3號(hào)染色體上與水稻干尖線蟲抗性qtl連鎖的ssr標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是根據(jù)連鎖分離規(guī)律，以水稻干尖線蟲抗病品種Tetep和感病品種淮稻5號(hào)雜交后代F2群體為作圖群體，通過水稻干尖線蟲抗性鑒定結(jié)果和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)間的連鎖分析，獲得了3號(hào)染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097。通過檢測(cè)Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交組合后代單個(gè)水稻植株的SSR標(biāo)記帶型，可以判斷該植株是否具有水稻干尖線蟲抗性，將其應(yīng)用于Tetep及其衍生品種(系)/感病品種水稻干尖線蟲抗病品種的輔助選擇育種中，可以克服常規(guī)育種中水稻干尖線蟲抗性鑒定穩(wěn)定性和重復(fù)性差和費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，其結(jié)果可以簡(jiǎn)化選擇方法和提高育種效率，進(jìn)而加快抗水稻干尖線蟲水稻病品種的選育進(jìn)程。
【專利說明】3號(hào)染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及3號(hào)染色體上一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記RM5626和RM7097，可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種，屬于水稻抗病育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】:
[0002]水稻干尖線蟲是一種水稻外寄生病原物，其典型癥狀是葉片尖部扭曲成干尖，該病害一旦發(fā)生會(huì)使糧食產(chǎn)量損失慘重(Journal ofthe faculty of Agriculture,Kyushu, University,1950, 9(3):309-333 ;Nematologica，1975，21 (3):351-357 ； JournalofAgricultural Technology, 2011, 337-344)。水稻干尖線蟲傳統(tǒng)控制方法成本大，還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境問題(Journal of Agricultural Science and Technology, 2011,14 (I):195-203)。利用水稻品種自身抗性是控制水稻干尖線蟲最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的策略(Annualreview ofphytopathology,2001,39 (I):285-312 ;Plant resistance to parasiticnematodes,2002,141-151)。
[0003]育種家曾篩選到一些水稻干尖線蟲抗性品種，如cvs Arkansas Fortuna,Nira43, Asa-Hi, Binam, Domsiah 等(Phytopathology, 1949, 39 ；Bulletin of the KyushuAgricultural Experiment Station, 1953,1 (3):339-349 ;Journal of AgriculturalScience and Technology, 2011,14 (I): 195-203)。但有些水稻干尖線蟲抗性品種要么僅在特一地區(qū)表現(xiàn)抗性，要么僅對(duì)水稻干尖線蟲表現(xiàn)抗性，對(duì)其他病原物高度敏感或僅有較低的產(chǎn)量(Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture, 2005,87-130)。另外，水稻干尖線蟲種群的遺傳變異會(huì)降低抗性品種的有效抗性，甚至造成品種抗性的消失。目前，水稻品種對(duì)水稻干尖線蟲抗性的遺傳基礎(chǔ)及其分子機(jī)制也不清楚。闡明水稻對(duì)干尖線蟲的抗性遺傳基礎(chǔ)及其分子機(jī)制有助于更深入的了解線蟲與水稻的互作機(jī)制，為線蟲抗性育種奠定基礎(chǔ)(The Plant Journal2004, 38 (2):285-297)。另外，為寄主植物線蟲抗性基因的鑒定和分離以及進(jìn)一步在分子和生化水平上研究線蟲與植物的互作機(jī)制提供了新的視野(The Plant Journal, 2002, 31 (2):127-136)。迄今，在甜菜、番茄、馬鈴薯、大豆等作物中定位到Hl、GroVl、Cre、Mi3等許多線蟲抗性位點(diǎn)(Genome, 1993, 36 (I):152-156 ;Molecular Breeding,1996,2(I):51-60 !Theoretical and Applied Genetics,
1994,89(7-8):927-930 !Theoretical and Applied Genetics,1995,91(3):457-464)。而且，已克隆到Hslpro-1、M1-1、Hero A和Gpa2等幾個(gè)線蟲抗性基因并對(duì)這些抗性基因進(jìn)行了遺傳和功能分析(Sciencel997, 275 (5301):832-834 ；Nature biotechnology, 1998,16(13):1365-1369 ；The Plant Journal,2002,31(2):127-136 ;The Plant Journal,2000,23(5):567-576)，這極大的增強(qiáng)了我們對(duì)這些寄主作物線蟲抗性的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。然而，目前未見關(guān)于水稻品種對(duì)水稻干尖線蟲抗性的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative TraitLocus, QTL)或基因的報(bào)道，對(duì)水稻干尖線蟲的抗性研究?jī)H在品種抗性鑒定水平上，這極大的限制了水稻干尖線蟲抗性資源在抗性育種中的有效利用。[0004]分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)有效的解決了這一問題，通過構(gòu)建重要抗源的遺傳連鎖圖譜和QTL分析，可以有效的找到與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記，使用這些標(biāo)記可以對(duì)該抗源的后代及其衍生品系在苗期進(jìn)行早世代篩選，淘汰感病植株，不僅節(jié)約了成本，還提聞了育種效率。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明針對(duì)上述研究背景，以篩選到的水稻干尖線蟲抗病品種Tetep和感病主栽品種淮稻5號(hào)為材料,在842對(duì)(http://www.gramene.0rg)微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選到160個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記，從中選用127個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)淮稻5號(hào)/Tetep F2群體進(jìn)行分析，構(gòu)建水稻遺傳連鎖圖譜，將其與F2: 3家系水稻干尖線蟲人工接種鑒定后百粒線蟲數(shù)(The number ofA.besseyi inlOOgrains, NA)間進(jìn)行連鎖分析,獲得了 3號(hào)染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097，可應(yīng)用于水稻干尖線蟲抗病品種的分子輔助選擇育種。[0006]本發(fā)明所提供的3號(hào)染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097，是通過以下方法獲得的:
[0007]I)感病品種淮稻5號(hào)(早)與抗病品種Tet印(^ )雜交獲得雜種F1, F1自交得F2群體，單株收獲F2: 3家系種子用于水稻干尖線蟲抗性鑒定；
[0008]2) CTAB法提取親本、F1及F2群體138個(gè)單株的DNA ；
[0009]3)利用選出的127對(duì)SSR引物對(duì)親本、F1及F2群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，構(gòu)建遺傳連鎖圖；
[0010]4)親本淮稻5號(hào)、Tetep及其雜交后代F1和F2: 3家系進(jìn)行水稻干尖線蟲人工接種鑒定，種子成熟后單穗收種，統(tǒng)計(jì)NA。
[0011]5)根據(jù)標(biāo)記帶型用MAPMAKER/EXP3.0軟件計(jì)算出標(biāo)記間連鎖遺傳距離，并用Mapdraw根據(jù)各標(biāo)記在染色體上的位置畫圖，構(gòu)建水稻遺傳連鎖圖譜；
[0012]6)采用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件Windows QTL Cartographer V2.5檢測(cè)水稻干尖線蟲的抗性QTL。LOD值的閾值定為2.5，按P = 0.05概率值檢測(cè)抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置。
[0013]3號(hào)染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記RM5626和RM7097的應(yīng)用包括:以Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交組合后代的單個(gè)水稻植株為對(duì)象，通過檢測(cè)其3號(hào)染色體上RM5626和RM7097標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)該植株對(duì)水稻干尖線蟲的抗性。
[0014]本發(fā)明能克服常規(guī)育種中水稻干尖線蟲抗性鑒定穩(wěn)定性、重復(fù)性較差及費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，其結(jié)果可以簡(jiǎn)化選擇方法和提高育種效率，進(jìn)而加快抗病品種的育種進(jìn)程。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1利用淮稻5號(hào)/Tet印F2群體構(gòu)建的分子遺傳連鎖圖譜
[0016]圖2 3號(hào)染色體上水稻干尖線蟲抗性QTL遺傳連鎖群定位分析示意圖
[0017]注:抗性QTL連鎖群區(qū)段；左側(cè)為標(biāo)記間遺傳距離(CM);右側(cè)為標(biāo)記名稱【具體實(shí)施方式】:
[0018]下面實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0019]實(shí)施例1，與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記的獲得
[0020]1、植物材料
[0021]2008年在江蘇省農(nóng)科院大田種植淮稻5號(hào)和Tet印，并雜交獲得雜種F1，次年F1自交得F2種子，2009年在海南繁殖F2群體，作為作圖群體。F2單株編號(hào)，分蘗期取親本、雜種F1及F2群體各單株的部分葉片，_70°C冰箱保存用于SSR分析，F(xiàn)2群體單株收種，以備表型鑒定。
[0022]2、線蟲的培養(yǎng)與分離
[0023]將灰葡萄抱菌(Botrytiscinerea)菌塊接種在 Potato Dextrose Agar (PDA)培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng),待灰葡萄孢菌長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后,用3%雙氧水對(duì)水稻干尖線蟲表面消毒IOmin,滅菌超純水洗滌3次后，將約400頭水稻干尖線蟲接種到長(zhǎng)滿培養(yǎng)基的灰葡萄孢菌上，于 25°C 培養(yǎng) 20d 左右(Journal of nematology, 2009,41 (I):17)。用 Baermann 漏斗技術(shù)分尚培養(yǎng)的水稻干尖線蟲，并用3%雙氧水表面消毒(Rice Science, 2009,16 (4):301-306)，無菌水沖洗后收集線蟲，作為接種材料。
[0024]3、CTAB 法提取 DNA
[0025]I)稱取500mg水稻葉片置于2.0mL Eppendorf管中，將離心管置于液氮中冷卻，灌滿液氮后迅速取出，用研磨棒研磨成粉末狀；
[0026]2)65°C條件下水浴 1-1.5h，15min 震蕩 I 次；
[0027]3)4°C條件下13，OOOrpm離心10min，取上層水相；
[0028]4)加入900 μ L氯仿:異戊醇溶液(24: I)，充分混勻震蕩至溶液顏色由綠色變?yōu)榘咨?br> [0029]5)4°C條件下13，OOOrpm離心10min，取上層水相；
[0030]6)加入等體積異丙醇，_20°C條件下靜置20-30min，沉淀出絮狀DNA ；
[0031]7)4°C條件下13，OOOrpm離心10min，棄上清，加入lmL70%乙醇洗滌，4°C條件下13, OOOrpm離心5min,棄上清,置于超凈臺(tái)上晾干；
[0032]8)加30 μ L去離子水溶解DNA，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]用EppendorfBioPhotometer Plus核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD值和濃度，將各樣品DNA稀釋至20ng/ μ L備用。
[0034]4、SSR標(biāo)記分析
[0035](I) PCR 擴(kuò)增
[0036]采用10 μ L 的 PCR 反應(yīng)體系:DNA (IOng/ μ L) 1.3 μ L，Primer (4pmol/ μ L) 1.5 μ L，10 X PCR buffer (w/Mg) 1.5 μ L，dNTP (2.5mM) 0.2 μ L, Taq (5U/ μ L)0.1 μ L, ddH205.4 μ L。PCR反應(yīng)程序:95°C變性5min ;95°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸lmin，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。產(chǎn)物加入loading buffer中止反應(yīng)，待用。
[0037](2)聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0038]采用8%聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，所用的電泳儀為雙板夾芯垂直電泳槽DYCZ-30型(北京六一儀器廠)。具體操作步驟如下:
[0039]I)用洗潔精把玻璃板反復(fù)擦洗干凈，用蒸餾水沖洗，烘箱烘干，組裝玻璃板之前可用酒精擦拭；
[0040]2)將兩塊玻璃板放進(jìn)橡膠封條內(nèi)，瓊脂糖凝膠封住底部安裝至電泳槽上；
[0041]3)按表1順序加入各儲(chǔ)液配制丙烯酰胺凝膠，充分搖勻后用移液器將配好的膠均勻注入兩玻璃板之間，再插入梳子，注意防止梳子底部產(chǎn)生氣泡。靜置Ih左右待其凝固；
[0042]表1制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑的體積
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記,其特征在于:以水稻干尖線蟲感病品種與抗病品種Tetep雜交后代F2群體為作圖群體，通過簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)數(shù)據(jù)與水稻干尖線蟲人工接種鑒定后百粒線蟲數(shù)(NA)之間的連鎖分析，獲得3號(hào)染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL(qNA3)連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097。
2.按照權(quán)利I所獲得一種與水稻干尖線蟲感病品種/Tetep雜交組合中水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于:以Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交后代的單個(gè)水稻植株為對(duì)象，通過檢測(cè)其分子標(biāo)記RM5626和RM7097的帶型數(shù)據(jù)，可以判斷該植 株是否抗水稻干尖線蟲。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103981181SQ201410239721
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月25日
【發(fā)明者】周彤, 杜琳琳, 周益軍, 高存義, 蘭瑩, 孫楓 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院