水稻強(qiáng)稈抗倒基因prl4的分子標(biāo)記與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻強(qiáng)稈抗倒基因prl4的分子標(biāo)記與應(yīng)用，通過(guò)對(duì)粳型超級(jí)稻“沈農(nóng)265”和云南地方品種“麗江新團(tuán)黑谷”的F2和RILs群體進(jìn)行抗倒伏相關(guān)性狀的QTL分析，鑒定了一個(gè)在不同群體類(lèi)型(F2和RILs)、不同年份(2008年、2009年和2011年)、不同地點(diǎn)(沈陽(yáng)和哈爾濱)穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，其增效等位基因來(lái)自于云南地方品種“麗江新團(tuán)黑谷”。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其同時(shí)控制植株下部抗推力、莖稈抗折力、莖壁厚度、大小維管束面積和大小維管束木質(zhì)部面積，命名為prl4(pushing?resistance?of?the?lower?part4)。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了prl4的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記與prl4不僅緊密連鎖而且在植株后代與所述基因共分離，因而適于通過(guò)分子標(biāo)記輔助手段選育兼顧高產(chǎn)和抗倒的水稻品種。
【專利說(shuō)明】水稻強(qiáng)稈抗倒基因 pH4的分子標(biāo)記與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻強(qiáng)桿抗倒基因 prl4的分子標(biāo)記與應(yīng)用，屬于水稻育種中的 檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 倒伏是影響水稻、小麥、玉米等作物高產(chǎn)的重要因素之一，水稻等作物在大風(fēng)、大 雨作用下，易導(dǎo)致倒伏，由此會(huì)造成作物減產(chǎn)20-30%。此外，作物群體倒伏后，其冠層結(jié)構(gòu) 被破壞，導(dǎo)致光合和干物質(zhì)生產(chǎn)能力下降，嚴(yán)重的倒伏還會(huì)引起水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和同化物的轉(zhuǎn) 運(yùn)受阻，減少籽粒灌漿時(shí)的養(yǎng)分供給。同時(shí)倒伏會(huì)使群體內(nèi)部的濕度增加，誘發(fā)真菌性病害 或引起穗發(fā)芽，進(jìn)而影響稻米的品質(zhì)和外觀。隨著黑龍江"國(guó)家戰(zhàn)略糧倉(cāng)"地位的日益突出， 水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)已成為關(guān)系國(guó)計(jì)民生的關(guān)鍵問(wèn)題。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，黑龍江每年因?yàn)榈狗鼘?dǎo)致 的減產(chǎn)在10%左右，嚴(yán)重年份達(dá)到20%以上。因此，深入開(kāi)展對(duì)水稻抗倒能力的研究，進(jìn)一 步提高黑龍江省水稻的抗倒性，實(shí)現(xiàn)水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。已有研究表明株 高是影響水稻倒伏的最重要因素，綠色革命（矮化育種）使矮化品種代替了傳統(tǒng)的高桿品 種，提高了水稻的耐肥抗倒性和收獲指數(shù)，但植株過(guò)矮，致使葉片密集、相互遮掩，從而降低 群體的光能利用率。近年來(lái)的研究表明，欲使水稻產(chǎn)量進(jìn)一步增加，通過(guò)提高收獲指數(shù)的難 度越來(lái)越大，只能通過(guò)提高品種的生物產(chǎn)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，實(shí)現(xiàn)生物產(chǎn)量的突破必然依賴于 株高的增加，但這一策略將會(huì)重新帶來(lái)倒伏的危險(xiǎn)。因此，在保證適當(dāng)提高株高的前提下， 發(fā)掘"矮桿"以外的優(yōu)良抗倒基因資源，揭示新的抗倒機(jī)制，培育優(yōu)良的抗倒材料，對(duì)于破解 倒伏難題，實(shí)現(xiàn)水稻生產(chǎn)潛力的下一個(gè)跨越，具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是篩選和開(kāi)發(fā)位于prl4兩側(cè)的特異性分子標(biāo)記，并將這 個(gè)分子標(biāo)記命名為prl4-l和prl4-2,所述片段如序列表SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所 示。具體地，本發(fā)明設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記的核苷酸序列如下：
[0004] prl4-l 的上游引物序列為：5' -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；
[0005] prl4-l 的下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；
[0006] prl4-2 的上游引物序列為：5' -ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ；
[0007] prl4-2 的下游引物序列為：5' -AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
[0008] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：根據(jù)前期定位結(jié)果，分別測(cè)定了麗江新團(tuán)黑谷和沈農(nóng) 265的目標(biāo)區(qū)域，并進(jìn)行了比對(duì)分析，挑選出一對(duì)微衛(wèi)星差異，并設(shè)計(jì)出該標(biāo)記。將此標(biāo)記 應(yīng)用于麗江新團(tuán)黑谷和沈農(nóng)265進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)具有prl4的麗江新團(tuán)黑谷在利用prl4-l 檢測(cè)時(shí)，能夠擴(kuò)增出210bp左右的條帶，而沈農(nóng)265能夠擴(kuò)增出200bp左右的條帶。在利用 prl4-2檢測(cè)時(shí)，麗江新團(tuán)黑谷能夠擴(kuò)增出200bp左右的條帶，而沈農(nóng)265能夠擴(kuò)增出190bp 左右的條帶。并進(jìn)一步對(duì)重組自交系進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)該分子標(biāo)記與prl4共分離。綜 上，此分子標(biāo)記可以用于鑒定待測(cè)材料是否在prl4座位上含有麗江新團(tuán)黑谷的抗倒伏增 效等位基因。
[0009] 水稻強(qiáng)桿抗倒基因 prl4的分子標(biāo)記與應(yīng)用，應(yīng)用下述步驟檢測(cè)待測(cè)材料是否在 prl4座位上含有麗江新團(tuán)黑谷的抗倒伏的增效等位基因，其具體實(shí)施步驟為：
[0010] (l)DNA提取，具體過(guò)程為：
[0011] (la)取長(zhǎng)至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉 末，置于1. 5ml的微量離心管（EP)中。
[0012] (lb)加入預(yù)熱至 65 °C 的 CTAB 抽提液[2 % (w/v) CTAB ;100mmol/LTris-Hcl， ρΗ8· 0 ;20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1.4mol/LNaCl]600μ L。
[0013] (lc)輕輕混勻，使粉末充分散開(kāi)，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30-60min，期間每 5min輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻。
[0014] (Id)取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分 混勻，然后于臺(tái)式冷凍離心機(jī)上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。
[0015] (le)重復(fù)3-4次，直至中間沒(méi)有蛋白層為止。
[0016] (If)將上清液逐滴加入2倍體積的-20°c預(yù)冷的無(wú)水乙醇中，-20°c放置30min以 上。
[0017] (lg)此時(shí)可見(jiàn)DNA成棉絮狀小團(tuán)漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去 殘液，在超凈工作臺(tái)上吹干。
[0018] (lh)用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，pH8. 0)回溶待用。
[0019] (li)取 1.5yL用于 PCR擴(kuò)增。
[0020] (2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程為：PCR反應(yīng)體系為15 μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1 % Triton-X,1.5mM MgC12,200 μ Meach of dNTPs,0. 2 μ Mof each primer, 5 % (v/v)dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶。應(yīng)用美國(guó) AB 公司的 ABI-9700進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;每個(gè)循環(huán)94°C預(yù)變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8min。
[0021] (3)進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取8 μ L上樣于3. 5%的瓊脂 糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時(shí)，利用凝膠成像系統(tǒng)成像觀察。
[0022] 該發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明技術(shù)篩選了兩個(gè)水稻抗倒伏基因 prl4的分子標(biāo) 記，所述分子標(biāo)記與prl4不僅緊密連鎖而且在植株后代與所述基因共分離，因而為篩選適 于直播水稻品種和分子標(biāo)記輔助育種提供了一條很好的途徑。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中pr 14-1分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0024] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中prl4_2分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0025] 圖中標(biāo)記說(shuō)明：M :分子標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)；1 :沈農(nóng)265 ;2 :麗江新團(tuán)黑谷；3-12 :不抗倒伏 株系；13-22 :抗倒伏株系。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行描述，以便更好的理解本發(fā) 明。
[0027] 實(shí)施例
[0028] 按照水稻倒伏發(fā)生的位置，通常將倒伏分為兩種類(lèi)型："莖倒"和"根倒"。針對(duì)兩 種不同類(lèi)型，分別通過(guò)"桿強(qiáng)化"和"支持力強(qiáng)化"兩種策略加以解決。本發(fā)明實(shí)施例中，前 期通過(guò)對(duì)粳型超級(jí)稻"沈農(nóng)265"和云南地方品種"麗江新團(tuán)黑谷"的F 2和RILs群體進(jìn)行 抗倒伏相關(guān)性狀的QTL分析，鑒定了一個(gè)在不同群體類(lèi)型（&和1?11^)、不同年份（2008年、 2009年和2011年）、不同地點(diǎn)（沈陽(yáng)和哈爾濱）穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，其增效等位基因來(lái)自 于地方品種"麗江新團(tuán)黑谷"，表1為利用沈農(nóng)265/麗江新團(tuán)黑谷的匕群體（176)和重組 自交系群體（94)分別于2008、2009和2011年在沈陽(yáng)和哈爾濱兩地檢測(cè)到的第4染色體上 控制倒伏相關(guān)性狀的主效QTL，分析發(fā)現(xiàn)其控制植株下部莖桿抗折力，也就是具有"強(qiáng)桿化" 的應(yīng)用潛力，暫命名為pushing resistance of the lower part4(prl4)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn) 該區(qū)間未定位到與株高及其構(gòu)成相關(guān)的QTL，這也避免了株高對(duì)該位點(diǎn)抗倒伏分析的影響。 通過(guò)全基因組的分子標(biāo)記輔助選擇，從重組自交系群體中選出目標(biāo)區(qū)域?yàn)?黑谷"，而75% 的遺傳背景為"沈農(nóng)265"的"初始材料"，其莖桿解剖結(jié)構(gòu)與"沈農(nóng)265"差異顯著。此外，為 保障能夠?qū)⒈净虺晒寺。?012年利用"黑谷/二九南"的F2群體進(jìn)行了植株下部莖 桿抗折力的QTL分析，共檢測(cè)到3個(gè)控制植株下部莖桿抗折力的QTL。其中，位于第4染色 體的主效QTL_qPRL4與prl4在相同區(qū)域，且增效等位基因也來(lái)自"黑谷"，表2為利用麗江 新團(tuán)黑谷/二九南的F 2群體（190)于2012年在哈爾濱檢測(cè)到的控制植株下部莖桿抗折力 的QTL，從中可以看出，不僅表明prl4的真實(shí)存在，也表明其在不同遺傳背景下穩(wěn)定表達(dá)。 2013年利用該群體的F 2 : 3家系進(jìn)行了驗(yàn)證，表3為利用麗江新團(tuán)黑谷/二九南的F2 : 3家 系群體（190)于2013年在哈爾濱檢測(cè)到的控制植株下部莖桿抗折力的QTL，發(fā)現(xiàn)該QTL穩(wěn) 定表達(dá)且真實(shí)存在，并篩選了兩個(gè)水稻抗倒伏基因 prl4的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記與prl4 不僅緊密連鎖而且在植株后代與所述基因共分離，因而為篩選適于直播水稻品種和分子標(biāo) 記輔助育種提供了一條很好的途徑。
[0029] 表 1
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種水稻強(qiáng)桿抗倒基因 prl4的分子標(biāo)記與應(yīng)用，其特征在于：篩選和開(kāi)發(fā) 位于prl4兩側(cè)的特異性分子標(biāo)記，并將這個(gè)分子標(biāo)記命名為prl4-l和prl4-2,所 述片段如序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述分子標(biāo)記的核苷酸序列 如下：prl4-l 的上游弓丨物序列為：5' -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；prl4-l 的 下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；prl4-2的上游引物序列為： 5'-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ;prl4-2 的下游引物序列為：5'-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻強(qiáng)桿抗倒基因 prl4的分子標(biāo)記與應(yīng)用，其特征在于：采 用所述分子標(biāo)記，分別測(cè)定了麗江新團(tuán)黑谷和沈農(nóng)265的目標(biāo)區(qū)域，并進(jìn)行了比對(duì)分析，挑 選出一對(duì)微衛(wèi)星差異，并設(shè)計(jì)出該標(biāo)記；將此標(biāo)記應(yīng)用于麗江新團(tuán)黑谷和沈農(nóng)265進(jìn)行驗(yàn) 證，發(fā)現(xiàn)具有prl4的麗江新團(tuán)黑谷在利用prl4-l檢測(cè)時(shí)，能夠擴(kuò)增出210bp的條帶，而沈 農(nóng)265能夠擴(kuò)增出200bp的條帶；在利用prl4-2檢測(cè)時(shí)，麗江新團(tuán)黑谷能夠擴(kuò)增出200bp 的條帶，而沈農(nóng)265能夠擴(kuò)增出190bp的條帶；并進(jìn)一步對(duì)重組自交系進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這兩 個(gè)該分子標(biāo)記與prl4共分離；此分子標(biāo)記能用于鑒定待測(cè)材料是否在prl4座位上含有麗 江新團(tuán)黑谷的抗倒伏增效等位基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻強(qiáng)桿抗倒基因 prl4的分子標(biāo)記與應(yīng)用，其特征在于： 應(yīng)用下述步驟檢測(cè)待測(cè)材料是否在prl4座位上含有麗江新團(tuán)黑谷的抗倒伏的增效等位基 因，其具體實(shí)施步驟為： (l)DNA提取，具體過(guò)程為： (la) 取長(zhǎng)至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉末，置 于1. 5ml的微量離心管（EP)中； (lb) 加入預(yù)熱至 65°C 的 CTAB 抽提液[2% (w/v)CTAB ;100mmol/LTris-Hcl，ρΗ8· 0 ; 20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1·4mol/LNaCl]600 μ L ; (lc) 輕輕混勻，使粉末充分散開(kāi)，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30-60min，期間每5min 輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻； (ld) 取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分混 勻，然后于臺(tái)式冷凍離心機(jī)上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； (le) 重復(fù)3-4次，直至中間沒(méi)有蛋白層為止； (lf) 將上清液逐滴加入2倍體積的-20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇中，-20°C放置30min以上； (lg) 此時(shí)可見(jiàn)DNA成棉絮狀小團(tuán)漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去殘液， 在超凈工作臺(tái)上吹干； (lh) 用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，ρΗ8· 0)回溶待用； (li) 取1.5yL用于PCR擴(kuò)增； ⑵進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程為：PCR反應(yīng)體系為15 μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1% Triton-X, 1.5mM MgC12,200yM each of dNTPs,0. 2μΜ of each primer，5 % (v/v) dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶；應(yīng)用美國(guó) AB 公司的 ABI-9700進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5mi η ;每個(gè)循環(huán)94°C預(yù)變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8min ; (3)進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取8 μ L上樣于3. 5%的瓊脂糖凝 膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時(shí)，利用凝膠成像系統(tǒng)成像觀察。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104087575SQ201410239630
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】姜樹(shù)坤, 張喜娟, 張鳳鳴, 白良明, 孫世臣, 劉丹, 王嘉宇, 丁國(guó)華, 王彤彤, 姜輝 申請(qǐng)人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所