專利名稱：甘蔗的著絲粒序列和微型染色體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘蔗微型染色體和包含甘蔗著絲粒序列的重組染色體以及含有這些物質(zhì)的甘蔗細(xì)胞及植株。背景將新遺傳信息導(dǎo)入細(xì)胞(基因轉(zhuǎn)化)的常規(guī)方法有兩種。一種方法是把新遺傳信息導(dǎo)入到另一個(gè)被稱為“非整合型附著體載體”或者“微型染色體”的DNA分子中，這些DNA 分子可以離開(kāi)宿主染色體DNA分子并作為獨(dú)立個(gè)體(游離基因)而存活。非整合型附著體載體包含了細(xì)胞中DNA復(fù)制和維持附著體載體存活的所有必需的DNA序列片段。很多非整合型附著體載體可用于細(xì)菌細(xì)胞中(例如，參閱Maniatis等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1982年出版)。然而，目前只有少數(shù)一些能在高等真核細(xì)胞中使用的非整合型附著體載體是成熟的。高等真核細(xì)胞的非整合型附著體載體主要來(lái)自于自然界中存在的病毒。高等植物系統(tǒng)的雙生病毒是雙鏈DNA病毒，盡管雙生病毒的DNA被限制在800bp 左右，這些雙鏈DNA病毒還是通過(guò)基于非整合型附著體載體的雙鏈媒介進(jìn)行復(fù)制。雖然基于椰菜花葉病毒的非整合型附著體載體是成熟的，但是它攜帶新遺傳信息的能力仍然有限 (Brisson 等人，《自然》310 :511，1984.)。遺傳轉(zhuǎn)化的另一種常規(guī)方法是將DNA序列嵌入到受體細(xì)胞染色體中，使得新的遺傳信息可以作為天然染色體的一部分復(fù)制并分配到子代細(xì)胞中。在導(dǎo)入基因隨機(jī)的嵌入到細(xì)胞染色體之前，可能會(huì)被分解并重新形成多種不同組合(參閱Wigler等人，細(xì)胞，11 223，1977)。此過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題包括導(dǎo)入的DNA序列的重組，以及因轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的插入位點(diǎn)不同而造成的基因表達(dá)水平的不可預(yù)測(cè)性，亦稱“位點(diǎn)效應(yīng)多樣性”(參閱 Siing0等，分子細(xì)胞生物學(xué).，6 1787，1986)。而且，被嵌入的DNA通常不能像游離DNA那樣被準(zhǔn)確的切除。整合轉(zhuǎn)化的更精簡(jiǎn)的形式可通過(guò)開(kāi)發(fā)出自然界存在的病毒導(dǎo)入到宿主染色體中，成為其生命循環(huán)的一部分來(lái)實(shí)現(xiàn)，比如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(參閱Chepko等人，細(xì)胞學(xué)， 37 :1053,1984)。常用的針對(duì)高等植物的遺傳轉(zhuǎn)化方法，是在植株被致病土壤細(xì)菌即土壤桿菌感染的過(guò)程中，將細(xì)菌DNA導(dǎo)入到植株染色體中(參閱Nester，Ann. Rev. Plant Phys. ,35 387-413,1984)。通過(guò)將目的基因代替一部分自然轉(zhuǎn)移的細(xì)菌序列(轉(zhuǎn)移DNA，即T-DNA) 的方法，研究人員可以將新DNA導(dǎo)入植株細(xì)胞中。然而，即便是這個(gè)更精簡(jiǎn)的整合轉(zhuǎn)化體系也要受到以下三個(gè)方面的限制。第一，使用土壤桿菌T-DNA系統(tǒng)導(dǎo)入在植株細(xì)胞里的DNA 序列經(jīng)常被重新排列(參閱Jones等人，Mol Gen. Genet.，207 :478，1987)。第二，被導(dǎo)入的DNA序列的基因表達(dá)在不同轉(zhuǎn)化株之間存在個(gè)體差異(參閱Jones等人，Embo J. ,4 2411-2418,1985) 0這種個(gè)體差異可能是由重組序列以及植株染色體中處在其周圍的序列的影響(例如位置效應(yīng))引起的，也有可能是受轉(zhuǎn)基因甲基化作用的影響。最后，導(dǎo)入到染色體組中的外源分子可能會(huì)破壞基因、啟動(dòng)子或者使植物正常生長(zhǎng)和功能所必需的其他遺傳分子。另一種廣泛用于植株的基因轉(zhuǎn)化的方法是使用微粒轟擊法把將NA序列嵌入到染色體組中。在這個(gè)過(guò)程中，將要導(dǎo)入到植株原始染色體中的含有需遺傳分子的核酸被覆被在小金屬顆粒(例如鎢、鉬、或重金屬)的表面或者里面，這些小金屬顆粒以高速度傳遞到植株組織或細(xì)胞中。然而，與土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中的類似問(wèn)題又出現(xiàn)了，如上文中提到一樣，嵌入的DNA的表達(dá)可能會(huì)無(wú)法預(yù)測(cè)，并且將外源分子嵌入到基因組中可能會(huì)破壞植株生長(zhǎng)或?qū)ζ渖L(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。另一種更有吸引力的常用轉(zhuǎn)化方法是使用人工染色體。人工染色體是獨(dú)立存在于宿主基因組原始染色體中的游離的核酸分子。它們可呈線性DNA分子或者環(huán)狀DNA分子， 這些分子含有順式核酸序列，使其能夠進(jìn)行復(fù)制和分配。(參閱Murray等人，《自然》，305 189-193，1983)。所需的分子包括(1)復(fù)制起點(diǎn)一DNA復(fù)制起始的位點(diǎn)，(2)著絲粒一動(dòng)粒裝配的位置，它在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中負(fù)責(zé)將復(fù)制后的染色體均等地分配到子細(xì)胞中，(3)若染色體呈線性，則其中存在染色體端粒一這種染色體端粒是存在于線性染色體末端的特殊的DNA結(jié)構(gòu)，其功能是穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)和促進(jìn)DNA分子末端的完整復(fù)制。 其他的所需分子是染色質(zhì)組織序列。據(jù)文獻(xiàn)記載，在幾乎所有的真核生物中，著絲粒在穩(wěn)定染色體遺傳中起至關(guān)重要的作用(參閱Nicklas 1988)。在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中，著絲粒通過(guò)其結(jié)合蛋白質(zhì)連接到紡錘絲上，從而保證細(xì)胞分裂過(guò)程中基因的正常分割。人工染色體可以由下兩種方法得到。第一種方法是把所需染色體分子識(shí)別并整合到一個(gè)人造結(jié)構(gòu)中。這被描述為“自下而上”的方法，它利用異源系統(tǒng)(例如細(xì)菌、真菌) 來(lái)進(jìn)行整合人工染色體所需的各種克隆步驟。這種形式的人工染色體就是本應(yīng)用中所提到的“微型染色體”。第二種是通過(guò)染色體碎片的方法從現(xiàn)有染色體中提取出人工染色體，隨后選擇性的加入包括轉(zhuǎn)基因在內(nèi)的所需分子。例如現(xiàn)有染色體通過(guò)誘導(dǎo)而破壞，繼而產(chǎn)生染色體片段。在細(xì)胞分裂過(guò)程中，含有起遺傳和分割作用分子的小片段(如著絲粒、復(fù)制起點(diǎn)、和/或染色體終端)能夠被識(shí)別。這些獲得的人工染色體可在隨后的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的再?gòu)?fù)制中用作靶子。這被描述為“自上而下”的方法，因?yàn)椴恍枰褂迷嚬芸寺?，故不需要異源系統(tǒng)(例如細(xì)菌、真菌)。這類的人工染色體是本文所提到的“重組染色體”。低等真核生物中構(gòu)成人工染色體的主要染色體分子早已完成特征描述，近期也已經(jīng)完成對(duì)于老鼠和人類染色體的特征描述。自主復(fù)制序列(ARSs)也已經(jīng)從包括釀酒酵母 (啤酒酵母)和裂殖酵母等單細(xì)胞真菌中分離出來(lái)(參閱Minchcomb等人，1979和Hsiao 等人，1979)。ARS起復(fù)制起點(diǎn)的作用，即將含有ARS的DNA分子和引入到真菌細(xì)胞核中隨其他基因組一起復(fù)制。雖然缺少著絲粒，包含了這些序列的DNA分子仍然可以復(fù)制，但是這種復(fù)制不能保證染色體以可控方式將染色體分配到子細(xì)胞中。人工染色體在酵母中通過(guò)三種必需的克隆染色體分子來(lái)組建(參閱Murray等人， 《自然》，305:189-193，1983)。然而在單細(xì)胞生物中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可以在真核系統(tǒng)中作用的必需遺傳分子。例如酵母菌著絲粒序列在轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞里以后，并不會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳。比起過(guò)去對(duì)酵母菌的詳細(xì)研究，高等真核細(xì)胞的功能性著絲粒DNA的研究少之甚少。超微結(jié)構(gòu)研究表明高等真核細(xì)胞的著絲點(diǎn)是包含很多微管附著位點(diǎn)的大型結(jié)構(gòu)，而這些著絲點(diǎn)是在細(xì)胞分裂晚前期形成在著絲點(diǎn)上的特異蛋白復(fù)合體(哺乳動(dòng)物動(dòng)粒板的直徑大約是0. 3微米)(參閱Rieder，1982)。因此，雖然少量著絲粒所需的DNA功能會(huì)小很多，但是這些生物的著絲粒DNA區(qū)域相應(yīng)地大一些。以上研究有助于闡明著絲粒的結(jié)構(gòu)和功能，但是目前還尚不明確到底是來(lái)源于低等真核生物或者哺乳類高等真核生物的遺傳信息適用于甘蔗。所以，有必要克隆甘蔗著絲粒，因?yàn)檫@將會(huì)成為甘蔗人工染色體成果或者識(shí)別甘蔗染色體重組的第一步。接下來(lái)還需要包含功能穩(wěn)定的自主型人工染色體或重組染色體的甘蔗細(xì)胞、作物和子代來(lái)攜帶不同基因和遺傳物質(zhì)。
發(fā)明摘要本發(fā)明一方面著重介紹甘蔗的染色體包含一個(gè)甘蔗的著絲粒，而甘蔗著絲粒又由一個(gè)或者多個(gè)核苷酸重復(fù)序列組成。這種情況在此會(huì)作進(jìn)一步詳細(xì)描述。在一些實(shí)驗(yàn)案例中，這種微型染色體包含一個(gè)著絲粒，這個(gè)著絲粒又包含一個(gè)或者多個(gè)隨機(jī)組合的重復(fù)核苷酸序列。這些核苷酸序列來(lái)源于甘蔗，包括從重復(fù)序列的甘蔗基因組DNA分離出來(lái)的物質(zhì)以及合成序列。而在其他的實(shí)驗(yàn)案例中，本發(fā)明聲稱甘蔗重組了染色體。另一方面，本發(fā)明準(zhǔn)備了改良的甘蔗植株或者“加強(qiáng)型染色體的”甘蔗植株。這些甘蔗植株包括功能穩(wěn)定的、自主型人工微型染色體或重組染色體。本發(fā)明準(zhǔn)備了已分離的甘蔗微型染色體。微型染色體包含一個(gè)著絲粒。著絲粒其中含有兩份以上核苷酸重復(fù)序列，它起著分離子細(xì)胞的作用。核苷酸重復(fù)序列可能是短的甘蔗衛(wèi)星序列(如SEQ ID NOS :1-201)、甘蔗衛(wèi)星共有序列(如SEQ ID NO :202)或甘蔗衛(wèi)星序列嵌段(如SEQ ID NO :204)。核苷酸重復(fù)序列也可以是較長(zhǎng)的序列，如甘蔗逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列 CRS (如 SEQ ID NO :203)。本發(fā)明還準(zhǔn)備了本發(fā)明中的含有多核苷酸、核酸、載體、甘蔗著絲粒的細(xì)胞，甘蔗人工微型染色體和/或甘蔗重組基因。一些實(shí)施例中用的是獨(dú)立細(xì)胞。而其他具有代表性的實(shí)施例中用的是甘蔗細(xì)胞。因此，一方面本發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)多核苷酸，此多核苷酸中含有一個(gè)核苷酸序列，而這個(gè)核苷酸序列是從以下幾組中篩選出來(lái)的(a) SEQ ID NOS :1-204中的任意核苷酸序列， (b)與 SEQ ID NOS :1-204 中任意序列至少 80%，85%，90%，95%，97%，98% or 99%相似的核苷酸序列，任選的核苷酸序列功能與甘蔗著絲粒相似(例如起分裂到子細(xì)胞的作用)，和/或(c)在嚴(yán)格條件(65°C的溫度，在65°C時(shí)用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，時(shí)間為15分鐘)下與SEQ ID NOS :1-204中任意核苷酸序列雜交的序列，任選的核苷酸序列功能與甘蔗著絲粒相似。另一方面，本發(fā)明準(zhǔn)備了含有一個(gè)排列的核酸。此排列包括大約2個(gè)以上，大約10
個(gè)以上，大約100個(gè)以上......直到大約1000個(gè)的多核苷酸，或者從大約5個(gè)直到250份
多核苷酸。在代表性實(shí)施例中，此排列的長(zhǎng)度在從大約11Λ到2001Λ之間，也可在151Λ到 28kb之間。在典型實(shí)施例中，核苷酸的功能與甘蔗著絲粒相似。此項(xiàng)發(fā)明進(jìn)一步包含了一個(gè)甘蔗著絲粒，此甘蔗著絲粒由一個(gè)多核苷酸或者核酸組成。此項(xiàng)發(fā)明還準(zhǔn)備了一個(gè)甘蔗人工染色體，此甘蔗人工染色體包含一個(gè)多核苷酸、核酸或者著絲粒。在一些實(shí)施例中，甘蔗人工染色體進(jìn)一步由一個(gè)外源核酸(例如至少三個(gè)外源核酸)組成，其中至少一個(gè)可以隨機(jī)地連接到甘蔗植株細(xì)胞的異源調(diào)控序列上。在一些更有代表性的實(shí)施例中，此發(fā)明展示了甘蔗人工染色體在甘蔗植株細(xì)胞的有絲分裂有效性至少為60 %，70 %，80 %，85 %，90 %，95 %或者更多?，F(xiàn)有發(fā)明包括了一個(gè)載體，此載體由多核苷酸、核酸或甘蔗著絲粒、或者甘蔗人工染色體組成。另一方面，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)含有多核苷酸、核酸或甘蔗著絲粒、甘蔗人工染色體或者載體的細(xì)胞。代表性實(shí)施例中用的是甘蔗植株細(xì)胞。在一些特殊實(shí)施例中，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)甘蔗植株細(xì)胞，這個(gè)甘蔗植株細(xì)胞包括一個(gè)甘蔗人工染色體，其中甘蔗人工染色體并未融入甘蔗植株細(xì)胞的染色體組中。甘蔗植株細(xì)胞包含任意一個(gè)甘蔗人工染色體，而這個(gè)甘蔗人工染色體包含一個(gè)外源核酸，其中甘蔗植株細(xì)胞展示出一個(gè)與外源核酸表達(dá)連在一起的變異表型。這個(gè)變異表型可以做任何可觀察和測(cè)量到的表型興趣遷移。在典型實(shí)施例中，變異表型由本土基因的變異表達(dá)(如 增加或減少的表達(dá))組成。在其他的一些實(shí)施例中，變異表型由外源基因的變異表達(dá)組成。在深層次上，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)甘蔗植株組織、甘蔗植株、和/或一個(gè)含有甘蔗植株細(xì)胞的甘蔗植株部分。此項(xiàng)發(fā)明還準(zhǔn)備了一個(gè)從此發(fā)明中的甘蔗植株獲得的種子。此發(fā)明還研究了甘蔗植株子代。甘蔗植株子代包括甘蔗人工染色體，其中植株子代是此發(fā)明中含有甘蔗人工染色體的甘蔗植株繁殖的。另一方面，此發(fā)明準(zhǔn)備了用本發(fā)明中甘蔗植株的方法。其中甘蔗植株含有甘蔗人工染色體，而甘蔗人工染色體又含有一個(gè)編碼重組蛋白的外源核酸。此方法囊括了從植株生長(zhǎng)到產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的整個(gè)過(guò)程。此外，此方法還可以選擇性地進(jìn)一步包括收獲和/或加工甘蔗作物。 在典型實(shí)施例中，此發(fā)明為甘蔗植物細(xì)胞提供了一個(gè)甘蔗微型染色體。此染色體包括一個(gè)甘蔗著絲粒。而甘蔗著絲粒中又包含了至少兩份核苷酸重復(fù)序列。這些核苷酸重復(fù)序列在一定條件(65°C雜交，65°C的溫度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，時(shí)間為15 分鐘)下雜交到SEQ ID NOS :1-204包含的核苷酸序列中。其中著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用?；蛘?，雜交條件是在65°C恒溫，650C的溫度下用0. 25x SSC, 0. 1 % SDS清洗三次， 時(shí)間為15分鐘。在其他一些典型實(shí)施例中，此發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)含有甘蔗微型染色體的甘蔗植株細(xì)胞。這個(gè)甘蔗微型染色體包括一個(gè)甘蔗著絲粒。其中著絲粒至少兩份核苷酸重復(fù)序列。這個(gè)序列與SEQ ID NOS :1-204中選取的一個(gè)核苷酸序列至少80%相同。其中著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用。此發(fā)明還提供一個(gè)含有甘蔗微型染色體的甘蔗植株細(xì)胞，其中重復(fù)的核苷酸序列包含了一段與SEQ ID NOS :1-204中選取的一段核苷酸序列至少85%、90%、 95%、98% 相同。在另一些實(shí)施例中，此發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)甘蔗植株細(xì)胞。它包含一個(gè)甘蔗應(yīng)用微型染色體。而這個(gè)甘蔗應(yīng)用微型染色體又由至少兩份核苷酸重復(fù)序列組成。此核苷酸重復(fù)序列要與SEQ ID NOS :1-204中任意一段核苷酸序列至少80%相似，或者在嚴(yán)格條件(65°C恒溫，在65°C的條件下用0. 25x SSC, 0. 1 % SDS清洗三次，時(shí)間為15分鐘)下與SEQ ID NOS 1-204中的任意一段核苷酸序列雜交。此甘蔗應(yīng)用微型染色體還包括一個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。在更進(jìn)一步的實(shí)施例中，此發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)含有甘蔗微型染色體的甘蔗植株細(xì)胞。這個(gè)甘蔗微型染色體包括一個(gè)甘蔗著絲粒。其中，著絲粒包括(a)至少兩份甘蔗衛(wèi)星核苷酸序列(如SEQ ID NO 204), (b)至少兩份甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO :203)。 其中著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用。在其他一些實(shí)施例中，此發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)含有甘蔗微型染色體的甘蔗植株細(xì)胞。此甘蔗微型染色體含有一個(gè)甘蔗著絲粒。其中著絲粒包括 (a)甘蔗衛(wèi)星核苷酸序列的至少一個(gè)陣列，(b)甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO :203)的至少一個(gè)陣列。其中著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用。甘蔗衛(wèi)星核苷酸序列可能會(huì)是SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204中的一段序列，也可能是一定條件(65°C雜交，65°C溫度下用0. 25x SSC，0. SDS清洗三次，共十五分鐘)下雜交的序列，還可能是與SEQ ID NOS 1-202和SEQ ID NO :204中選取的核苷酸序列80%相似的序列。另外，此項(xiàng)目準(zhǔn)備了一個(gè)含有甘蔗應(yīng)用微型染色體的甘蔗植株細(xì)胞。此甘蔗應(yīng)用微型染色體包含一個(gè)甘蔗著絲粒，其中甘蔗著絲粒包含了(a)在11Λ核苷酸序列范圍內(nèi)的至少五份核苷酸重復(fù)序列，其中核苷酸重復(fù)序列與SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204中的任意一段核苷酸序列有80%相同，或是與SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204中任一段核苷酸序列在嚴(yán)格條件(65°C雜交，65°C溫度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分鐘)下雜交；(b)至少兩份核苷酸重復(fù)序列在長(zhǎng)度上與SEQ ID NO 203中一段核苷酸序列至少80%相同，或是與SEQ ID而203中任一段核苷酸序列在嚴(yán)格條件(651雜交，651 溫度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分鐘)下雜交。在另一些實(shí)施例中，此項(xiàng)目準(zhǔn)備了一個(gè)甘蔗植株細(xì)胞。它含有(a) —個(gè)轉(zhuǎn)錄為核糖核酸I的多核苷酸序列、(b) 一個(gè)轉(zhuǎn)錄為核糖核酸II的多核苷酸序列、(c) 一個(gè)轉(zhuǎn)錄為核糖核酸III的多核苷酸序列。其中多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄會(huì)導(dǎo)致甘蔗植株的生物量增加。在附加的實(shí)施例中，此發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)含有轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的甘蔗植株細(xì)胞。這個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒不融入在植株細(xì)胞基因組里面。其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含了(a) (a) 一個(gè)轉(zhuǎn)錄為核糖核酸I的多核苷酸序列、(b) —個(gè)轉(zhuǎn)錄為核糖核酸II的多核苷酸序列、(c) 一個(gè)轉(zhuǎn)錄為核糖核酸III的多核苷酸序列。其中多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄會(huì)導(dǎo)致甘蔗植株的生物量增加。此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)包含有重組染色體的甘蔗植株細(xì)胞。此重組染色體由至少兩份核苷酸重復(fù)序列組成。其中著絲粒起分離子代的作用。核苷酸重復(fù)序列可能是短小的甘蔗衛(wèi)星序列(如SEQ ID NOS :1-201)，也可能是甘蔗衛(wèi)星共有序列(如SEQ ID NO :202)或者甘蔗衛(wèi)星序列塊(如SEQ ID NO :204)。核苷酸重復(fù)序列也有可能是較長(zhǎng)的序列，例如甘蔗逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列CRS (如SEQ ID NO :203)。在典型的實(shí)施例中，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)包含有重組染色體的甘蔗植株細(xì)胞。此重組染色體包含一個(gè)甘蔗著絲粒，而甘蔗著絲粒又包含了至少兩段核苷酸重復(fù)序列。這個(gè)核苷酸重復(fù)序列中至少有一段序列是與SEQ ID NOS :1-204中挑選出來(lái)的任意一段核苷酸序列在一定條件(65°C雜交，65°C溫度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分鐘) 下雜交而得到的。其中，著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用。或者雜交條件可替代為65°C雜交，65°C溫度下用0. 25x SSC,0. 1% SDS SDS清洗三次，共十五分鐘。在另一個(gè)典型的實(shí)施例中，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)包含有重組染色體的甘蔗植株細(xì)胞。此重組染色體包含至少兩段核苷酸重復(fù)序列。這個(gè)重復(fù)核苷酸序列中至少有一段序列要與SEQ ID NOS :1-204挑選出來(lái)的核苷酸序列至少80%相同。這個(gè)核苷酸重復(fù)序列還包括含有至少三個(gè)外源核酸的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。此項(xiàng)發(fā)明還提供了甘蔗重組染色體，其中核苷酸重復(fù)序列包括一段與SEQ ID NOS :1-204中挑選出的核苷酸序列至少有85^^90^^95% 或者98%相似的序列。在另外的實(shí)施例中，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)包含有重組染色體的甘蔗植株細(xì)胞。這個(gè)重組染色體由一個(gè)甘蔗著絲粒組成。其中此著絲粒包括(a)至少兩份復(fù)制的甘蔗衛(wèi)星核苷酸序列(b)，至少兩份復(fù)制的甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO :203)，其中著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用。在另一實(shí)施例中，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了包含有甘蔗著絲粒的甘蔗重組染色體。其中著絲粒包括(a)甘蔗衛(wèi)星核苷酸序列中的至少一組排列，(b)甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO 203)中的至少一組排列，其中著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用。甘蔗衛(wèi)星核苷酸序列可能是SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204所示的任一序列，也可以是在一定條件(65°C雜交，65°C溫度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分鐘)下與SEQ ID NOS :1-202 和 SEQ ID NO :204 雜交出來(lái)的序列，還可能是 SEQ ID NOS 1-202 與 SEQ ID NO: 204中篩選出來(lái)的核苷酸序列80%相同的序列。另外，此項(xiàng)還發(fā)明準(zhǔn)備了由重組染色體組成的甘蔗植株細(xì)胞。此重組染色體中不供養(yǎng)在外源有機(jī)體的細(xì)胞里。在另一實(shí)施例中，此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了一個(gè)甘蔗植株細(xì)胞。它包含(a)至少兩份復(fù)制的重復(fù)核苷酸序列，此序列應(yīng)與SEQ ID NOS :1-204中任一核苷酸序列至少80%相同，或與 SEQ ID而5:1-204中任一核苷酸序列在嚴(yán)格條件(651雜交，651溫度下用0.251 SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分鐘)下雜交而獲得的序列；(b)含有至少三個(gè)異源核酸的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中核苷酸序列和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒不融入到甘蔗植株細(xì)胞的基因組中。此項(xiàng)發(fā)明還準(zhǔn)備了含有甘蔗微型染色體的甘蔗植株細(xì)胞。此甘蔗微型染色體含有一個(gè)甘蔗著絲點(diǎn)，其中著絲點(diǎn)包含重復(fù)核苷酸序列的兩個(gè)以上的人工合成重復(fù)序列或一個(gè)人工合成的排列。這個(gè)排列中又包含了兩份復(fù)制的重復(fù)核苷酸序列。其中著絲粒起分離甘蔗子細(xì)胞的作用。這些人工合成的重復(fù)核苷酸序列基于天然甘蔗著絲粒序列的序列信息、 天然甘蔗著絲粒序列的組合或片段，包括不等長(zhǎng)序列重復(fù)的組合、不同序列的組合、不等長(zhǎng)及不同序列重復(fù)的組合、不同人工合成序列的組合或天然甘蔗著絲粒序列與人工合成序列的組合。甘蔗重復(fù)序列及其合成排列中的含有合成排列的多核苷酸可能會(huì)通過(guò)已知的技術(shù) (包括PCR)而從甘蔗基因組DNA (或它的克隆)或特定的寡核苷酸合成而產(chǎn)生。此項(xiàng)發(fā)明準(zhǔn)備了甘蔗微型染色體或者重組染色體。其中任一染色體包含一個(gè)著絲粒，而著絲粒中又包含長(zhǎng)度大約在11Λ到2001Λ、11Λ到IOOWk 11Λ到101Λ、21Λ到121Λ、51Λ 到、101Λ到501Λ、251Λ到1001Λ范圍內(nèi)的重復(fù)核苷酸序列。此項(xiàng)發(fā)明深思了本發(fā)明中任一甘蔗微型染色體或者重組染色體的著絲粒，這些著絲粒至少有 300bp, 400bp, 500bp, 600bp, 700bp, 750bp, Ikb, 1. 5kb，2kb，2. 5kb，3kb，3. 5kb, 4kb，4. 5kb，5kb，5. 5kb，6kb，6. 5kb，7kb，7. 5kb，8kb，8. 5kb，9kb，9. 5kb, IOkb, 10. 5kb, llkb, 11. 5kb, 12kb,12. 5kb,13kb,13. 5kb,14kb,14. 5kb,15kb,16kb,17kb,18kb,19kb,20kb, 25kb,30kb,35kb,40kb,45kb,50kb,60kb,70kb,80kb,90kb,IOOkb,IlOkb,120kb,130kb, 140kb,150kb,160kb,170kb,180kb,190kb,200kb,225kb,250kb,275kb,300kb,325kb,350kbor 375kb.另一實(shí)施案例中，本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或重組染色體的著絲粒都包括 η個(gè)重復(fù)核苷酸序列副本，其中η小于2000、小于1000、小于500、小于400、小于300、小于 250、小于200、小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于 24、小于20、小于15、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6或者小于5。某一具代表性的實(shí)施案例中，本發(fā)明中的甘蔗微型染色體的著絲粒都包括η個(gè)重復(fù)核苷酸序列副本，其中η至少為 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、 600、650、700、750、800、850、900或者1000。在另一具代表性的實(shí)施案例中，本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或重組染色體著絲粒都包括η個(gè)重復(fù)核苷酸序列副本其中η的范圍為2 到 10、2 到 20、2 到 50、2 到 100,2 到 250,2 到 500,2 到 1000,5 到 15、5 到 25、5 到 50、5 到 100,5 到 250,5 到 500,5 到 1000、15 到 25、15 到 50、15 到 100、15 到 250、15 到 500、15 到 1000、25 到 50、25 到 100、25 到 250、25 到 500、25 到 1000、50 到 100、50 到 250、50 到 500、 50 到 1000、100 到 250、100 到 500、100 到 1000、250 到 500、250 到 1000、或者 500 到 1000。本發(fā)明的某一實(shí)施案例中，本發(fā)明中的任何甘蔗微型染色體或重組染色體均含有一個(gè)著絲粒，該著絲粒包括至少5個(gè)“頭尾相接”連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列(比如.，SEQ ID NO :204)。本發(fā)明的某一實(shí)施案例中，本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或重組染色體均包括一個(gè)著絲粒，著絲粒含有5個(gè)以串聯(lián)形式存在的連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列副本，其中任何重復(fù)序列在各個(gè)方向上與其他重復(fù)序列緊鄰，比如從頭到尾、從尾到尾、從頭到頭。本發(fā)明中還提出了所有甘蔗微型染色體或重組染色體都包含一個(gè)著絲粒，著絲粒都包括至少5個(gè)連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列。其中，“連續(xù)”是指相同或相近的重復(fù)核苷酸序列(比如至少70%完全相似)一個(gè)接一個(gè)，不會(huì)因其他重要的序列元素而中斷。連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列全方位相互緊鄰，如頭尾相接、尾尾相接、頭頭相接(比如間距可能為l_50bp)。本發(fā)明進(jìn)一步指出，本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或重組染色體都含有一個(gè)著絲粒，著絲粒包括至少5個(gè)連續(xù)重復(fù)核苷酸序列，這些序列被少于η個(gè)的核苷酸分隔開(kāi)(如 SEQ ID NO :204)，其中η的范圍從1到10、或者1到20、或者1到30、或者1到40、或者1 到50、或者其中的η少于10bp、或者η少于20bp、或者η少于30bp、或者η少于40bp、或η 少于50bp。本發(fā)明提出本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或重組染色體都包括一個(gè)著絲粒，著絲粒包括至少2列連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列(比如，SEQIDNO :204)，其中列包括至少2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、 500、600、700、800、900、1000或者2000個(gè)重復(fù)核苷酸序列。一個(gè)序列中的重復(fù)可能全方位相互連接，如頭尾相接、尾尾相接、頭頭相接。序列可能會(huì)被少于η個(gè)的核苷酸分隔開(kāi)，其中 η范圍是1到10、或者1到20、或者1到30、或者1到40、或者1到50、或者1到60、或者1 到70、或者1到80、或者1到90、或者1到100、或者其中η少于10bp、或者η少于20bp、或者η少于30bp、或者η少于40bp、或η少于50bp。兩組序列包括相同的重復(fù)核苷酸序列或者兩個(gè)不同的重復(fù)核苷酸序列(比如第一組序列由重復(fù)類型1組成，第二組陣列由重復(fù)類型2組成，其中“類型1，，和“類型2”可以任意指定)。 本發(fā)明的某一實(shí)施案例中，本發(fā)明中的任何甘蔗微型染色體或重組染色體的長(zhǎng)度等于或小于IOOOWk等于或小于9001Λ、等于或小于8001Λ、或等于或小于7001Λ。在某一具代表性的實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體長(zhǎng)度等于或小于6001Λ、長(zhǎng)度等于或小于5001Λ、長(zhǎng)度等于或小于2501Λ、長(zhǎng)度等于或小于IOOWk長(zhǎng)度等于或小于501Λ、長(zhǎng)度等于或小于IOWK 長(zhǎng)度等于或小于51Λ、抑或長(zhǎng)度等于或小于11Λ。比如，本發(fā)明中的甘蔗微型染色體長(zhǎng)度為 50到2501Λ、長(zhǎng)度為50到1001Λ、長(zhǎng)度為50到751Λ、長(zhǎng)度為50到1001Λ、長(zhǎng)度為60kb到 851Λ、長(zhǎng)度為70到901Λ、長(zhǎng)度為75到1001Λ、長(zhǎng)度為100到2501Λ、長(zhǎng)度為250到500kb、 長(zhǎng)度為500到10001Λ。某一具代表性的實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體長(zhǎng)度為觀吐、長(zhǎng)度為 421Λ、長(zhǎng)度為821Λ、長(zhǎng)度為871Λ、長(zhǎng)度為881Λ、長(zhǎng)度為971Λ、長(zhǎng)度為1301Λ、長(zhǎng)度為1501Λ、長(zhǎng)度為2001Λ或者長(zhǎng)度范圍為觀-200吐。在本發(fā)明中，在有絲分裂過(guò)程中，微型染色體的隔離效率最好不低于60%，不低于80%，不低于90%或不低于95%，以及/或者在減數(shù)分裂過(guò)程中，傳播效率最好不低于60 %，不低于80 %，不低于85 %，不低于90 %或者不低于95 %。在有絲分裂過(guò)程中，本發(fā)明中的甘蔗微型染色體或重組染色體的隔離效率至少不低于60 %、80 %、90 %或者95 %，并且/或者在減數(shù)分裂過(guò)程中的傳輸效率最好不低于比如 60%，80%，85%，90% 或者 95%。另一實(shí)施案例中，本發(fā)明中的甘蔗微型染色體或重組染色體包括一個(gè)特定的重組
點(diǎn)ο本發(fā)明還提出了一種甘蔗微型染色體，其中微型染色體來(lái)自于供體克隆或著絲?？寺?。相比核苷酸序列的供體克隆或著絲?？寺?，微型染色體可以將一個(gè)或多個(gè)核苷酸進(jìn)行替換、刪除、插入、復(fù)制或者排列。某一實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體是通過(guò)一個(gè)或者多個(gè)母體的甘蔗微型染色體傳代得到的。另一實(shí)施案例中，微型染色體是通過(guò)兩個(gè)或者多個(gè)不同母體的甘蔗微型染色體傳代得到的。母體可從特定組中，這個(gè)組包括病毒、細(xì)菌以及酵母。另一實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體通過(guò)體外培養(yǎng)的方法從供體克隆中獲得，，具體過(guò)程是將序列異變或它的互補(bǔ)序列導(dǎo)入基于模板的供體克隆復(fù)制過(guò)程。另一實(shí)施案例中，序列異變通過(guò)一種依賴于DNA的DNA聚合酶導(dǎo)入。又另一個(gè)實(shí)施案例中，通過(guò)體外培養(yǎng)方法得到的甘蔗微型染色體將通過(guò)一個(gè)或多個(gè)母體的微型染色體傳代進(jìn)一步改變微型染色體。本發(fā)明還提供了至少包括一個(gè)外源性核酸的微型染色體的甘蔗微型染色體或重組染色體。某具代表性的實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體或重組染色體包括不少于2個(gè)、不少于3個(gè)、不少于4個(gè)、不少于5、不少于10個(gè)、不少于20個(gè)、不少于30、不少于40、不少于50 個(gè)外源性核酸。某一實(shí)施案例中，本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或者重組染色體中的至少一個(gè)外源性核酸可連接到一個(gè)植物細(xì)胞中的異源調(diào)控功能序列，該序列可以是植物調(diào)控序列或其它序列。本發(fā)明提供提供了連接到一個(gè)非植物，比如節(jié)肢動(dòng)物、病毒、細(xì)菌、脊椎動(dòng)物或者酵母的調(diào)控序列的外源性核酸。此外，本發(fā)明還提供提供了一個(gè)連接到一個(gè)來(lái)自甘蔗調(diào)控序列的外源性核酸。本發(fā)明還提供了包括了一個(gè)或一組基因的微型染色體或者重組染色體，以提高總的甘蔗產(chǎn)糖量。這些基因可用于增加蔗糖中莖汁糖濃度、蔗汁總量、莖強(qiáng)度、產(chǎn)量、以及植物生物物質(zhì)總量。這種基因來(lái)自于細(xì)菌序列，如蔗糖異構(gòu)酶，也可以來(lái)自動(dòng)物、植物真菌、或原生生物序列。這些基因可能包括參與糖類代謝或糖類運(yùn)輸?shù)幕?、或參與到糖類代謝和運(yùn)輸中發(fā)揮作用未知，但是已被證明是可增加總產(chǎn)糖量的基因。它還可能包括影響植物高度、莖稈直徑、水代謝或者生物質(zhì)總量的基因及可能平衡淀粉和糖量的基因。通過(guò)多個(gè)這種基因?qū)嶒?yàn)證明它們能提高糖積累。比如，一種細(xì)菌蔗糖異構(gòu)酶能將蔗糖含量提高兩倍之多 (Birch,R. G. , and Wu，L (2007). Doubled sugar content in Sugarcane plants modified to produce a sucrose isomer. Plant Biotechnology Journal 5:109-117)。木質(zhì)素欠缺的“褐色葉中脈”突變通過(guò)對(duì)木質(zhì)素的作用能提高高粱含糖量，這是由高粱基因組中肉桂醇脫氫酶(CAD)突變、及高粱基因組中包含的類似14CAD的基因所造成的(Saballos， Α.，Ejeta，G.，Sanchez,Ε.，Kang, C.，and Vermerris，W. (2008). A Genome-Wide Analysis of the Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Family in Sorghum(Sorghum bicolor(L.) Moench)Identifies SbCAD2 as the Brown midrib6 Gene. Genetics)。另一實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體或者重組染色體包括一個(gè)具有所需特性的QTL 的外源性核酸。在蔗糖中，影響總產(chǎn)糖量的QTL的基因圖譜已經(jīng)被繪制了出來(lái)(Murray， S. C.，Sharma, A.，Rooney, W. L，Klein，P.，Mullet，J. Ε.，Mitchell，S. Ε.，Kresovitch， S. (2008)Genetic Improvement of Sorghum as a Biofuel Feedstock :I.QTL for Stem Sugar and Grain Nonstructural Carbohydrates. Crop Sci. 48 :2165-2179)。另一實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體或者重組染色體包括一個(gè)外源性核酸，核酸使甘蔗具有抗除草劑、抗蟲、抗病、抗逆性等特性。本發(fā)明提供了包括一個(gè)外源性核酸的甘蔗微型染色體或重組染色體，外源性核酸能甘蔗具有抗草丁琳或者草甘膦除草劑等特性。非限定的例子包括一個(gè)外源性核酸，它能起到膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰羥基酸合成酶編碼或突變的烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶。非限定性的例子還包括能使甘蔗具有抗蟲性的外源性核酸，它包含蘇云金芽孢桿菌毒素基因或蠟樣芽胞桿菌毒素基因。在相關(guān)的實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體或者重組染色體包含一個(gè)使甘蔗具有抗除草劑特性的外源性核酸、一個(gè)能夠使甘蔗具有抗蟲性特性的外源性核酸，并至少增選一個(gè)外源性核酸。本發(fā)明還提供了攜帶甘蔗基因組中已發(fā)現(xiàn)的新增基因副本的甘蔗微型染色體或者重組染色體。本發(fā)明還提供了額外甘蔗基因副本，該副本是甘蔗微型染色體或者重組染色體攜帶，并能連接到它們的原生調(diào)控序列或者異源調(diào)控序列。本發(fā)明還提供了包括一個(gè)外源性核酸的甘蔗微型染色體或者重組染色體。該核酸能使甘蔗具有抗旱、抗熱、抗冷、抗凍、抗過(guò)度濕潤(rùn)、抗紫外線、抗電離輻射、抗毒素、抗污染、 抗機(jī)械應(yīng)力或者抗鹽分失調(diào)等特性。本發(fā)明還提供了一個(gè)甘蔗微型染色體，它包括一個(gè)能使甘蔗具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌或線蟲特性的外源性核酸。本發(fā)明提供了甘蔗微型染色體或者重組染色體，它們包括一個(gè)從以下的組中選出的外源性核酸一個(gè)固氮基因、一個(gè)植物脅迫誘導(dǎo)基因、一個(gè)營(yíng)養(yǎng)利用基因、一個(gè)影響植物色素沉著的基因、一個(gè)編碼一種反義或核酶分子的基因、一個(gè)編碼一種分泌抗原的基因、一個(gè)毒素基因、一個(gè)感受基因、一個(gè)配體基因、一個(gè)種子貯藏基因、一個(gè)生長(zhǎng)素基因、一個(gè)酶基因、一個(gè)白細(xì)胞介素基因、一個(gè)凝血因子基因、一個(gè)細(xì)胞因子基因、一個(gè)抗體基因、一個(gè)生長(zhǎng)因子基因、一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因、一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制基因、一個(gè)DNA結(jié)合蛋白基因、一個(gè)重組基因、 一個(gè)基因復(fù)制基因、一個(gè)程序性細(xì)胞死亡基因、.一個(gè)激酶基因、一個(gè)磷酸酶基因、一個(gè)G蛋白基因、一個(gè)細(xì)胞周期蛋白基因、一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控基因、一個(gè)參與轉(zhuǎn)錄的基因、一個(gè)參與翻譯的基因、一個(gè)參與核糖核酸處理的基因、一個(gè)參與RNA干擾的基因、一個(gè)細(xì)胞器基因、一個(gè)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)基因、一個(gè)完整的膜蛋白基因、一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因、一個(gè)膜通道蛋白基因、一個(gè)細(xì)胞壁基因、一個(gè)參與蛋白質(zhì)加工的基因、一個(gè)參與蛋白質(zhì)修飾的基因、一個(gè)參與蛋白質(zhì)降解的基因、一個(gè)參與新陳代謝的基因、一個(gè)參與生物合成的基因、一個(gè)參與氮或其他元素或營(yíng)養(yǎng)素同化的基因、一個(gè)參與碳通量控制的基因、一個(gè)參與呼吸的基因、一個(gè)參與光合作用的基因、一個(gè)參與光感應(yīng)的基因、一個(gè)參與器官形成的基因、一個(gè)參與胚胎發(fā)育的基因、一個(gè)參與分異作用的基因、一個(gè)參與減數(shù)分裂驅(qū)動(dòng)的基因、一個(gè)參與自交不親和性的基因、一個(gè)參與發(fā)展的基因、一個(gè)參與營(yíng)養(yǎng)、代謝或礦物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因、一個(gè)參與營(yíng)養(yǎng)、代謝產(chǎn)物或礦物質(zhì)存儲(chǔ)的基因、一個(gè)鈣結(jié)合蛋白基因、或一個(gè)膠質(zhì)結(jié)合蛋白基因。本發(fā)明還提供了一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體，它們包括一個(gè)從以下組中選出的外源性酶基因一個(gè)參與代謝生化廢物用于生物修復(fù)的酶編碼基因、一個(gè)改性途徑生產(chǎn)次生植物代謝物的酶編碼基因、一個(gè)生產(chǎn)一種藥物的酶編碼基因、一個(gè)改善植物營(yíng)養(yǎng)成變化的酶編碼基因、一個(gè)參與維生素合成的酶編碼基因、一個(gè)參與碳水化合物、多糖或淀粉合成的酶編碼基因、一個(gè)參與礦物質(zhì)積累或可用性的酶編碼基因、一個(gè)肌醇六磷酸酶編碼基因、一個(gè)參與脂肪酸、脂肪或油分合成的酶編碼基因、一個(gè)參與化學(xué)品或塑料合成的酶編碼基因、一個(gè)參與燃料合成的酶編碼基因、一個(gè)參與芬芳合成的酶編碼基因、一個(gè)參與香料合成的酶編碼基因、一個(gè)參與顏料或染料合成的酶編碼基因、一個(gè)參與碳?xì)浠衔锖铣傻拿妇幋a基因、一個(gè)參與結(jié)構(gòu)或纖維復(fù)合合成的酶編碼基因、一個(gè)參與一種食品添加劑合成的酶編碼基因、一個(gè)參與一種化學(xué)殺蟲劑合成的酶編碼基因、一個(gè)參與驅(qū)蚊劑合成的酶編碼基因、或一個(gè)控制植物碳通量的基因。本發(fā)明的另一實(shí)施案例中，本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或者重組染色體都包括了一個(gè)端粒。本發(fā)明中也提供了所有甘蔗微型染色體或者重組染色體都呈線狀或環(huán)狀的實(shí)施案例。一個(gè)實(shí)施案例中，本發(fā)明提供的甘蔗植株或者植物細(xì)胞中包括了本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或重組染色體。本發(fā)明也提供了利用本發(fā)明長(zhǎng)成的甘蔗植株組織和甘蔗種子。另一實(shí)施案例中，本發(fā)明提供的甘蔗植株中包含本發(fā)明提供的所有甘蔗微型染色體或者重組染色體，這里稱之為“近染色體”甘蔗植株。此外，本發(fā)明提供了從這些轉(zhuǎn)基因植株中提取的甘蔗植物細(xì)胞、組織和種子。一個(gè)實(shí)施案例中，本發(fā)明提供了一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，它包含了本發(fā)明中的所有甘蔗微型染色體或者重組染色體。這些細(xì)胞滿足(1)并未被融入到甘蔗植物細(xì)胞中；(2)賦予甘蔗植物細(xì)胞改變表型的特性，甘蔗植物細(xì)胞與它與甘蔗微型染色體內(nèi)至少一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)相關(guān)。改變表型包括增加原生基因的表達(dá)、減少原生基因的表達(dá)或外源基因的表達(dá)。另一實(shí)施案例中，這些甘蔗植物細(xì)胞也包括一個(gè)或者多個(gè)組合外源結(jié)構(gòu)基因。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是本發(fā)明中任一甘蔗植株實(shí)施案例的一部分。本發(fā)明中的具代表性的甘蔗植株部分包括一莢、根、種根、苗根、原基根、苗、初生苗、次生莖、吊穗、穗、 箭狀物、中脈、葉片、葉舌、外耳、贅肉、葉片聯(lián)合、鞘、節(jié)點(diǎn)、節(jié)間、芽睦、葉痕、切害I]、塊莖、干、 主莖、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、花、葉、莖皮、木質(zhì)部、表皮、輸導(dǎo)組織、器官、原生質(zhì)體、冠、愈傷組織培養(yǎng)、葉柄、花瓣、萼片、雄蕊、柱頭、中柱、花蕾、分生組織、形成層、皮層、木髓、鞘、絲光包裹體、胚珠或胚胎。其他具代表性的甘蔗植株部分包括一性母細(xì)胞、或配子、或胚珠、或花粉、 或此處描述的任何植物的內(nèi)胚乳。其他具代表性的植物部分包括一粒種子、一個(gè)種子件、胚胎、原生質(zhì)體、細(xì)胞群，任一植物細(xì)胞組合都能構(gòu)成本發(fā)明中任一甘蔗植株的結(jié)構(gòu)和功能單位、再生芽或繁殖體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施案例是本發(fā)明中所有甘蔗植株實(shí)施案例的子代。本發(fā)明的這些子代可能是自我繁殖、雜交育種、無(wú)融合生殖或克隆繁殖的結(jié)果。在具代表性的實(shí)施案例中，本發(fā)明還提供了子代，子代包括一個(gè)甘蔗微型染色體或者一個(gè)重組染色體，而這兩個(gè)染色體則源自于包含著絲粒的父本甘蔗微型染色體或者重組染色體，該染色體的長(zhǎng)度分別小于約 10001Λ、750kb、600kb、500kb、400kb、300kb、250kb、200kb、150kb、IOOkb、90kb、851Λ、 80kb、75kb、70kb、65kb、60kb、55kb、50kb、45kb、40kb、35kb、30kb、25kb、20kb、15kb、12kb、 10kb、7kb、5kb、或者 2kb。另一方面，本發(fā)明提出了提取一個(gè)微型甘蔗染色體的方法，該染色體可用于本發(fā)明中的所有甘蔗植株。在具代表性的實(shí)例中，這些方法包括用各種不同的探針確定一個(gè)甘蔗基因組DNA庫(kù)中一個(gè)著絲粒的核酸序列、構(gòu)建一個(gè)含有絲粒核苷酸序列的甘蔗微型染色體，還可能包括使用多種不同的探針在甘蔗基因組核酸庫(kù)中確定基因組克隆多重雜交的雜交分?jǐn)?shù)、根據(jù)至少兩種不同探針得出的雜交評(píng)分確定甘蔗基因組核酸庫(kù)的基因組克隆的分類、以及在構(gòu)建甘蔗微型染色體的一個(gè)或多個(gè)分類中選擇一個(gè)或多個(gè)基因組克隆。本發(fā)明還建立一個(gè)用本發(fā)明中的任一甘蔗植株生產(chǎn)一種重組蛋白的模板方法。實(shí)現(xiàn)這一方法要通過(guò)種植一種含有一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體的甘蔗植株，它們都含有可對(duì)所需的重組蛋白進(jìn)行編碼的外源性核酸。人們可以有選擇性地采集甘蔗植株，并從該植株中分離出所需的蛋白產(chǎn)物。具代表性的蛋白產(chǎn)物包括工業(yè)用酶，例如用于生物燃料生產(chǎn)的工業(yè)用酶。本發(fā)明還創(chuàng)建了一種采用本發(fā)明中的任一甘蔗植株來(lái)制成一種化工產(chǎn)品的模板方法。這個(gè)方法的實(shí)現(xiàn)需要通過(guò)種植一種含有一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體的甘蔗植株。這兩種染色體中含有可對(duì)某種酶進(jìn)行編碼的外源性核酸，這種酶能參與化工產(chǎn)品合成。 人們可以有選擇地收割甘蔗植株并從中分離出所需的化工產(chǎn)品。具代表性的化工產(chǎn)品包括蔗糖、膠質(zhì)和可用于生物燃料生產(chǎn)的碳水化合物。另一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明中的任一含有一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體的甘蔗植株生產(chǎn)食品產(chǎn)品、醫(yī)藥產(chǎn)品或者化工產(chǎn)品的方法。這種方法是根據(jù)一種適當(dāng)?shù)耐庠葱院怂?，這種核酸存在于種植的甘蔗植株或植物細(xì)胞中。植株可將其產(chǎn)物分泌到生長(zhǎng)環(huán)境中，或植株本身就含有這種產(chǎn)物，在這種情況下，植株就可以進(jìn)行收割，并且提取出想要的產(chǎn)物。本發(fā)明還計(jì)劃創(chuàng)建一種采用本發(fā)明中的任一含有一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體的甘蔗植株生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因食品的方法。這種方法是通過(guò)比如種植一種含有能改變植物的營(yíng)養(yǎng)成分的外源性核酸的植株、收割或處理甘蔗植株實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還提供了構(gòu)建一個(gè)重復(fù)核苷酸序列合成并具有甘蔗著絲粒的功能的陣列的方法。這一方法包括如下步驟(a) PCR擴(kuò)增一個(gè)甘蔗隨體序列，(b)將PCR擴(kuò)增的隨體序列克隆入對(duì)應(yīng)克隆載體，(c)對(duì)克隆的隨體DNA進(jìn)行排序，(d)使用含有不對(duì)稱識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶，從克隆載體切除克隆的隨體序列，(e)將一個(gè)隨體序列綁定到另一個(gè)隨體序列序列上，形成一個(gè)合成陣列(f)將合成陣列綁定到甘蔗微型染色體骨干載體上。本發(fā)明還提供了一個(gè)隔離的甘蔗微型染色體，它包括一個(gè)按照本發(fā)明方法構(gòu)建的重復(fù)核苷酸序列合成陣列。甘蔗植物細(xì)胞和甘蔗植株均含有這種微型染色體。另一實(shí)施案例中，本發(fā)明還提供了一種將一個(gè)甘蔗細(xì)胞與一個(gè)甘蔗微型染色體接觸的方法，步驟如下(a)向一個(gè)甘蔗植株莖稈頂端區(qū)域的不成熟分異葉釋放微型染色體， 其中每個(gè)微型染色體包括一個(gè)選擇標(biāo)記基因，(b)選擇含有標(biāo)記基因的甘蔗細(xì)胞，其中含有標(biāo)記基因表明了微型染色體的轉(zhuǎn)化。本方法使用的是不成熟但完全分異的葉子，比如甘蔗莖稈的不成熟內(nèi)葉。在某一具代表性的實(shí)施案例中，可用含有甘蔗微型染色體的超細(xì)微粒子輻射不成熟葉的方法釋放微型染色體。本發(fā)明還提供了一種經(jīng)甘蔗微型染色體改造的甘蔗植株再生的方法，其步驟如下(a)獲取一個(gè)含有用本發(fā)明中的任一方法改造的甘蔗細(xì)胞的愈傷組織，(b)在聚乙烯吡咯烷酮濃度為-3%的介質(zhì)中將愈傷組織培育成經(jīng)甘蔗微型染色體改造的幼苗。另一實(shí)施案例中，愈傷組織的培育方法包括兩個(gè)步驟，先將細(xì)胞放入液體介質(zhì)培育一段時(shí)間，隨后放入固體培養(yǎng)基培育。某一具代表性的實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體含有一個(gè)生長(zhǎng)調(diào)控基因，比如生長(zhǎng)素生物合成或途徑感知基因。這種類型的基因可能包括iaaMCTrp單氧化酶)， iaaH(吲哚_3_乙酰胺水解酶)，以及ipt (AMP異戊烯基轉(zhuǎn)移酶)。當(dāng)這三種基因同時(shí)在微型染色體中表達(dá)的時(shí)候，IaaM將Trp轉(zhuǎn)化成吲哚_3_乙酰胺，IaaH將吲哚_3_乙酰胺轉(zhuǎn)化成植物生長(zhǎng)素，Ipt將AMP轉(zhuǎn)化成細(xì)胞分裂素。這三種基因的表達(dá)允許培養(yǎng)細(xì)胞在沒(méi)有外源性激素的情況下發(fā)育。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)包括兩個(gè)重復(fù)的核酸的甘蔗人工染色體。該核酸與 SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是植物細(xì)胞。該細(xì)胞包括一個(gè)包括兩個(gè)重復(fù)的核酸的甘蔗人工染色體。該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。該植物細(xì)胞可以成為一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施案例是一個(gè)包括兩個(gè)重復(fù)的核酸的甘蔗人工染色體。該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為 98%。其中，重復(fù)方向是從特定組中選出的，這些組包括從頭到尾、從尾到尾、從頭到頭。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%的。還有其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)甘蔗人工染色體。它包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為151Λ的核酸，而該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)植物細(xì)胞，它包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為151Λρ的核酸。該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。在其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。 另外一些實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。這些植物細(xì)胞可以成為一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)甘蔗人工染色體，它包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為^lcbp的核酸，該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。本發(fā)明的另一進(jìn)一步實(shí)施案例是一個(gè)植物細(xì)胞，它包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為151Λ的核酸，該核酸與SEQ ID NO :204相比較， 同源性至少為98%。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204至少具有95%的同源性。還有其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。植物細(xì)胞可以是一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)包括一個(gè)著絲粒的甘蔗人工染色體。改著絲粒包括兩個(gè)重復(fù)的核酸，而該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。本發(fā)明的另一更進(jìn)一步的實(shí)施案例是一個(gè)包括一個(gè)著絲粒的甘蔗人工染色體的植物細(xì)胞。其中著絲粒包括兩個(gè)重復(fù)的核酸，該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。植物細(xì)胞可以是一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞。本發(fā)明的另一進(jìn)一步實(shí)施案例是一個(gè)包括兩個(gè)重復(fù)的核酸的著絲粒的甘蔗人工染色體。該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%，其中重復(fù)方向從下列組中選出，包括從頭到尾、從尾到尾、從頭到頭。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO 204相比較，同源性至少為95%。另外一些實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為151Λρ的核酸的著絲粒的甘蔗人工染色體。該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為151Λ的核酸的著絲粒的植物細(xì)胞，它，該核酸與SEQ ID NO 204相比較，同源性至少為98%。植物細(xì)胞可以是一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。另一些的實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)孤立核酸，它與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)植物細(xì)胞，它包括一個(gè)孤立核酸，核酸與SEQ ID NO 204相比較，同源性至少為98%。植物細(xì)胞可以是一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。另外的實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO: 204相比較，同源性至少為99%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)孤立核酸，它包括至少兩個(gè)重復(fù)的核酸，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。本發(fā)明的另一實(shí)施案例是一個(gè)植物細(xì)胞，它包括一個(gè)孤立的核酸，核酸包括至少兩個(gè)重復(fù)的核酸，它與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為 98%。植物細(xì)胞可以是一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞。某一進(jìn)一步的實(shí)施案例是一個(gè)孤立核酸，它包括至少兩個(gè)重復(fù)的核酸，該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%，其中，重復(fù)方向是從特定組中選出的，這些組包括從頭到尾、從尾到尾、從頭到頭。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。另外的實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO: 204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施案例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞方法，它包括制備一個(gè)包括至少兩個(gè)副本的核酸的步驟，該核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。使用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。制備一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，其中的核酸在甘蔗植物細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。另一些實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施案例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞的方法， 它包括獲取一個(gè)核酸的步驟，而核酸包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為151Λρ的核酸，它與SEQ ID NO 204相比較，同源性至少為98%。使用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。獲取一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，其中，核酸在甘蔗植物細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。在其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。另一些實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。
另一實(shí)施案例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞方法，它包括制備一個(gè)核酸的步驟，這個(gè)核酸包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為^lcbp的核酸，它與SEQ ID NO: 204相比較，同源性至少為98%。使用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。獲取一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，其中的核酸在甘蔗植物細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。在其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。另一些實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施案例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞方法，它包括獲取一個(gè)核酸的步驟，這個(gè)核酸包括至少兩個(gè)重復(fù)的核酸，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。使用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。獲取一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，其中，核酸在甘蔗植物細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。還有其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施案例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞方法， 它包括獲取一個(gè)核酸的步驟，這個(gè)核酸中包括一個(gè)著絲粒，著絲粒又包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為 151Λ的核酸。它與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。使用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造，并制備一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，其中，核酸在甘蔗植物細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。其他實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。另一些實(shí)施案例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞的方法，它包括獲取一個(gè)核酸的步驟，這個(gè)核酸包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為^lAp核酸的著絲粒，這個(gè)核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。采用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。制備一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，其中的核酸在甘蔗植物細(xì)細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。在其他實(shí)施例中， 核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。還有其他實(shí)施例中，核酸與SEQ ID NO: 204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞的方法，它包括如何獲取一個(gè)至少包括兩個(gè)重復(fù)核酸的核酸的步驟，這種重復(fù)核酸與SEQ ID NO 204 相比較，同源性至少為98%。使用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。制備一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞， 其中，核酸在甘蔗植物細(xì)細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。其他實(shí)施例中，核酸與SEQ ID NO 204 相比較，同源性至少為95%。還有其他實(shí)施例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞的方法，它包括獲取一個(gè)長(zhǎng)度至少為151Λρ的核酸的步驟，這種核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。使用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。獲取一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞，其中，核酸在甘蔗植物細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。其他實(shí)施例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為95%。還有其他實(shí)施例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。另一實(shí)施例是一種將一個(gè)自主復(fù)制核酸穩(wěn)定結(jié)合到一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞的方法，它包括制備一個(gè)核酸的步驟，核酸包括一個(gè)長(zhǎng)度至少為^lAp的核酸，它與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為98%。采用核酸對(duì)甘蔗植物細(xì)胞進(jìn)行改造。獲取一個(gè)甘蔗植物細(xì)胞， 其中，核酸在甘蔗植物細(xì)細(xì)胞分裂時(shí)是自主復(fù)制的。其他實(shí)施例中，核酸與SEQ ID NO 204相比較，同源性至少為95%。還有其他實(shí)施例中，核酸與SEQ ID NO :204相比較，同源性至少為99%。本發(fā)明的序列說(shuō)明下面是序列表中SEQ ID NOs的編號(hào)清單SEQ ID NOS 1-201-甘蔗衛(wèi)星序列SEQ ID NO :202-共有甘蔗衛(wèi)星序列SEQ ID NO :203-甘蔗 CRS 序列SEQ ID NOS :204-甘蔗衛(wèi)星重復(fù)序列塊SEQ ID NOS :205-221-引物序列SEQ ID NOS :222-241-啟動(dòng)子序列SEQ ID NOS :242-251-引物本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容本發(fā)明中包括各種形式的實(shí)施例，此處將對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)、具體地解釋，因此可以將本說(shuō)明理解為對(duì)本發(fā)明原則的例證過(guò)程，但不受具體實(shí)施例的局限。本發(fā)明提供了新穎的、實(shí)用的、穩(wěn)定的、自主的甘蔗微型染色體和重組染色體，這兩種染色體中都包括著絲粒，著絲粒又包括甘蔗重復(fù)序列例如合成序列，它可以是“孤立” 甘蔗微型染色體或者重組染色體。本發(fā)明還提供了“加強(qiáng)染色體”甘蔗植株，將在本說(shuō)明中進(jìn)一步詳細(xì)闡述。一方面，本發(fā)明是針對(duì)甘蔗植株，這種甘蔗植株包括實(shí)用的、穩(wěn)定的、自主的甘蔗微型染色體或重組染色體，染色體可選擇性地?cái)y帶一個(gè)或多個(gè)外源性核酸、或攜帶已存在于甘蔗基因組中的核苷酸的額外副本。與這種攜帶甘蔗微型染色體或重組染色體的植株相比，轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)將外源性核酸轉(zhuǎn)基因融合到原生甘蔗染色體中來(lái)改變基因組。在具代表性的實(shí)例中，外源性核酸的表達(dá)會(huì)改變植株表現(xiàn)型，無(wú)論是出于本質(zhì)、還是信號(hào)響應(yīng)(可能是受刺激或者應(yīng)激誘導(dǎo)的)、組織特異性表達(dá)、以及時(shí)間特異性表達(dá)。本發(fā)明準(zhǔn)備的甘蔗微型染色體或重組染色體至少包括1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6 個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、 21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)、 100個(gè)、110個(gè)、120個(gè)、130個(gè)、140個(gè)、150個(gè)、250個(gè)、500個(gè)、1000個(gè)或更多外源性核酸。本發(fā)明考慮到甘蔗植株可能會(huì)用于攜帶本發(fā)明中的自主甘蔗微型染色體或重組染色體。一方面，本發(fā)明是關(guān)于甘蔗植株部分或者植株組織的，包括一莢、根、種根、苗根、原基根、苗、初生苗、次生莖、吊穗、穗、箭狀物、中脈、葉片、葉舌、外耳、贅肉、葉片聯(lián)合、鞘、節(jié)點(diǎn)、節(jié)間、芽畦、葉痕、切割、塊莖、干、主莖、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、花、葉、莖皮、木質(zhì)部、表皮、輸導(dǎo)組織、器官、原生質(zhì)體、冠、愈傷組織培養(yǎng)、葉柄、花瓣、萼片、雄蕊、柱頭、中柱、花蕾、分生組織、形成層、皮層、木髓、鞘、絲光包裹體、胚珠或胚胎。其他具代表性的甘蔗植株機(jī)體結(jié)構(gòu)包括本發(fā)明中任一植物的性母細(xì)胞、或配子、或胚珠、或花粉、或內(nèi)胚乳。其他具代表性的植物機(jī)體結(jié)構(gòu)包括種子、種子件、胚胎、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物、及各種植株細(xì)胞組，這些細(xì)胞組構(gòu)成了本發(fā)明中的所有甘蔗植株的結(jié)構(gòu)和功能單位、再生芽或繁殖體。一個(gè)實(shí)施例中，外源性核酸主要存在于甘蔗植株的某一特定位置或組織中，如莖稈、表皮、輸導(dǎo)組織、分生組織、形成層、皮層，木髓，葉，鞘，花，根或種子。組織特性表達(dá)可以表現(xiàn)在以下幾方面，例如將甘蔗微型染色體或重組染色體進(jìn)行定位、對(duì)甘蔗微型染色體或重組染色體的選擇性保護(hù)、或含有推動(dòng)組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子。另一方面，本發(fā)明關(guān)于甘蔗性母細(xì)胞、花粉、胚珠、胚乳、種子、體細(xì)胞胚、內(nèi)胚胎、 來(lái)自受精作用的胚胎、無(wú)性繁殖體和原“加強(qiáng)染色體”植株的的子代及其保留的實(shí)用、穩(wěn)定、 自主的甘蔗微型染色體或重組染色體的子代，這些子代包括克隆繁殖的甘蔗植株、胚胎和植株部分以及來(lái)自自我和雜交育種、單性結(jié)實(shí)的子代。在具代表性實(shí)例中，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，甘蔗微型染色體或者重組染色體遺傳給下一代存活的子細(xì)胞，傳輸效率至少為60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、或者 99%。在本發(fā)明的實(shí)例中，在減數(shù)分裂過(guò)程中，當(dāng)目前的植物配子母細(xì)胞中存在一個(gè)以上的甘蔗微型染色體或重組染色體的副本時(shí)，甘蔗微型染色體或重組染色體將被傳輸給存活的配子，傳導(dǎo)效率至少為60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或者 99%。減數(shù)分裂過(guò)程中，當(dāng)目前的甘蔗植株植物配子母細(xì)胞中存在一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體的副本時(shí)，甘蔗微型染色體或重組染色體有選擇地被傳輸給存活的配子，傳輸效率至少為1%、10%、20%、30%、40%、45%、46%、47%、48%、或者49%。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)有性繁殖、單性結(jié)實(shí)產(chǎn)生種子，當(dāng)植物細(xì)胞中存在一個(gè)或多個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體的副本時(shí)，甘蔗微型染色體或重組染色體以至少60%、70%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、或者99%的速率傳輸?shù)酱婊畹呐咛ァＳ捎诜N子繁殖通過(guò)甘蔗植株的有性繁殖或單性結(jié)實(shí)實(shí)現(xiàn)，這種甘蔗植株含有一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體， 因此甘蔗微型染色體或重組染色體是選擇性地傳輸?shù)酱婊畹呐咛?，傳輸速度不低?%、 10%、20%、30%、40%、45%、46%、47%、48%、或 49%。本發(fā)明具代表性的實(shí)施例中，一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體中包含一種外源性可選特征或外源性可選標(biāo)記特性，這個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體可用于提高含有甘蔗微型染色體或重組染色體的加強(qiáng)染色體細(xì)胞、組織、配子、胚胎、內(nèi)胚乳、種子、植株或子代的繁殖頻率。特殊實(shí)施例中，有絲分裂或者減數(shù)分裂后，甘蔗微型染色體或重組染色體被傳輸?shù)酱婊畹募?xì)胞、組織、子、胚胎、內(nèi)胚乳、種子、植株或后代中，頻率至少為95%、96%、 97%、98%、99%或者99. 5%。有絲分裂是通過(guò)至少一個(gè)選項(xiàng)，選項(xiàng)有利于不含微型染色體或重組染色體的加強(qiáng)染色體細(xì)胞、組織、配子、胚胎、胚乳、種子、植株或這種細(xì)胞、組織、配子、胚胎、胚乳、種子、植株的子代。傳輸效率是攜帶甘蔗微型染色體或重組染色體的甘蔗子代細(xì)胞或甘蔗植株所占的百分比。這個(gè)結(jié)果可通過(guò)本文中提到的多種試驗(yàn)方法的一種來(lái)計(jì)算，其中包括熒光報(bào)告基因的檢測(cè)、采用PCR檢測(cè)法檢測(cè)一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體所攜帶的序列、采用 RT-PCR檢測(cè)法檢測(cè)一個(gè)攜帶甘蔗微型染色體或重組染色體的基因轉(zhuǎn)錄、使用西方分析法分析一個(gè)由攜帶甘蔗微型染色體或重組染色體的基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，使用南方分析法對(duì)蔗微型染色體或重組染色體攜帶的DNA (全部或者部分)進(jìn)行分析，抑制子結(jié)合進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)或原位定位。任何用于檢測(cè)甘蔗微型染色體(或微型染色體的一部分)或者重組染色體的分析方法都可用于測(cè)量一個(gè)親代細(xì)胞或植株向子代傳輸微型染色體或者重組染色體的效率。通過(guò)一些基準(zhǔn)百分比計(jì)算出的高效傳輸，應(yīng)通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂循環(huán)來(lái)說(shuō)明甘蔗微型染色體或重組染色體在何種程度上、向哪種子代細(xì)胞傳輸是穩(wěn)定的。
除自主甘蔗微型染色體或者重組染色體之外，本發(fā)明中的甘蔗植株也可能包括染色體整合的外源性核酸。改性甘蔗植株或者植株部分包括本發(fā)明中含有部分微型染色體組合的甘蔗植株(如外源性核酸或著絲粒序列)或部分或全部含重組染色體的細(xì)胞所在的甘蔗植株。一方面，本發(fā)明通過(guò)將改性甘蔗植株雜交，外源核苷酸組合將自主甘蔗微型染色體或者重組染色體進(jìn)行隔離。甘蔗植株包括外源性核酸和甘蔗植株的組合，它能產(chǎn)生一些不含組合外源性核酸的配子，隨后隔離雜交后代，否則后續(xù)的雜交后代會(huì)被改性，但不含組合外源性核酸。這種將甘蔗微型染色體或重組染色體獨(dú)立隔離一種檢測(cè)微型染色體獨(dú)立性的方式。另一方面，本發(fā)明是關(guān)于生產(chǎn)和選擇性孤立這種含有有效的、穩(wěn)定的、自主的甘蔗微型染色體的改性甘蔗植株的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明考慮改進(jìn)孤立原生甘蔗著絲粒序列的方法。另一實(shí)施例中，本發(fā)明考慮通過(guò)細(xì)菌母體或者真菌母體來(lái)產(chǎn)生原生或人工甘蔗著絲粒序列變種的方法。某一進(jìn)一步實(shí)施例中，本發(fā)明還考慮了以下幾種方法將甘蔗微型染色體輸送到甘蔗植株細(xì)胞或組織中，從而改變細(xì)胞或組織，然后選擇性地檢測(cè)微型染色體的狀態(tài)或評(píng)估微型染色體的表型，最后根據(jù)這種細(xì)胞或組織選擇性地種植甘蔗植株。對(duì)甘蔗微型染色體或重組染色體機(jī)能進(jìn)行的分析和評(píng)估包括基于譜系的繼承檢測(cè)、使用染色體丟失劑展示自主性、核酸外切酶消化、使用或不使用染色體丟失劑進(jìn)行全局有絲分裂微型染色體遺傳分析(扇形掃描分析)、檢測(cè)甘蔗微型染色體所攜帶的基因顯性水平在甘蔗植株內(nèi)時(shí)空變化(包括標(biāo)記基因)的方法、從甘蔗植株內(nèi)源性核染色體中分離出自主甘蔗微型染色體或重組染色體的物理實(shí)驗(yàn)、證明保存的甘蔗微型染色體結(jié)構(gòu)或者重組染色體的分子檢測(cè)(如PCR、DNA印跡、甘蔗微型染色體保護(hù)、甘蔗植株中的甘蔗微型染色體序列的克隆和特征描述)、甘蔗細(xì)胞基因組(比如FISH)中的甘蔗微型染色體或重組染色體的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、減數(shù)分裂中甘蔗微型染色體或重組染色體遺傳檢測(cè)，通過(guò)有絲分裂和配子、胚胎、胚乳或種子測(cè)量在甘蔗植株中微型染色體或重組染色體在直系后代中的遺傳程度。另一方面，本發(fā)明是關(guān)于用含有一個(gè)甘蔗微型染色體或重組染色體的甘蔗植株生產(chǎn)食品、醫(yī)藥產(chǎn)品、生物燃料和化工產(chǎn)品的方法，這種方法是通過(guò)甘蔗微型染色體或重組染色體中的外源性核酸的恰當(dāng)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。然而，另一方面，本發(fā)明提供了新穎、自主的具有新型的成分和結(jié)構(gòu)的甘蔗微型染色體，可用于植物細(xì)胞的改造，同時(shí)可用于生產(chǎn)一棵植株(或者多棵植株)。本發(fā)明中考慮的具代表性的甘蔗微型染色體尺寸為20001Λ或長(zhǎng)度小于20001Λ。甘蔗微型染色體的其他具代表性尺寸，長(zhǎng)度上應(yīng)不大于 1500kb、IOOOkb、900kb、800kb、700kb、600kb、500kb、450kb、 400kb、350kb、300kb、250kb、200kb、150kb、IOOkb、80kb、60kb、40kb、；35kb。某一具代表性的實(shí)施例中，微型染色體長(zhǎng)度大約為觀吐、長(zhǎng)度大約為421Λ、長(zhǎng)度大約為821Λ、長(zhǎng)度大約為 871Λ、長(zhǎng)度大約為881Λ、長(zhǎng)度大約為971Λ、長(zhǎng)度大約為1301Λ、長(zhǎng)度大約為1501Λ、長(zhǎng)度大約為2001Λ或長(zhǎng)度從^lib到2001Λ。某一相關(guān)方面，新甘蔗著絲粒組成部分的特征是通過(guò)序列含量、大小或其他參數(shù)表現(xiàn)的。可選擇地，將最小著絲粒序列用于構(gòu)建微型染色體。具代表性的大小包括一個(gè)甘蔗著絲粒核酸段，它根據(jù)一個(gè)甘蔗微型重復(fù)序列取自于甘蔗部分基因組DNA或組合基因組 DNA，甘蔗微型重復(fù)序列不大于 10001Λ、900kb、800kb、700kb、600kb、500kb、400kb、300kb、 200kb、190kb、150kb、100kb、95kb、90kb、85kb、80kb、75kb、70kb、65kb、60kb、55kb、50kb、 45kb、40kb、35kb、30kb、28kb、25kb、20kb、17kb、15kb、12kb、1 Okb、7kb、6. 4kb、5kb、或者 2kb。 具代表性的插入物尺寸范圍包括從80kb到100kb、7kb到190kb、7kb到12kb、5kb到10kb、 3kb 到 IOkb、3kb 到 7kb、5kb 到 7kb、10 到 30kb、15 到 30kb、以及 15 到 28kb。另一個(gè)相關(guān)方面是甘蔗微型染色體的新結(jié)構(gòu)，特別是不含細(xì)菌序列(比如，需要細(xì)菌傳播的序列)的結(jié)構(gòu)，稱為無(wú)骨干甘蔗微型染色體。其他具代表性的實(shí)施例中，本發(fā)明認(rèn)為含著絲粒核酸序列的甘蔗微型染色體或其他載體，當(dāng)它與文中實(shí)例所述的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)或更多探針進(jìn)行雜交，在所述的雜交環(huán)境下(比如非嚴(yán)格雜交、中等雜交、嚴(yán)格雜交)，可以得出相對(duì)的雜交分?jǐn)?shù)。具代表性的嚴(yán)格雜交環(huán)境包括65°C恒溫，然后用65°C的0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，每次15分鐘。其他的具代表性的嚴(yán)格雜交環(huán)境包括50°C左右到70°C的0. 02M到0. 15M 的NaCl中進(jìn)行雜交、或在65 °C的0. SSC 0. 25% SDS中進(jìn)行15分鐘，然后65 °C的溫度下清洗半小時(shí)，或者65°C恒溫條件下培植14個(gè)小時(shí)，然后用65°C的0. 5x SSC, 1 % SDS清洗三次。用目測(cè)的方式對(duì)探針雜交進(jìn)行評(píng)分，直觀地確定一個(gè)二進(jìn)制值(正面與負(fù)面)，或根據(jù) 10點(diǎn)規(guī)模的相對(duì)雜交強(qiáng)度為探針?lè)峙湟粋€(gè)評(píng)分。舉例來(lái)說(shuō)，相對(duì)雜交評(píng)分5可用于選擇克隆，對(duì)探針雜交來(lái)說(shuō)，這個(gè)評(píng)分也為良好。另外，雜交信號(hào)大于一個(gè)或多個(gè)探針?biāo)幍谋尘埃?可用于選擇克隆。本發(fā)明還考慮到含有這種甘蔗微型染色體的改性染色體或廣告染色體的甘蔗植株或者植株部位。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括準(zhǔn)備了一個(gè)自主、獨(dú)立的遺傳連鎖群來(lái)加速甘蔗繁殖、不含母體甘蔗基因組中斷、較大基因和無(wú)限基因的多基因“堆?！薄⒅参锛?xì)胞和含有自主甘蔗微型染色體的植株中外源DNA序列的普遍遺傳組成、確定可預(yù)測(cè)基因顯性的基因環(huán)境、以及(由于淘汰了無(wú)效整合步驟)含有保持穩(wěn)定的外源性DNA的甘蔗植株細(xì)胞和植株的出現(xiàn)和恢復(fù)的頻率較高。此外，本發(fā)明明確提出甘蔗微型染色體可以增加總的蔗糖回收量或加強(qiáng)改性甘蔗植株在生物燃料聲場(chǎng)中的作用。I.微型染色體的組成及微型染色體的構(gòu)造本發(fā)明中的甘蔗微型染色體載體可能包括各種各樣的元素，如(1)起甘蔗著絲粒作用的序列；( 一個(gè)或多個(gè)外源性核酸，比如包括植物表達(dá)基因或非編碼RNA基因；(3) 起到復(fù)制源作用的序列，它可能在起植物著絲粒作用的區(qū)域內(nèi)；(4)或者起到細(xì)菌中質(zhì)粒增殖作用的細(xì)菌質(zhì)粒骨干；(5)或者起到植物端粒作用的序列；(6)或者額外的“填充片段 DNA”，它起到從甘蔗微型染色體中物理隔離各種元素的作用；(7)或者“緩沖”序列，如核基質(zhì)附著區(qū)(MARs)或染色體支架結(jié)合區(qū)(SARs) ； (8)或者非必須標(biāo)記序列包括但不限于植物和細(xì)菌的起源標(biāo)記序列；(9)或者作為復(fù)合位置的序列；以及(10)或者作為“染色質(zhì)包裝序列”，如內(nèi)聚和凝聚結(jié)合部位。本發(fā)明中，甘蔗微型染色體的構(gòu)造可能含有各種新成分，新成分中包括但不限于含有新重復(fù)著絲粒序列的甘蔗著絲粒，下文將做詳細(xì)闡述。新著絲粒的成分在本發(fā)明中，微型染色體包括含有新穎重復(fù)甘蔗著絲粒序列的著絲粒。
本發(fā)明還考慮了下列例子中所描述的所有具代表性的載體中包括的多種元素，數(shù)量為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20、或更多。本發(fā)明特別考慮了文中描述的能充分保持活力的核酸片段或變種(突異變種)的選擇使用，包括起到甘蔗著絲粒作用的核酸、起啟動(dòng)子或其他調(diào)控序列作用的核酸、或外源性核酸。在原始核苷酸序列或共有序列中，變種可能會(huì)增加、替換或者刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸。與原始核酸序列相比，變種包含的核酸序列同源性至少為50^^55^^60,65,70,75,80, 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或 100%。變種還含有核酸序列，能在低溫、中等溫度、高溫或超高溫條件下與原始核酸序列雜交。類似地，本發(fā)明還考慮替代文中描述的任一多肽片段、或變種?？梢杂脭?shù)學(xué)算法對(duì)序列進(jìn)行比較，并確定兩個(gè)核苷酸序列的同源性百分比。比如確定兩個(gè)核苷酸序列的同源性百分比可以用已被納入GCG軟件包(網(wǎng)址 廁.gcg. com)的 GAP 程序中的 Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :444-453 算法，這個(gè)算法寫入 GAP程序是通過(guò)Blossom 62矩陣或PAM250矩陣實(shí)現(xiàn)的。參數(shù)可以進(jìn)行設(shè)置，這樣就可以使同源性百分比最大化。文中所使用的“不嚴(yán)格、中等、嚴(yán)格環(huán)境雜交”指的是雜交和清洗環(huán)境。雜交反應(yīng)表現(xiàn)可以從《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(參見(jiàn)Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons,N. Y.，6. 3. 1-6. 3.6，)中找到，此處引用作為參考。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中介紹了溶于水和不溶于水的方法，并且兩種方法都可行。這里特殊雜交環(huán)境是指1)非嚴(yán)格雜交環(huán)境，在45°C的6x 氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)溶液中，隨后用至少50°C的0. 5x SSC, 0. SDS溶液清洗兩次；2) 中等強(qiáng)度雜交環(huán)境是指在45°C的6xSSC溶液中，隨后用至少55°C的0.切SSC, 0. 1%SDS溶液清洗一到兩次；幻嚴(yán)格的雜交環(huán)境指的是在65°C的溶液中培植12-18小時(shí)，隨后用65°C 的0. 25x SSC和0. SDS溶液清洗三次，每次時(shí)間為15-90分鐘。另外，具代表性的嚴(yán)格雜交環(huán)境包括大約45°C的6x SSC溶液，隨后用65°C的0. 2x SSC和0. 1 % SDS溶液清洗一到兩次。其他具代表性的高度選擇性或嚴(yán)格雜交環(huán)境包括用50°C -70°C的0. 02M-0. 15M NaCl 溶液或者65ο的0. 5x SSC 0. 25% SDS溶液培植12-15小時(shí)，隨后用65°C的溶液清洗三次， 每次15-90分鐘。甘蔗微型染色體序列含量和結(jié)構(gòu)為了適應(yīng)甘蔗密碼子的需求、在靠近轉(zhuǎn)錄起始ATG密碼子附近插入優(yōu)選的模體、 從5’或者3’剪接位點(diǎn)移除植物中已識(shí)別的序列、或更好的反映植物GC/AT的含量，非植物源的甘蔗表達(dá)基因則可能會(huì)被修改。通常，植物基因中的GC含量大于35%，對(duì)富含A和T 核苷酸序列的編碼可能會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，如ATTTA模體可能會(huì)使mRNA失穩(wěn)，植物多聚腺苷酸化信號(hào)，比如在信息內(nèi)不恰當(dāng)位置的AATAAA可能會(huì)造成轉(zhuǎn)錄的過(guò)早截?cái)?；以及單子葉植物比如甘蔗可能會(huì)把富含AT的序列識(shí)別為剪接位點(diǎn)。每個(gè)外源性核酸或甘蔗表達(dá)基因可能包括一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)編碼區(qū)域及一個(gè)終止序列，它們都有可能在限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、或重組位點(diǎn)、或以上兩個(gè)位點(diǎn)上相互分離。基因也可能會(huì)包括內(nèi)含子，它可能會(huì)在基因轉(zhuǎn)錄部位以任一數(shù)目出現(xiàn)在任何位置上，包括5’非轉(zhuǎn)錄序列、編碼區(qū)域以及3’非轉(zhuǎn)錄序列。內(nèi)含子可能是任何植物中都包含的天然植物內(nèi)含子、或根據(jù)植物物種定義的剪接位點(diǎn)一致的人工內(nèi)含子。另外，有的內(nèi)含子序列在植株中還表現(xiàn)出表現(xiàn)增強(qiáng)的態(tài)勢(shì)?；蛘撸庠葱院怂峥赡馨ㄒ粋€(gè)植物轉(zhuǎn)錄終止符、可增強(qiáng)表達(dá)的病菌的非轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列、一個(gè)最小啟動(dòng)子、或一個(gè)控制向植物室或細(xì)胞器官輸送基因產(chǎn)物的信號(hào)序列?；虻木幋a區(qū)域可對(duì)任何蛋白編碼，包括但不限于可見(jiàn)標(biāo)記基因(如熒光蛋白基因、其他賦予植物可見(jiàn)表型的基因)、或者其他篩選標(biāo)記或選擇標(biāo)記基因(如對(duì)抗生素、除草劑或其他有毒化合物產(chǎn)生抵抗能力，或?qū)Φ鞍走M(jìn)行編碼，使含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì))、或者能使轉(zhuǎn)基因或加強(qiáng)染色體甘蔗植株具有商業(yè)或農(nóng)業(yè)價(jià)值的基因。同一甘蔗微型染色體載體中存在多個(gè)基因?；蚩赡軙?huì)從限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、歸巢核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)、重組位點(diǎn)或任一組合中被分離開(kāi)。另外，克隆工藝可以通過(guò)破壞干預(yù)限制位點(diǎn)的方式實(shí)現(xiàn)?；驍?shù)量不限。甘蔗衛(wèi)星染色載體可能包括一個(gè)用于細(xì)菌的細(xì)菌(如大腸桿菌、農(nóng)桿菌、或者發(fā)根質(zhì)粒繁殖)質(zhì)粒骨干。質(zhì)粒骨干可能是一個(gè)低副本載體，或者在其他實(shí)施案例中，更傾向于使用一個(gè)中高水平的副本骨干。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施案例中，這個(gè)骨干包括了大腸桿菌的 F’質(zhì)粒復(fù)制子。但也可能會(huì)用到其他質(zhì)粒復(fù)制子，如噬菌體Pl復(fù)制子、或者如PK2復(fù)制點(diǎn)的低副本質(zhì)粒系統(tǒng)。骨干可能包括一個(gè)或多個(gè)能使含有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞具有特殊抗生素耐藥性的基因。細(xì)菌抗生素耐藥性基因包括但不限于卡那霉素，氨芐青霉素，氯霉素，鏈霉素， 壯觀霉素，四環(huán)素和慶大霉素耐藥基因。甘蔗微型染色體載體還可能含有植物端粒。一個(gè)具代表性的端粒序列是TTTAGGG 或他的補(bǔ)體。端粒是線性染色體末端的特殊DNA結(jié)構(gòu)，起到穩(wěn)定末端和幫助DNA分子極端末端的完整復(fù)制的作用(Richards et al. , Cell, 1988Apr 8 ；53(1) :127-36 ；Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, 1997)。此外，甘蔗微型染色體載體可能包括“DNA填充序列”，這個(gè)序列的作用是將微型染色體(著絲粒、基因、端粒)中各種成分分離。DNA填充序列包括了任何來(lái)源，不管原核的還是真核狀態(tài)，或可以取自于任何基因組或物種、植物、動(dòng)物、微生物或細(xì)胞器官，或者也有可能是合成的。DNA填充序列的長(zhǎng)度范圍是IOObp到10Mb，可以在序列中重復(fù)存在，重復(fù)單元范圍從10到1，000，OOObp0 DNA填充序列的重復(fù)性序列包括但不限于rDNA、衛(wèi)星重復(fù)、逆轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)位子、假遺傳因子、轉(zhuǎn)錄基因、微衛(wèi)星、tDNA基因、短序列重復(fù)以及它們的組合。 另外，DNA填充序列包括來(lái)源或序列的獨(dú)特的、非重復(fù)的DNA。填充片段序列可能也包括能夠形成邊界領(lǐng)域的DNA，包括但不限于染色體支架結(jié)合區(qū)(SARs)或核基質(zhì)附著區(qū)(MARs)。 DNA填充序列可能是由隨機(jī)序列組成的完全合成物質(zhì)。這種情況下，DNA填充序列可能包括任何堿基組成、或任何A/T或G/C的含量。比如，DNA填充序列的G/C含量與植物類似( 30-40% )、或更低(0-30% )、或更高(40-100% )。另外，不同的合成填充序列包括任一給定的核苷酸，比如A、C、G或者T。各種不同成分的合成填充片段也可能互相結(jié)合。比如，一個(gè)G/C含量低的片段可能被一個(gè)中等或高G/C含量的片段側(cè)擊或鄰接，反之亦然。本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體包括一個(gè)沒(méi)有端粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。第二個(gè)實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體包括一個(gè)含有端粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。第三個(gè)實(shí)施案例中，甘蔗微型染色體包括一個(gè)含有端粒的線性結(jié)構(gòu)。比如切斷一個(gè)“線性”結(jié)構(gòu)與一個(gè)獨(dú)特的核酸內(nèi)切酶的聯(lián)系，端粒將移動(dòng)到原始封閉序列中的DNA分子的末端，具有抗生素耐藥性的基因除外。在本發(fā)明的第四個(gè)實(shí)施案例中，端粒以下列方式存在細(xì)菌復(fù)制子、骨干序列、耐抗生素基因以及任一細(xì)菌來(lái)源序列。目前為了在細(xì)菌中進(jìn)行甘蔗危險(xiǎn)染色體繁殖，可通過(guò)用特殊的核酸內(nèi)切酶切割構(gòu)造將端粒從植株顯性基因、著絲粒、端粒和其他序列中去除，這將會(huì)去除細(xì)菌中很多甚至全部的甘蔗染色體。在本實(shí)施案例中，植物顯性基因或其他甘蔗微型染色體序列之間(中)，在通過(guò)一個(gè)核酸內(nèi)切酶切割甘蔗微型染色體去除剩余細(xì)菌序列和構(gòu)造結(jié)扎之前，細(xì)菌序列排列將會(huì)被去除，這樣將導(dǎo)致耐抗生素基因的流失。特殊的核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)可能是任一核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列，包括但不限于限制性核酸內(nèi)切酶、兆堿基大范圍核酸酶或歸巢核酸內(nèi)切酶。另外，內(nèi)切酶和它們的位點(diǎn)可由任何特定的DNA進(jìn)行替換， 這種DNA切斷機(jī)制和它的特殊識(shí)別位點(diǎn)的聯(lián)系，如個(gè)別切割核酸內(nèi)切酶或重組酶及其相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)，只要是存在于甘蔗微型染色體中的位點(diǎn)只能在各自固定的位置上。由于甘蔗微型染色體的元素互為導(dǎo)向，因此各種結(jié)構(gòu)的配置都是有可能出現(xiàn)的。 一個(gè)甘蔗著絲粒出現(xiàn)在一個(gè)基因間的、或位于一個(gè)或另一個(gè)端粒周圍的基因組合外的甘蔗微型染色體。DNA填充序列可與這些構(gòu)造相組合，將填充片段序列植入端粒、或者沿基因之間的著絲粒四周、或這些端粒和著絲粒的組合。因此，可以出現(xiàn)很多種可替代甘蔗微型染色體結(jié)構(gòu)，這取決于著絲粒DNA、基因、填充片段DNA、細(xì)菌序列、端粒以及其他序列的相對(duì)位移。每一個(gè)這類變體的序列含量是相同的，但是它們的結(jié)構(gòu)卻可能存在差異，這取決于序列是如何排列的。對(duì)于線性或者環(huán)狀甘蔗微型染色體來(lái)說(shuō)，構(gòu)造變化都是有可能的。具代表性的著絲粒組分甘蔗著絲粒組分可能是從一種原生植物基因組中孤立出來(lái)的，又或者是取自于這個(gè)基因組，如通過(guò)重組技術(shù)修改或通過(guò)以細(xì)胞技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行改性，下面將對(duì)此詳細(xì)闡述。 另外，完全人工著絲粒組分可通過(guò)諸如原生衛(wèi)星重復(fù)序列方式構(gòu)建，它們是原生甘蔗絲粒的一般性引導(dǎo)序列。本發(fā)明還考慮到自然植株的著絲粒組分組合和/或自然植株組分與人工組分的組合。某一實(shí)施案例中，采用文中提出的方法獲取的甘蔗著絲粒包括η個(gè)重復(fù)核苷酸副本；其中η至少為2。另一實(shí)施案例中，甘蔗著絲粒包括η個(gè)交叉重復(fù)副本。一個(gè)交叉重復(fù)是指一個(gè)由兩種截然不同重復(fù)元素組成的DNA序列，同時(shí)它還具有獨(dú)特的排列組合。能存在于重組結(jié)構(gòu)中的任何數(shù)量的重復(fù)副本都包括在這個(gè)構(gòu)造之中，數(shù)目約為5、10、15、20、30、 50、75、100、150、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000、5000、7500、10000、20000、 30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000 和大約 100000、以及這樣的副本數(shù)之間的數(shù)目。此外，副本雖然大致相同，但是又各不相同。一般來(lái)講，這種重復(fù)變化可在著絲粒中觀測(cè)到。重復(fù)的長(zhǎng)度可能各不相同，長(zhǎng)度范圍可從約20bp到約360bp、從約20bp到約250bp、 從約 50bp 到約 225bp,/A 20bp 到 137bp、從約 75bp 到約 210bp、從約 IOObp 到約 2(^bp、從約125bp到約200bp、從約150bp到約l%bp、從約160bp到約190以及從約170bp到約 185bp包括約180bp。具代表性的重復(fù)包括但不限于一個(gè)92bp重復(fù)、一個(gè)97bp重復(fù)或者一個(gè)IOObp重復(fù)。在本發(fā)明中，可存在較大的重復(fù)數(shù)目，可達(dá)3465bp、或3500bp、或3600bp、或 3700bp。本發(fā)明認(rèn)為其中兩個(gè)以上這種甘蔗重復(fù)核苷酸序列或類似的甘蔗重復(fù)核苷酸序列可能在著絲粒內(nèi)頭尾相接?！邦^尾相接”是指相同或相似的重復(fù)核苷酸序列(比如，至少具有70%同源性)的多個(gè)連續(xù)重復(fù)副本，這些重復(fù)副本在相同的5’-3’方向。本發(fā)明還認(rèn)為兩個(gè)以上這種甘蔗重復(fù)核苷酸序列在著絲粒內(nèi)可能具有連續(xù)性。這里的“連續(xù)”是指相同和相似的沒(méi)有被其他顯著序列元素中斷的一個(gè)接一個(gè)的重復(fù)核苷酸序列(比如，至少具有70%的同源性)。這樣的連續(xù)重復(fù)核苷酸序列可發(fā)生在任何方向，比如頭尾相接、尾尾相接、 頭頭相接，也可能被η個(gè)核苷酸分隔開(kāi)，其中η范圍從1到10、或者1到20、或者1到30、或者1到40、或者1到50。通過(guò)此處描述的方法，將來(lái)自甘蔗的具代表性的重復(fù)核苷酸序列定義為 SEQ ID NOS 1-202，SEQ ID NO :204 和 CRS (SEQ ID NO :203)。
從原生植物基因組中分離的甘蔗著絲粒的修改
修改和變化通常發(fā)生在含有功能分子的甘蔗著絲粒DNA片段中，這些功能分子一般都具有理想的特性。本發(fā)明也對(duì)這種轉(zhuǎn)基因甘蔗著絲粒進(jìn)行了考慮。下面將就改變甘蔗著絲粒核酸進(jìn)行討論，著絲粒的改變是用來(lái)創(chuàng)造一個(gè)等效、甚至是改進(jìn)的第二代分子。
本發(fā)明的某一特殊實(shí)施案例中，考慮到突變甘蔗著絲粒序列可能會(huì)有助于提高甘蔗著絲粒的效用。本發(fā)明沒(méi)有受到任何理論的約束，而是特別考慮了甘蔗著絲粒的作用， 這可能部分或全部根據(jù)甘蔗著絲粒的DNA序列的次生結(jié)構(gòu)、通過(guò)甲基或者其他加合物修改 DNA、以及/或與甘蔗著絲粒起交互作用的蛋白質(zhì)。改變甘蔗著絲粒的DNA序列可能會(huì)改變甘蔗著絲粒的一個(gè)或多個(gè)著絲粒相關(guān)蛋白、以及/或次生結(jié)構(gòu)、或修改甘蔗著絲粒序列，從而改變甘蔗著絲粒的運(yùn)動(dòng)。另外，在本發(fā)明中，變化可能會(huì)發(fā)生甘蔗著絲粒中，這不會(huì)影響甘蔗著絲粒的活動(dòng)。本發(fā)明認(rèn)為甘蔗著絲粒變化一縮小需賦予甘蔗著絲粒運(yùn)動(dòng)特性的DNA 片段尺寸一非常有用，原因在于在有絲分裂或減數(shù)分裂過(guò)程中，這會(huì)增加甘蔗著絲粒傳輸?shù)木_度。
通過(guò)細(xì)菌、甘蔗或其他母體、或工藝修改甘蔗著絲粒
本發(fā)明所提到的方法中，甘蔗微型染色體DNA序列結(jié)果可能是親本克隆或者甘蔗著絲粒克隆的衍生物，它對(duì)核酸序列中的一個(gè)或者多個(gè)核苷酸做了代替、刪除、插入、復(fù)制和/或重新排列。該類核苷酸突變可能是單獨(dú)發(fā)生的，也可能是連續(xù)發(fā)生的，連續(xù)發(fā)生的時(shí)候約為 1、2、3、4、5、6、7、8、910、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、 200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、8000、10000、50000、 100000、以及大約200000，包括其間所有范圍。
甘蔗微型染色體的變異可能是通過(guò)各種各樣母體(比如病毒、細(xì)菌、酵母、或其他原核或真核生物)中的甘蔗微型染色體傳代實(shí)現(xiàn)，也可能通過(guò)多個(gè)或者一個(gè)單獨(dú)的母體傳代實(shí)現(xiàn)。通過(guò)體外復(fù)制甘蔗微型染色體也可能會(huì)發(fā)生突變。
衍生物可通過(guò)序列分析、或用電泳分離法計(jì)算甘蔗微型染色體分子的重量變化來(lái)確定，分子重量變化可用方法包括但不限于CHEF gel分析、柱分離或梯度分離、或該領(lǐng)域可用于確定和/或分析DNA分子重量或序列含量的任何方法。另外，還可以通過(guò)改變衍生物的活動(dòng)賦予一個(gè)甘蔗微型染色體以甘蔗著絲粒作用的方法來(lái)確定衍生物。
合成甘蔗著絲粒重復(fù)系列的產(chǎn)生或合成
本發(fā)明中，這些人工合成的重復(fù)核苷酸序列有多個(gè)來(lái)源，包括天然甘蔗著絲粒序列、原生甘蔗著絲粒序列的組合或片段，包括一種不同長(zhǎng)度重復(fù)的組合、一種不同序列的組合、一種不同重復(fù)長(zhǎng)度和不同序列的組合、一種不同人工合成序列的組合或者一種原生甘蔗著絲粒序列和人工合成序列的組合?？梢酝ㄟ^(guò)該領(lǐng)域的例如來(lái)自基因組DNA的PCR法的任何已知技術(shù)生產(chǎn)合成核苷酸序列和這些合成重復(fù)序列陣列，，如例1中描述的方法、或自定義多核苷酸的合成。
多核苷酸合成是使用自動(dòng)合成儀實(shí)現(xiàn)的指定核酸序列的非生物、化學(xué)合成。寡核苷酸可能是由化學(xué)合成、提純，然后這些寡核苷酸通過(guò)熱處理和標(biāo)準(zhǔn)連接或聚合酶反應(yīng)組合在一起。具代表性的連接方法包括磷酸化重疊寡核苷酸連接(Gupta et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA,60,1338-1344, Fuhrmann et al. Plant J. 1999 Aug; 19 (3) :353-61)、FokI 方法(Mandecki et al. Gene，68，101-107)和一種關(guān)于基因合成的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的修正形式。此外，也可能使用到PCR裝配方法，該方法中通常錄用的寡核苷酸長(zhǎng)度為40-50Π，且互相重疊。經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，這些寡核苷酸可以覆蓋大多數(shù)序列的子線，全長(zhǎng)分子是通過(guò)重疊延伸PCR(Stemmer et al. Gene，164，49-53)、熱力學(xué)平衡里外PCRO^ao et al. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 15 ；31 (22) :el43)、或者組合法(Young et al. Nucleic Acids Res. 2004 Apr 15 ；32 (7) :e59)逐步生嚴(yán)。
含植物表現(xiàn)基因在內(nèi)的具代表性的外源性核酸
本發(fā)明中，其中的一個(gè)重點(diǎn)就是外源性核酸，當(dāng)它進(jìn)入甘蔗植株后，它會(huì)改變植株、一個(gè)植株器官、植物組織或者植物的部分表型。具代表性的外源性核酸能對(duì)多肽編碼。 其他具代表性的外源性核酸改變外源性或內(nèi)源基因的表達(dá)，此外還可以提高或降低在面對(duì)一種特殊信號(hào)或刺激時(shí)的表現(xiàn)。
文中所使用的“性狀”這個(gè)詞一方面指目標(biāo)表型的改變，另一方面還指可造成目標(biāo)表型改變的核酸。
甘蔗改造的一大主要目的是為植株增強(qiáng)商業(yè)價(jià)值或農(nóng)作物性狀。這些性狀包括但不限于增加總可回收糖量的生產(chǎn)、用于生物燃料的生產(chǎn)、除草劑耐藥性或者耐受性、抗昆蟲 (蟲)或者耐受性、抗災(zāi)害或者耐受性(病毒，細(xì)菌，霉菌，線蟲或者其他病原生物)、提高抗性或者耐受性(如干旱、炎熱、寒冷、凍結(jié)、過(guò)度濕潤(rùn)、鹽分失調(diào)、機(jī)械應(yīng)力、極端酸性、強(qiáng)堿性、毒素、紫外線、致電離輻射或者氧化應(yīng)激等)、增加產(chǎn)量、增加生物質(zhì)的數(shù)量或者質(zhì)量、加強(qiáng)或者改變養(yǎng)分吸收以及加強(qiáng)或改變植株代謝效率、加強(qiáng)或者改變營(yíng)養(yǎng)成分和植物組織的組成，這些組織可用于食物、種子、纖維或者處理、物理性質(zhì)、雄性不育性、脫水、直立性、多產(chǎn)、淀粉數(shù)量和質(zhì)量、油分?jǐn)?shù)量和質(zhì)量、蛋白數(shù)量和質(zhì)量、氨基酸成分、改性化學(xué)物生產(chǎn)、改變制藥或者保健食品性質(zhì)、改變生物處理法性質(zhì)、增加生物質(zhì)、改變生長(zhǎng)速度、改變健康、改變生物降解能力、改變二氧化碳固定能力、生物學(xué)指標(biāo)活動(dòng)的存在、改變?nèi)祟惢蛘邉?dòng)物對(duì)它的消化性、改變變應(yīng)原性、改變配對(duì)特征、改變花粉擴(kuò)散、改善環(huán)境影響、改變固氮能力、生產(chǎn)一種配藥活躍蛋白、一種具藥物特性小分子的生產(chǎn)、一種具工業(yè)效用的化學(xué)品的生產(chǎn)、保健食品、食品添加劑、碳水化合物、RNAs、油脂、燃料、染料、天然色素、維他命、香水，調(diào)味品、 疫苗、抗體、荷爾蒙以及類似物品的生產(chǎn)、織物結(jié)構(gòu)或者發(fā)育的改變，包括發(fā)育時(shí)間、光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)、生殖或者變異的變化、此外，可以創(chuàng)建一個(gè)整個(gè)基因組庫(kù)(也可以是其一部分)，該基因庫(kù)可以是任何生物或者細(xì)胞器官的，包括哺乳動(dòng)物、植物、微生物、真菌或者細(xì)菌。
某一實(shí)施案例中，甘蔗植株含有一個(gè)顯示增加或減少、或植物某種產(chǎn)品積累的甘蔗微型染色體或者重組染色體。產(chǎn)品可能是植物的一種原生產(chǎn)品或者植物的一種新的、或修改產(chǎn)品。具代表性的產(chǎn)品包括一種酵素、一種RNA分子、一種營(yíng)養(yǎng)蛋白、一種結(jié)構(gòu)蛋白、一種氨基酸、一種油脂、一種脂肪酸、一種多糖、一種糖類、一種酒精、一種生物堿、一種類胡蘿卜素、一種丙酸、一種苯丙素、一種萜類化合物、一種類固醇、一種類黃酮、一種酚類化合物、 一種花青素、一種天然色素、一種維他命或者植物荷爾蒙。另一實(shí)施案例中，甘蔗植株包括一種可以增加或減少光、水、氮、或者微量元素需求的甘蔗微型染色體或者重組染色體。另一實(shí)施案例中，甘蔗植株包括一種提高從氮環(huán)境中獲取或穩(wěn)定氮的能力的甘蔗微型染色體或重組染色體。另一實(shí)施案例中，甘蔗植株包括一個(gè)富含一種作為植物蛋白分段存在的基本氨基酸的甘蔗微型染色體或者重組染色體。蛋白分段可能是如總種子蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)、非可溶性蛋白質(zhì)、水可萃取蛋白質(zhì)以及脂類蛋白質(zhì)。甘蔗微型染色體或者重組染色體可能含有一種多功能基因，這種基因可導(dǎo)致超表達(dá)、低表達(dá)、反義調(diào)控、共抑制、誘導(dǎo)性表達(dá)或者其他基因的誘導(dǎo)調(diào)制。
下面列出了具代表性的目標(biāo)性質(zhì)和表現(xiàn)以及增減的多肽。
⑴抗除草劑
除草劑抗藥性(或者耐受性)性狀是含有甘蔗微型染色體或重組染色體的甘蔗植株的一個(gè)特性，即對(duì)野生植株有致死威脅的典型藥劑具有抵抗性。對(duì)植物來(lái)說(shuō)除草劑抗藥性是很有用的，其中具代表性的除草劑包括草甘膦除草劑、草丁膦除草劑、苯腈除草劑、咪唑啉酮除草劑、二硝基苯胺除草劑、氮苯除草劑、磺脲除草劑、bialaphos除草劑、磺胺除草劑以及草銨膦除草劑，其他的除草劑可能當(dāng)除草劑基因組合都進(jìn)入相同的甘蔗微型染色體或者重組染色體時(shí)，就
改造中能夠使用到的抗除草基因的例子包括對(duì)草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar)編碼的基因、草甘膦耐受性EPSP合酶基因、草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦退化酵素基因氣態(tài)氧編碼草甘膦氧化還原酶、deh(對(duì)脫鹵素酶編碼，使其對(duì)茅草枯具不活躍性)、抗除草劑(比如磺胺和咪唑啉酮)的乙酰乳酸合酶、以及bxn基因(對(duì)一種腈水解酶編碼，使器能夠降解溴苯腈)。Bar基因能對(duì)一種酵素，草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)編碼，它能降低除草劑草丁膦的活性以及阻止這種化合物對(duì)谷氨酰胺合成酶酵素的抑制作用。5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP合成酶)通常受到除草劑N-(膦羧甲基)-甘氨酸-(草甘膦)的抑制。然而，據(jù)所知，能夠編碼草甘膦抗性EPSP合酶酵素的基因。特別考慮了能夠用于植物轉(zhuǎn)化的基因。 Deh基因能對(duì)酵素茅草枯脫鹵酶編碼，賦予除草劑茅草枯的抗性。Bxn基因?qū)σ环N特殊腈水解酶酵素編碼，把溴苯腈轉(zhuǎn)化成一種非除草劑降解產(chǎn)品。草甘膦乙?；D(zhuǎn)移酶基因能是除草劑草甘膦失活，阻止該化合物對(duì)EPSP合酶的抑制。
多肽可以使植物對(duì)植物除草劑(參與莽草酸途徑的多肽)產(chǎn)生耐受性，它可為植物提供草甘膦耐受性。這些多肽包括參與chori smate、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸生物合成的多肽。
(ii)抗蟲性
可采用的潛在抗蟲性(或者耐受性)基因包括蘇云金芽孢桿菌毒素基因或者Bt 基因((Watrud et al. , In !Engineered Organisms and the Environment，1985)。Bt 基因可提供對(duì)鱗翅目害蟲或者鞘翅目害蟲的抗藥性，包括玉米螟(ECB)。這種實(shí)施案例中使用的具代表性的Bt毒素基因包括CryIA(b)和CrylA(c)基因。此外，從其他類的芽孢桿菌中也能提取出內(nèi)毒素基因，用它來(lái)降低害蟲增長(zhǎng)速度或發(fā)育速度。
考慮到某些實(shí)施案例中用于甘蔗微型染色體或重組染色體中的Bt基因中編碼序列已經(jīng)被改變并以此來(lái)增加其在包括甘蔗植株在內(nèi)的單子葉植株中的表達(dá)。我們已經(jīng)熟知提取和酶基因的方法，比如U. S. Patent No. 5, 500, 365and U. S. Patent Number No. 5，689，052，，每個(gè)披露都以全文參考的形式引入本文。此類改性Bt毒素基因包括一種合成的 Bt CryIA(b)基因(Perlak et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 :3324-3328, 1991)，以及稱為 1800b 的合成 CryIA(c)基因(PCT Application WO 95/06128)。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的一些Bt毒素在表1中列出。
表1 蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因a
新命名法舊命名法基因銀行注冊(cè)號(hào)CrylAaCryIA(a)M11250CrylAbCryIA(b)M13898CrylAcCrylA(c)M11068CrylAdCryIA(d)M73250CrylAeCryIA(e)M65252CrylBaCryIBX06711CrylBbET5L32020CrylBcPEG5Z46442CrylBdCryElU70726CrylCaCryICX07518CrylCbCryIC(b)M97880CrylDaCryIDX54160CrylDbPrtBZ22511CrylEaCryIEX53985CrylEbCryIE(b)M73253
CrylFaCryIFM63897CrylFbPrtDZ22512CrylGaPrtAZ22510CrylGbCryH2U7072權(quán)利要求
1.由選自包含以下成分的基團(tuán)的核苷酸序列組成的多核苷酸(a)SEQ ID NO :204的核苷酸序列；以及(b)和SEQID NO 204的核苷酸序列有至少98%相似度的核苷酸序列。
2.要求1中的多核苷酸，其中包含SEQID NO :204的核苷酸序列。
3.由包含要求1或要求2中多核苷酸的至少2個(gè)復(fù)制品的序列組成的核苷酸。
4.由包含要求1或要求2中多核苷酸的至少10個(gè)復(fù)制品的序列組成的核苷酸。
5.由包含要求1或要求2中多核苷酸的至少100個(gè)復(fù)制品的序列組成的核苷酸。
6.由包含要求1或要求2中多核苷酸的2到1000個(gè)復(fù)制品的序列組成的核苷酸。
7.要求6中的核苷酸，其中包含由5到250個(gè)多核苷酸復(fù)制品組成的序列。
8.要求3到7中任一種核苷酸，其中序列長(zhǎng)度為1到2001Λ。
9.要求8中的核苷酸，其中序列長(zhǎng)度為15到觀吐。
10.含有要求1或要求2中多核苷酸的甘蔗著絲粒。
11.含有要求3到9中任一種核苷酸的甘蔗著絲粒。
12.含有要求1或要求2中多核苷酸的甘蔗人工染色體。
13.含有要求3到9中任一種核苷酸的甘蔗人工染色體。
14.含有要求10或要求11中甘蔗著絲粒的甘蔗人工染色體。
15.要求12到14中任一種甘蔗人工染色體，其中含有一個(gè)外源性核苷酸。
16.要求15中的甘蔗人工染色體，其中含有至少3個(gè)外源性核苷酸。
17.要求15或要求16中的甘蔗人工染色體，其中至少一個(gè)外源性核苷酸可連接到在甘蔗植物細(xì)胞中具備機(jī)能的異源調(diào)節(jié)序列中。
18.要求17中的甘蔗人工染色體，其中外源性核苷酸是除草劑抗性基因，氮固定基因， 昆蟲抗性基因，抗病基因，植物應(yīng)激誘導(dǎo)基因，養(yǎng)分利用基因，影響植物色素的基因，編碼反向或RNA構(gòu)成酶分子的基因，編碼分泌抗原的基因，毒素基因，受體基因，配位子基因，種子貯存基因，激素基因，酶基因，抗體基因，生長(zhǎng)因子基因，抗旱性基因，抗熱性基因，抗寒基因，抗凍基因，抗過(guò)度潮濕基因，鹽應(yīng)激抗性基因或生物燃料基因。
19.要求12到18中任一種甘蔗人工染色體，其中甘蔗植物細(xì)胞有絲分裂分離率至少達(dá)到 90%。
20.含有要求1或要求2中多核苷酸的載體。
21.含有要求3到9中任一種核苷酸的載體。
22.含有要求10或要求11中甘蔗著絲粒的載體。
23.含有要求12到19中任一種甘蔗人工染色體的載體。
24.含有要求1或要求2中多核苷酸的細(xì)胞。
25.含有要求3到9中任一種核苷酸的細(xì)胞。
26.含有要求10或要求11中甘蔗著絲粒的細(xì)胞。
27.含有要求12到19中任一種甘蔗人工染色體的細(xì)胞。
28.含有要求20到23中任一種載體的細(xì)胞。
29.要求M到28中任一種細(xì)胞，其中包含甘蔗植物細(xì)胞。
30.含有一條甘蔗人工染色體的要求四中的甘蔗植物細(xì)胞，其中甘蔗人工染色體未整合到甘蔗植物細(xì)胞染色體組中。
31.由一條含有外源性核苷酸的甘蔗人工染色體組成的、要求四或要求30中的甘蔗植物細(xì)胞，其中出現(xiàn)與外源性核苷酸的表達(dá)相關(guān)的表型改變。
32.要求31中的甘蔗植物細(xì)胞，其中表型改變包含天然基因表達(dá)的改變。
33.要求31中的甘蔗植物細(xì)胞，其中表型改變包含外源性基因表達(dá)的改變。
34.含有要求四到33中任一種甘蔗植物細(xì)胞的甘蔗植物組織。
35.含有要求四到33中任一種甘蔗植物細(xì)胞的甘蔗植株。
36.含有要求四到33中任一種甘蔗植物細(xì)胞的甘蔗植株器官。
37.從要求35中的甘蔗植株中獲取的甘蔗種子。
38.含有甘蔗人工染色體、由含甘蔗人工染色體的要求35中的植株培育而來(lái)的甘蔗植物子代。
39.使用要求35中的甘蔗植株的方法，其中甘蔗植株是由含外源性核苷酸編碼的重組蛋白質(zhì)的甘蔗人工染色體組成，該方法包括培育植株制造重組蛋白質(zhì)。
40.要求30中的方法，進(jìn)一步包括收獲或處理甘蔗植株的步驟。
全文摘要
本發(fā)明大體上與含有甘蔗著絲粒序列的甘蔗微型染色體和重組染色體有關(guān)。此外，本發(fā)明也提供了由這些甘蔗微型染色體轉(zhuǎn)化形成甘蔗植株的方法。含異常組分和結(jié)構(gòu)的甘蔗微型染色體被用于轉(zhuǎn)化依次用來(lái)生成甘蔗植株的甘蔗細(xì)胞。生成甘蔗植株的方法包括將甘蔗微型染色體注入甘蔗細(xì)胞中以轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，選擇變異細(xì)胞的方法，以及分離甘蔗微型染色體或重組染色體轉(zhuǎn)化后的甘蔗植株的方法。
文檔編號(hào)C12P19/34GK102498220SQ201080033169
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者D.普羅伊斯, G.P.科彭哈弗, J.M.馬赫, P.巴龍, S.R.卡爾森, 羅松 申請(qǐng)人:先正達(dá)參股股份有限公司