一種鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其表達基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其表達基因與應(yīng)用，所述的鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達基因PabHLH，核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。經(jīng)試驗證明，本發(fā)明所述的鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達基因PabHLH具有在制備生產(chǎn)聯(lián)芐類化合物中的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其表達基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其表達基因與應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]苔類植物是活性天然產(chǎn)物的寶庫，其中含有的聯(lián)芐類化合物是苔類植物所特有的，具有多種多樣的生物活性，為人們開發(fā)新藥物提供了前體化合物。然而由于苔類植物自然資源有限，原材料的來源受到限制。通過對聯(lián)芐類化合物生物合成途徑及其調(diào)控機制研究，運用代謝工程的手段，在同源或異源的植物中進行過表達，達到提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量的目的，是解決該類化合物來源的 一條途徑。苔類植物特有的聯(lián)芐類化合物和黃酮類化合物來源于一共同的苯丙烷途徑，該途徑受R2R3-MYB、MYC(bHLH)和WD40蛋白等各種類型轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。
[0003]因此通過篩選調(diào)控該途徑轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控基因，從而實現(xiàn)苔類植物過量表達聯(lián)芐類化合物的目的，是提高聯(lián)芐類化合物產(chǎn)量的有效途徑。
[0004]鈍鱗紫背苔(Plagiochasma)，是一種小型的綠色植物，結(jié)構(gòu)簡單，沒有莖葉分化，只有扁平的葉狀體，沒有真正的根和維管束。
[0005]目前，尚無通過過量表達bHLH轉(zhuǎn)錄因子提高聯(lián)芐類化合物含量的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其表達基因PabHLH與應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一種鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]上述鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達基因PabHLH，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所
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[0010]一種重組表達載體,表達載體中插入了上述表達基因PabHLH。
[0011]優(yōu)選的，所述表達載體為植物表達載體pCAMBIA1301。
[0012]一種重組細(xì)胞，含有上述重組表達載體。
[0013]優(yōu)選的，所述的重組細(xì)胞通過將上述表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)后獲得。
[0014]上述鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子、上述表達基因PabHLH、上述重組細(xì)胞在制備生產(chǎn)聯(lián)芐類化合物中的應(yīng)用。
[0015]有益效果
[0016]本發(fā)明首次利用RT-PCR方法從鈍鱗紫背苔cDNA文庫中篩選出I個基因表達量和聯(lián)芐類化合物含量呈正相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，5’RACE獲得了其全長cDNA序列。通過構(gòu)建GFP融合蛋白轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，證明該基因定位在細(xì)胞核，酵母單雜交實驗證明該基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性。在鈍鱗紫背苔中過量表達bHLH基因提高了轉(zhuǎn)基因植物中聯(lián)芐類化合物含量。構(gòu)建該基因RNAi載體，轉(zhuǎn)化鈍鱗紫背苔，相應(yīng)聯(lián)芐類化合物含量降低。從而為通過代謝工程手段提高聯(lián)芐類化合物含量提供了一個候選基因。并且，通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入鈍鱗紫背苔，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株聯(lián)芐化合物含量增加，從而證明鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達基因PabHLH具有在制備生產(chǎn)聯(lián)芐類化合物中的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1:PabHLH基因5’ -RACE擴增產(chǎn)物的電泳圖；
[0018]其中:圖A:第一輪PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖；
[0019]圖B:第二輪PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖；
[0020]圖2:表達基因PabHLH擴增產(chǎn)物電泳圖；
[0021]其中:圖A =PabHLH全長cDNA擴增結(jié)果；
[0022]圖B =PabHLH基因組DNA擴增結(jié)果；
[0023]圖C =PabHLH內(nèi)含子和外顯子分析。
[0024]圖3 =PabHLH的轉(zhuǎn)錄激活活性。
[0025]其中:圖A:PabHLH及PabHLH各截短片段PCR擴增；
[0026]圖B:對照質(zhì)粒pGBKT7與PabHLH及PabHLH各截短片段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵
[0027]母AH109后于單缺培養(yǎng)基SD-Trp與三缺培養(yǎng)基SD-Trp-His-Ade上的生長情況。
[0028]圖4 =PabHLH的亞細(xì)胞定位。
[0029]其中:圖A:軟件預(yù)測定位；
[0030]圖B:融合載體 pCAMBIA1301GFP-PabHLH 與空載體 pCAMBIA1301GFP 通過農(nóng)
[0031]桿菌介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，兩者在洋蔥表皮細(xì)胞中的表達情況；
[0032]左:激發(fā)光下綠色熒光信號；中:自然光下洋蔥表皮細(xì)胞；右:左圖與中圖疊加。
[0033]圖5:鈍鱗紫背苔愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化過程。
[0034]其中:圖A:愈傷組織與含有目的基因的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；
[0035]圖B:篩選培養(yǎng)基上篩選陽性克隆；
[0036]圖C:經(jīng)PCR鑒定的陽性克??；
[0037]圖D:陽性克隆分化出小葉片。
[0038]圖6:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PabHLH轉(zhuǎn)化愈傷組織及陽性鑒定。
[0039]其中:圖A:過表達轉(zhuǎn)基因愈傷組織陽性克隆鑒定；
[0040]圖B:轉(zhuǎn)RNAi載體愈傷組織陽性克隆鑒定。
[0041]圖7 =PabHLH轉(zhuǎn)基因愈傷組織實時定量PCR分析。
[0042]其中:圖A:過表達轉(zhuǎn)基因愈傷組織中PabHLH基因表達分析；
[0043]圖B:轉(zhuǎn)RNAi載體愈傷組織PabHLH基因表達分析。
[0044]圖8:轉(zhuǎn)基因愈傷組織化學(xué)成分分析。
[0045]其中:圖A:過表達轉(zhuǎn)基因愈傷組織和野生型愈傷組織中聯(lián)芐類化合物含量；
[0046]圖B:轉(zhuǎn)RNAi載體愈傷組織和野生型愈傷組織中聯(lián)芐類化合物含量變化；
[0047]圖C:野生型、過表達和轉(zhuǎn)RNAi載體愈傷組織聯(lián)芐類化合物HPLC分析結(jié)果；[0048]Pl:半月苔酸；P2:片葉苔素C;P3:核子木素E;P4:異地錢素C;P5:新地錢素A?！揪唧w實施方式】
[0049]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
[0050]實施例1.表達基因PabHLH的克隆[0051 ] 1.1CTAB-PVP法提取鈍鱗紫背苔總RNA
[0052](I)取新鮮鈍鱗紫背苔植物材料，洗凈后用濾紙吸干多余水分。加液氮研磨材料，反復(fù)2-3次至材料成粉末狀，取少量至提前預(yù)冷的離心管中。
[0053](2)加lml65°C預(yù)熱的CTAB-PVP提取液，振蕩緩和均勻。
[0054]上述CTAB-PVP提取緩沖液按如下方法配制:
[0055]IOOmM Tris.HCl (ρΗ8.0) ,2% CTAB (w/v) ,2% PVP (w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高壓蒸汽滅菌之后巰基乙醇加至0.2% ;以上溶液用DEPC處理過的ddH20配制，高壓滅菌后備用。
[0056](3)65°C溫浴 30min,期間每隔 6_10min 振蕩一下。
[0057](4)冷卻后加入600 μ I氯仿，振蕩混合均勻。
[0058](5) 4? 13，OOOrpm 離心 lOmin。
[0059](6)取上清轉(zhuǎn)移至新離心管，加入600 μ I氯仿，振蕩混合均勻后4°C 13，OOOrpm離心 IOmin0
[0060](7)重復(fù)上步(即用氯仿抽提三次)。
[0061](8)小心吸取上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入1/3體積的8M LiCl，_20°C靜置3h以上(或4°C靜置過夜)。
[0062](9) 4°C 13，OOOrpm 離心 IOmin,棄上清。
[0063](10)加入800 μ 175%乙醇洗滌沉淀。離心棄上清后揮干剩余乙醇。
[0064](I I)加入40 μ I Proteinase K處理后的滅菌水溶解RNA，制得總RNA。使用BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測定提取的RNA濃度及質(zhì)量，經(jīng)檢測，RNA濃度為773.7 μ g/ml, 260/280 為 1.93，260/230 為 1.89。
[0065]1.25’ RACE 的一鏈 cDNA 合成
[0066]采用試劑盒SMART? RACE cDNA Amplification Kit (購自 Clontech 公司)來進行5’ -RACE, cDNA第一鏈合成步驟如下:
[0067](I)在0.5ml離心管中加入以下成分:
[0068]3μ I 總 RNA ；1 μ 15，-CDS primer ；1 μ ISMART II A Oligo，混勻，7(TC 變性 lOmin，置于冰浴中2min, 13000rpm短暫離心3_5s使成分聚集管底。
[0069](2)在上述管中加入以下成分:2.0 μ 15Xfirst-strand buffer ；1.0 μ I DTT ( 二硫蘇糖醇，濃度 20mmol/L) ；1.0 μ IdNTP mix (eachlOmmol/L) ； 1.0 μ I PowerScript ReverseTranscriptase。
[0070](3)輕 輕混勻各成分，短暫離心，42°C空氣浴中反應(yīng)1-1.5hr。
[0071](4)加入 100 μ I Tricine-EDTA buffer 稀釋第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物。
[0072](5) 72°C加熱 7min，樣品 5’ -RACE-Ready cDNA 貯存于 _20°C冰箱中保存。[0073]1.3 目的片段的 5’ -RACE
[0074]對cDNA文庫中EST測序，對PabHLH部分序列信息進行分析后，設(shè)計兩個3’端巢式引物 PabHLHGSP 與 PabHLHNGSP，其可以與 SMART? RACE cDNA Amplification Kit (購自Clontech公司)所帶引物UPM與NUP形成嵌套。
[0075]Universal Primer A Mix (UPM)
[0076]Long:5’ - CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3’
[0077]Short:5’ - CTAATACGACTCACTATAGGGC - 3’
[0078]Nested Universal Primer A (NUP)
[0079]5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3’
[0080]PabHLHGSP:CTGCTGGGGTCTGAACGCTGGGGTG ；
[0081 ] PabHLHNGSP:CCTGGGGTAATGCTCTGCCTTTG ；
[0082]嵌套PCR的第一輪反應(yīng)體系為:
【權(quán)利要求】
1.一種鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.權(quán)利要求1所述鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達基因PabHLH，核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
3.一種重組表達載體，表達載體中插入了權(quán)利要求2所述的表達基因PabHLH。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達載體為植物表達載體PCAMBIA1301。
5.一種重組細(xì)胞，含有權(quán)利要求3所述的重組表達載體。
6.如權(quán)利要求5所述 的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的重組細(xì)胞通過將上述表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)后獲得。
7.權(quán)利要求1所述鈍鱗紫背苔bHLH轉(zhuǎn)錄因子、權(quán)利要求2所述表達基因PabHLH、權(quán)利要求5所述重組細(xì)胞在制備生產(chǎn)聯(lián)芐類化合物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/29GK104004075SQ201410239571
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】程愛霞, 武一鳳, 婁紅祥 申請人:山東大學(xué)