的了解，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)染色體的著絲粒均由一到幾個(gè)Mb的著絲粒特異的串連重復(fù)序列和其它一些轉(zhuǎn)座DNA構(gòu)成。
在通常情況下，細(xì)胞每一條染色體只含有一個(gè)著絲粒，在某些人為因素和自然突變條件下，可能會出現(xiàn)含有雙著絲粒的染色體(Dicentromere)或含有兩個(gè)著絲粒DNA序列區(qū)域的染色體(Dicentric chromosomes)。有關(guān)雙著絲粒染色體研究方面目前只有極少數(shù)的報(bào)道，McClintock報(bào)道了一例玉米雙著絲粒染色體，但在玉米的繼代過程中因雙著絲粒染色體在減數(shù)分裂不正常時(shí)而導(dǎo)致染色體丟失。近年來，在動物細(xì)胞(人和果蠅)中發(fā)現(xiàn)含有雙著絲粒的染色體，并且能夠穩(wěn)定的遺傳給后代，其原因在于雙著絲粒中的一個(gè)喪失著絲粒功能，或者兩個(gè)著絲粒存在互作機(jī)制(Faulker，1998；Sullivan et al.，1998；Agudom et al.2000)。
端粒是位于染色體3’末端的一段富含G的DNA重復(fù)序列，它和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，具有特殊的功能。不同種細(xì)胞的端粒重復(fù)單位不同，大多數(shù)長5-8bp，由這些重復(fù)單位組成的端粒突出于其互補(bǔ)鏈12-16個(gè)核苷酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供水稻的一種線狀微小染色體。
本發(fā)明所提供的水稻的一種線狀微小染色體的端粒，其DNA由富含G的一股鏈和與該股鏈互補(bǔ)的富含C的一股鏈組成；所述富含G的一股鏈由5′向3′方向延伸，由1000-1500個(gè)重復(fù)單位TTTAGGG串聯(lián)重復(fù)(一個(gè)挨一個(gè)，并且是相同方向)而成長7-10.5kb(千堿基)的片段，所述富含C的一股鏈由3′向5′方向延伸，由1000-1500重復(fù)單位AAATCCC串聯(lián)重復(fù)(一個(gè)挨一個(gè)，并且是相同方向)而成長7-10.5kb片段。
水稻的一種線狀微小染色體，由位于染色體一個(gè)末端的著絲粒，位于染色體另一個(gè)末端的上述端粒，和位于所述著絲粒和端粒之間的水稻11號染色體的三分之一短臂組成。
所述三分之一短臂可以是與水稻11號染色體端粒緊密相連的那部分染色體短臂，也可以是與水稻11號染色體著絲粒緊密相連的那部分染色體短臂。
所述著絲粒的DNA是由300-500個(gè)拷貝的Cent0重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列；所述Cent0重復(fù)單位的5′→3′鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，由155個(gè)堿基組成。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種獲得上述水稻的一種線狀微小染色體的方法。
本發(fā)明所提供的獲得該線狀微小染色體的方法，是用著絲粒特異序列RCS2和/或11號染色體特異序列5S做探針通過熒光原位雜交篩選含有雙著絲粒的2n+1型水稻(Oryza Sativa)變異體三體，得到線狀微小染色體。
所述著絲粒特異序列RCS2具有序列表中序列2的核苷酸序列；所述11號染色體特異序列5S具有序列表中序列3。
所述含有雙著絲粒的2n+1型水稻(Oryza Sativa)變異體三體可通過以下步驟獲得
1)用秋水仙素處理中秈3037二倍體水稻植株，獲得四倍體株系；2)將該四倍體株系再與二倍體植株中秈3037雜交，獲得三倍體株系；3)將該三倍體株系再與二倍體植株中秈3037回交，得到三體株系2n+1型三體；4)對這些三體株系進(jìn)行遺傳和細(xì)胞學(xué)篩選，獲得含有雙著絲粒的2n+1型水稻(Oryza Sativa)變異體三體。
所述2n+1型水稻(Oryza Sativa)變異體三體為水稻第11號染色體長臂(Longarm，簡稱11L)和短臂(Short arm，簡稱11S)在著絲粒區(qū)域斷裂形成的，其中11號長臂(11L)含有較多的著絲粒區(qū)域，具有完整的著絲粒功能，能穩(wěn)定的遺傳給后代；斷裂的11號短臂染色體(.11S)含有較少的著絲粒區(qū)域，單獨(dú)不具有完整的著絲粒功能，但三個(gè)短臂相串聯(lián)而形成了含有兩個(gè)著絲粒的11S.11S.11S型染色體(圖2，小環(huán)示著絲粒)，該染色體的兩個(gè)著絲粒都具有完整的著絲粒功能。在水稻細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，由于兩個(gè)著絲粒分別移向兩極，導(dǎo)致11S.11S.11S型染色體發(fā)生各種類型的斷裂，因而在后代中出現(xiàn)含有各種類型微小染色體(Minichromosome)的株系。本發(fā)明利用著絲粒特異序列RCS2和/或11號染色體特異序列5S做探針，分別對該變異體三體的后代株系進(jìn)行FISH(Fluorescence in situ hybridization)檢測，得到了本發(fā)明的線狀微小染色體。
微小染色體是染色體相對較短但基因密集的染色體。從廣義上講，微小染色體也是一種人工染色體，人工染色體有三個(gè)組成要素，即著絲粒，端粒和復(fù)制原點(diǎn)。在這三大元件中著絲粒是最為主要的，又是最難以獲得的元件。目前，人類人工染色體的研究已初見成效。其構(gòu)建方法是通過人工拼裝著絲粒、端粒和復(fù)制原點(diǎn)而最終合成或者通過向受體細(xì)胞導(dǎo)入端粒序列，利用端粒序列的剪切功能將普通人類染色體剪切為人工染色體。該線狀微小染色體的著絲粒和端粒都是人工染色體的組成元件，本發(fā)明的線狀微小染色體對于探索構(gòu)建水稻人工染色體的可能性具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。


圖1為線狀微小染色體的FISH檢測照片圖2為含有兩個(gè)著絲粒的11S.11S.11S型染色體及形成線狀微小染色體的結(jié)構(gòu)示意3為含有雙著絲粒的2n+1型水稻(Oryza Sativa)變異體三體的雙著絲粒染色體具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、獲得水稻的一種線狀微小染色體1、水稻雙著絲粒染色體附加系(2n+1型三體)的獲得首先利用秋水仙素處理中秈3037二倍體水稻植株，獲得四倍體株系；四倍體株系再與二倍體植株中秈3037雜交，獲得三倍體株系；三倍體株系再與中秈3037回交，得到三體株系2n+1型三體。
2、獲得線狀微小染色體(i)水稻根尖材料的預(yù)處理及壓片取步驟1中的含有雙著絲粒的2n+1型水稻三體新鮮根尖，用0.002M 8-羥基喹啉于20℃預(yù)處理2hr，再用卡諾(Carnoys)固定液(乙醇∶冰乙酸＝3∶1)-20℃固定。蒸餾水沖洗2次，每次5min，切取根尖1-2mm長，用1％纖維素酶和0.5％果膠酶于37℃酶解1小時(shí)；蒸餾水沖洗2次，每次5min，再用卡諾固定液-20℃固定20min后，在預(yù)冷的載玻片上敲片，火焰烤干后4℃保存?zhèn)溆谩?br> (ii)5S探針和RCS2探針的標(biāo)記及制備探針標(biāo)記采用缺口平移法，具體如下25μL體系10×buffer 2.5μL，0.5mM dATP+dCTP+dGTP混合物2.5μL，0.5mM Digoxigenin-11-dUTP(Roche，Germany)2.5μL，DNA Polymerase I 0.5μL，DNase I 1μL，含有5S(或RCS2)片段的質(zhì)粒(含有5S(或RCS2)片段的質(zhì)粒的具體構(gòu)建方法如下根據(jù)序列表中序列2、序列3的序列，設(shè)計(jì)引物，利用PCR的方法分別獲得這兩個(gè)片段(序列2和序列3)，然后分別連接到pGEM-Teasy載體(promega公司試劑盒)上，具體方法參照試劑盒說明進(jìn)行)8μL，H2O 8μL。15℃保溫2hr，加2.5μL 0.2M EDTA終止反應(yīng)。標(biāo)記后探針用Sephdex G50填料純化。3μL探針中加入4μL濃度為10mg/ml SS sDNA單鏈鮭魚精DNA(sDNA)(sDNA煮沸10min后立即放冰上10min得到SS sDNA)、2μL 20×SSC、10μL 50％去離子甲酰胺，4μL 50％葡聚糖，95℃保溫5min，冰浴備用。其中，10×buffer為0.5M Tris HClpH7.5，50mM MgCl2。
(iii)線狀微小染色體的FISH檢測壓片后的材料用70％甲酰胺88℃變性2分鐘，立刻放入-20℃70％乙醇5分鐘，然后乙醇梯度脫水、晾干，每張玻片用20μL變性過探針于37℃保溫8hr以上。2×SSC 42℃洗10min，2×SSC室溫5min，1×PBS室溫5min，晾干。用Digoxigenin-Rhodamine抗體(Roche)(1∶100)37℃避光保溫作用30min，然后用1×PBS室溫洗滌3次，每次5min。用含有DAPI的封片劑(Vector laboratories，Burlingame，CA)封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。雙著絲粒變異體后代微小染色體FISH檢測結(jié)果如圖1(箭頭示微小線狀染色體)和圖3(箭頭示雙著絲粒染色體)所示，表明雙著絲粒染色體在其進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，染色體被拉斷，得到著絲粒在一端的線狀微小染色體。其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，由位于染色體一個(gè)末端的著絲粒，位于染色體另一個(gè)末端的端粒，和位于所述著絲粒和端粒之間的水稻11號染色體的三分之一短臂組成。
序列表<160>3<210>1<211>155<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa)<400>1cacgagggtg cgatgttttc tactggaatc aaaaagttca aaaagagcca aaacatgatt60tttggacata ttggagtgta ttgggtgcgt tcgtggcaaa aactcacttc gtgattcgcg120cggcgaactt ttgtcaatta atgccaatat tggca 155<210>2<211>639<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa)<400>2gatcttttct actggaatca aaatgttcaa aaaatgccaa aacatgattt ttggacatat60tggagtgtat tgggtgcatt catggcaaaa actcactccg tgattcgcgc ggcgaacttt120tgtcaattaa tgccaatatt gggacacgag ggtgcgatgt tttctactgg aatcaaaaag180ttcaaaaaga gccaaaacat gatttttgga catattggag tgtattgggg tgcgttcgtg240gcaaaactca cttcgtgatt cgcgcggcga acttttgtca tttaatgcca atatgtgcat300acacgagaga gtgcgatgtt attctactgg aatcaaaaag ttcaaaaaga gccaaaacat360gatttttgga catattggag tgtattgggt gcgttcgtgg caaaactcac ttcgtgattc420gcgcggcgaa cttttgtcaa ttaattccaa tatgtgcata ttttggccca aagtgttgcg480atgttattaa tcggaatgaa aaagttcaaa aggcaccaaa acatgatttt ttgacatatt540ggagtgtatt gggtgcgttc gtgggaaaaa ctcacttcgt gattcgcgcg gcgaactttt600gtcatttaat gccaatattg gcacagcgac gggtgcgat 639
<210>3<211>302<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa)<400>3ccctcctttt tgtctctctc tccccccttt tgactcgcgc cgctgcgtcc ctcgtgtagc60tggggagaat cggatgtaac attttctgta gatgtccgtg gatatatcat ttgcctgatt120ccgagtccgt atgagaaagt tacgcctatt ttaagaaatg acacccgaat gacgccaaag180catgtcggat gcgatcatac cagcactaaa gcaccggatc ccatcagaac tccgaagtta240agcgtgcttg ggcgagagta gtactaggat gggtgacctc ctgggaagtc ctcgtgttgc300at 30權(quán)利要求
1.水稻的一種線狀微小染色體的端粒，其DNA由富含G的一股鏈和與該股鏈互補(bǔ)的富含C的一股鏈組成；所述富含G的一股鏈由5′向3′方向延伸，由1000-1500個(gè)重復(fù)單位TTTAGGG串聯(lián)重復(fù)而成長7-10.5kb的片段，所述富含C的一股鏈由3′向5′方向延伸，由1000-1500個(gè)重復(fù)單位AAATCCC串聯(lián)重復(fù)而成長7-10.5kb的片段。
2.水稻的一種線狀微小染色體，由位于染色體一個(gè)末端的著絲粒，位于染色體另一個(gè)末端的權(quán)利要求1所述的端粒，和位于所述著絲粒和端粒之間的水稻11號染色體的三分之一短臂組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的線狀微小染色體，其特征在于所述三分之一短臂是與水稻11號染色體端粒緊密相連的那部分染色體短臂或是與水稻11號染色體著絲粒緊密相連的那部分染色體短臂。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的線狀微小染色體，其特征在于所述著絲粒的DNA是由300-500個(gè)拷貝的cent0重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，所述cent0重復(fù)單位的5′→3′鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求2或3或4所述的水稻的一種線狀微小染色體的獲得方法，是用著絲粒特異序列RCS2和/或11號染色體特異序列5S做探針通過熒光原位雜交篩選含有雙著絲粒的2n+1型水稻(Oryza Sativa)變異體三體，得到線狀微小染色體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述著絲粒特異序列RCS2具有序列表中序列2的核苷酸序列；所述11號染色體特異序列5S具有序列表中序列3的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述含有雙著絲粒的2n+1型水稻(Oryza Sativa)變異體三體通過以下步驟獲得1)用秋水仙素處理中秈3037二倍體水稻植株，獲得四倍體株系；2)將該四倍體株系再與二倍體植株中秈3037雜交，獲得三倍體株系；3)將該三倍體株系再與二倍體植株中秈3037回交，得到三體株系2n+1型三體；4)對這些三體株系進(jìn)行遺傳和細(xì)胞學(xué)篩選，獲得含有雙著絲粒的2n+1型水稻變異體三體。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻的一種線狀微小染色體及其獲得方法。該線狀微小染色體，由位于染色體一個(gè)末端的著絲粒，位于染色體另一個(gè)末端的端粒，和位于所述著絲粒和端粒之間的水稻11號染色體的三分之一短臂組成；所述端粒的DNA的一股鏈由5′向3′方向延伸，由1000－1500個(gè)重復(fù)單位TTTAGGG串聯(lián)重復(fù)而成長7－10.5kb的片段，另一股鏈由3′向5′方向延伸，由1000－1500個(gè)重復(fù)單位AAATCCC串聯(lián)重復(fù)而成長7－10.5kb的片段。用著絲粒特異序列RCS2和/或11號染色體特異序列5S做探針通過熒光原位雜交篩選含有雙著絲粒的2n+1型水稻變異體三體，可得到該線狀微小染色體。該線狀微小染色體對于探索構(gòu)建水稻人工染色體的可能性具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。
文檔編號A01H1/02GK1912123SQ200510087760
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月8日
發(fā)明者程祝寬, 李明, 顧銘洪 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所