專利名稱：用于通過n-?；騨-胍基保護的1,4-丁二胺前體制備1,4-丁二胺的方法
用于通過N-?；騈-胍基保護的1，4-丁二胺前體制備1，
4- 丁二胺的方法本發(fā)明涉及用于制備1，4_二氨基丁烷[DAB]的方法，所述方法涉及至少一個生物催化步驟。化合物DAB是一種重要的原材料，用于生產(chǎn)一些主要的工程塑料聚酰胺-4，6，所述聚酰胺-4，6是均聚物的形式，或是共聚物，例如與約5wt. %的聚酰胺-6單體(己內(nèi)酰胺)的共聚物。均聚物聚酰胺_4，6 (尼龍-4，6)早在1938年已被描述過(US-A-2，130，948， Carothers) 0其為單體DAB和己二酸的縮聚產(chǎn)物。目前，特別地，聚酰胺_4，6化合物被荷蘭的DSM生產(chǎn)并以商品名STANYL 出售。對DAB的合成而言，已知大量化學途徑。這些化學途徑受累于下述缺點起始材料必須得自被認為是不可更新的來源。然而，存在提供從可更新的碳源開始并使用生物化學方法(也稱作“生物轉化”)合成DAB的新的可行途徑的重大需要。涉及至少一個發(fā)酵步驟的用于制備DAB的方法已描述于作為W02006/005603和 W02006/00504公開的PCT申請中。兩個文件均描述了在具有提高的鳥氨酸脫羧酶活性水平的微生物中發(fā)酵生產(chǎn)DAB。本發(fā)明的方法涉及用于制備DAB的替代性方法。根據(jù)本發(fā)明的方法涉及至少一個生物催化步驟，所述生物催化步驟包括生物催化生產(chǎn)至少一種DAB的N-保護的前體，隨后將所述N-保護的前體體外轉化成DAB。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在生物催化生產(chǎn)后回收DAB遇到了相當大的困難。在W02007/079944中描述了對有機胺(例如DAB)的回收。在本文所述的一個特別的實施方案中，將含有胺的硫酸鹽或磷酸鹽(因此例如為DAB-重硫酸鹽)的無細胞發(fā)酵液濃縮，并添加堿(例如氨)。 根據(jù)條件形成兩層體系?？梢詮闹饕杏袡C化合物的層中回收想要的胺。發(fā)明詳述根據(jù)一個實施方案，用于制備DAB的方法涉及至少一個生物催化步驟，并且包括以下步驟(a)以生物催化的方式制備DAB的N-保護的前體，得到含有DAB的N-保護的前體的生物催化反應混合物，b)從生物催化反應混合物中回收N-保護的前體，和c)將N-保護的前體轉化成DAB。根據(jù)一個特別的實施方案，用于生產(chǎn)DAB的本發(fā)明涉及至少一個生物催化步驟， 所述生物催化步驟包括以生物催化的方式生產(chǎn)至少一種DAB的N-保護的前體，所述DAB的 N-保護的前體選自由N5-保護的鳥氨酸、N-保護的DAB和N-保護的4-氨基丁醛組成的組， 隨后將所述N-保護的前體體外轉化成DAB?！绑w外轉化”在本文中表示在細胞外的介質中將DAB的N-保護的前體轉化成DAB。 體外轉化可以是至少一種生物催化劑催化的轉化，或者可以是涉及至少一個化學步驟的化學轉化，或者可以是至少一個生物催化步驟和至少一個化學步驟的組合。“DAB的N-保護的前體”在本文中表示下述化合物，所述化合物含有保護的氨基， 并且可以通過至少一個化學反應或生物催化反應或通過化學反應與生物催化反應的組合被轉化成DAB。
“N5-保護的鳥氨酸”在本文中表示在其N5原子上具有保護基的鳥氨酸分子； “N-保護的DAB”在本文中表示在其一個氨基上具有保護基團的DAB分子；“N-保護的4-氨基丁醛”在本文中表示在氨基上具有保護基的4-氨基丁醛。上文所述的保護基可選自由具有1-6個碳原子的?；N類組成的組，或者可以是胍基。應當選擇這樣的保護基，以允許至少以下之一生物催化生產(chǎn)，易于從生物催化反應混合物(例如發(fā)酵液)中回收N-保護的前體，和隨后進行生物催化反應和/或反應，以最終生產(chǎn)DAB?？梢酝ㄟ^例如4-氨基丁醛或鳥氨酸的酰化來制備DAB的N-保護的前體。例如， 通過在甲酸中用乙酸酐酰化以引入甲基保護基，或通過C2-C6羧酸酐或酰氯的反應以分別引入N-乙?；?、N-丙?；?、N- 丁酰基、N-戊?；騈-己?；-胍基保護的前體是例如生成蛋白質的精氨酸或N-胍基-氨基丁醛或N-胍基-DAB。發(fā)酵途徑描述于例如EP1260588，所述文獻描述了在精氨酸脫羧酶的影響下從精氨酸以生物化學方式生產(chǎn)胍丁胺(agmatine)。胍丁胺是N-胍基-保護的DAB。胍丁胺 (N-胍基-保護的DAB)可以通過酸水解，例如通過在水性濃礦物酸溶液(例如濃鹽酸或濃硫酸)中回流胍丁胺而被順利地去保護成DAB。這產(chǎn)生了 DAB 二酸鹽和副產(chǎn)物二氧化碳和氨(后者是其使用的礦物酸的銨鹽形式)。為了獲得游離胺形式的DAB，應當將形成的二酸鹽分離、再溶解并用堿中和。根據(jù)又一個特別的實施方案，本發(fā)明涉及用于制備DAB的方法，其中生產(chǎn)至少一種DAB的N-保護的前體，所述N-保護的前體選自由N5-乙酰基鳥氨酸、N-乙?；鵇AB和 N-乙?；?-氨基丁醛組成的組。根據(jù)一個特別的實施方案，涉及至少一個生物催化步驟的用于制備DAB的方法包括以下步驟(a)以生物催化的方式制備N5-乙酰基鳥氨酸，得到含有N5-乙?；B氨酸的生物催化反應混合物，(b)從生物催化反應混合物中回收N5-乙酰基鳥氨酸，和(c)將N5-乙酰基鳥氨酸轉化成DAB。根據(jù)一個特別的實施方案，涉及至少一個生物催化步驟的用于制備DAB的方法包括以下步驟(a)以生物催化的方式制備N-乙酰基DAB，得到含有N-乙?；鵇AB的生物催化反應混合物，(b)從生物催化反應混合物中回收N-乙?；鵇ABdP (c)將N-乙?；鵇AB 轉化成DAB。根據(jù)一個特別的實施方案，涉及至少一個生物催化步驟的用于制備DAB的方法包括以下步驟(a)以生物催化的方式制備N-乙?；?-氨基丁酸，得到含有N-乙?；?-氨基丁醛的生物催化反應混合物，(b)從生物催化反應混合物中回收N-乙酰基4-氨基丁醛， 和(c)將N-乙?；?-氨基丁醛轉化成DAB。在本文中明確或暗示地涉及胺或N-保護的胺(例如N-保護的DAB)時，這些術語旨在包括中性氨基、相應的帶電荷的質子化胺及其鹽。^X除非另有說明，在本文中使用時，術語“或”被定義為“和/或”。除非另有說明，在本文中使用時，術語“一個”(“a”或“an”)被定義為“至少一個”。提及單數(shù)名詞(例如化合物、添加劑等)時，復數(shù)旨在被包括在內(nèi)。
提及存在立體異構體的化合物時，化合物可以是所述立體異構體中的任何或其組合。因此，提及例如存在對映異構體的氨基酸時，氨基酸可以是L-對映異構體或D-對映異構體或其組合。存在天然立體異構體時，化合物優(yōu)選地是天然立體異構體。參考括號中的酶種類(EC)提及酶時，酶種類是以Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biο 1 οgy(NC-1UBMB)所提供的酶命名法(Enzyme Nomenclature)為基礎將酶分類或可以分類的種類，所述命名法可在 http //www, chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/.得到。(尚)未歸入特定種類但是可以如此被歸類的其他合適酶旨在被包括在內(nèi)。術語“同源的”或“同源物”或“直系同源物”是指具有功能關系并且通?；谛蛄型恍猿潭缺粶y定的相關序列。這些術語可描述在一個物種、亞種、變種、栽培種或菌株中存在的基因與在其他物種、亞種、變種、培養(yǎng)種或菌株中的等同基因之間的關系。它們也可以描述天然存在的基因與人工構建的基因之間，或兩個人工構建的基因之間的關系。功能關系可以通過大量方式中的任何一種來指明，包括但不限于(a)序列同一性程度；(b)相同或相似的生物功能。優(yōu)選地，(a)和(b)均被指明。術語同源物還旨在包括由于遺傳密碼的簡并性而與另一核酸序列不同并且編碼相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。在本文中任何一處涉及多肽使用術語“同源物”旨在表示與參照多肽具有相同或相似的生物功能以及一定程度的序列同一性的多肽。特別地，其旨在表示至少30%，優(yōu)選地至少40 %，更優(yōu)選地至少60 %，更優(yōu)選地至少65 %，更優(yōu)選地至少70 %，更優(yōu)選地至少 75 %，更優(yōu)選地至少80 %，特別地至少85 %，更特別地至少90 %，至少91 %，至少92 %，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。“序列同一性”或“序列相似性”在本文中被定義為兩條或更多多肽序列或兩條或更多核酸序列之間的相互關系，通過比較所述序列來測定。通常，序列同一性或相似性在序列全長上比較，但是也可以僅在彼此對齊的序列的一部分上比較。在本領域中，“同一性” 或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之間之間的序列相關性程度，根據(jù)情況由這類序列之間的匹配來確定。測定同一性或相似性的優(yōu)選方法被設計為在測試的序列之間給出最大匹配。在本發(fā)明的上下文中，測定兩條序列之間同一性和相似性的一種優(yōu)選的計算機程序方法包括 BLASTP 和 BLASTN (Altschul，S. F. et al. ,J. Mol. Biol. 1990，215，403-410)，公眾可以從 NCBI 和其它來源(BLAST Manual, Altschul, S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD20894)獲得。使用BLASTP進行多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)為缺口開放10. 0，缺口延伸0. 5， Blosum 62矩陣。使用BLASTN進行核酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)為缺口開放10. 0，缺口延伸 0. 5，DNA全矩陣(DNA同一性矩陣)?！吧镛D化”或“生物催化反應”在本文中表示其中使用酶作為催化劑的生物化學反應。根據(jù)本發(fā)明，其表示使用生物催化劑，方法中至少一個反應步驟由生物材料或源自生物來源的部分(例如生物或源自生物的生物分子)催化。特別地，生物轉化可以是發(fā)酵步驟。生物催化劑可特別地包括一種或多種酶。生物催化劑可以以任何形式使用。在一個特別的實施方案中，使用作為下述形式的一種或多種酶溶液、乳液、分散液、凍干細胞(的懸浮液)，作為溶胞產(chǎn)物或固定在支持物上的，分離自天然環(huán)境(分離自生產(chǎn)它的生物)的。 在一個實施方案中，一種或多種酶構成活生物的部分(例如活的全細胞)。酶可在細胞內(nèi)發(fā)揮催化功能。酶可被分泌進其中存在細胞的培養(yǎng)基中也是有可能的。
“生物催化反應混合物”在本文中表示其中發(fā)生生物催化反應的環(huán)境。其可以是細胞環(huán)境(對細胞內(nèi)或細胞外的生物催化反應而言)，或是無細胞環(huán)境?！鞍l(fā)酵步驟”在本文中表示其中在單細胞宿主中，更特別地在細胞培養(yǎng)物中的微生物中發(fā)生特別的化學實體的形成或轉化的方法步驟?！鞍l(fā)酵制備”在本文中表示在含有可發(fā)酵的碳源的細胞培養(yǎng)物中，在包含生物催化劑的微生物中生產(chǎn)具體化學實體，其中所述碳源含有要被轉化成要制備的特別化學實體的任何所述化合物，或其中細胞將要被轉化的化合物制備成要由碳源制備的特別化學實體。微生物可以是特別化學實體的天然生產(chǎn)者，或者可以使用重組DNA技術，通過用編碼至少一種合適酶的基因轉化而獲得了生產(chǎn)特別化學實體的能力。也可以使用重組DNA技術，用編碼至少一種合適酶的基因轉化特別化學實體的天然生產(chǎn)者，從而提高想要的特別化學實體的生產(chǎn)，和/或消除下述組分的生產(chǎn)，所述組分可能干擾想要的特別化學實體生產(chǎn)力，或可能干擾根據(jù)本發(fā)明方法中的其他步驟。用于發(fā)酵制備DAB的N-保護的前體的優(yōu)選的微生物可以是真核或原核來源的。特別地，其可選自動物(包括人)細胞，植物細胞，細菌，古細菌，酵母和真菌。更特別地，微生物可以選自由細菌、酵母、真菌組成的組，所述細菌例如是Bacillus (特別是B. subtilis), Brevibacterium(特另U 是 B. ketoglutamicum)，corynebacteria (特另U 是 C. glutamicum)， Escherichia(特別是 E. coli)，Klebsiella(特別是 K. pneumoniae)，Iactobacilli(特別是 L. Iactis)，propionibacterium, pseudomonas (特別是 P. putida)，Rodococcus (特另Ij 是 R. erythropolis), Streptomyces (特另Ij 是 S. coelicor 禾口 S. clavuligerus),所述酵母例如是 Kluyveromyces (特別是 K. Iactis)， Penicillium(特別是 P. chrysogenum)， Saccharomyces (特別是 S. cerevisiae)，Aspergillus (特別是 A. niger)，Pichia (特別是 P. pastoris)，Hansenula, Schizosaccharomyces (特別是 S. pombe)，Yarowia(特別是 Y. lypolytica),所述真菌例如是 Talaromyces。在最優(yōu)選的實施方案中，N-保護的前體的發(fā)酵生產(chǎn)在微生物中進行，其中N-保護的前體是體內(nèi)形成的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的N-保護的前體的形成是由任何合適的碳源生物轉化成N-保護的前體。用于發(fā)酵方法的碳源可尤其含有至少一種選自下組的化合物一元醇、多元醇、羧酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的混合物。合適的一元醇包括甲醇和乙醇。合適的多元醇包括甘油和碳水化合物。合適的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形式提供，優(yōu)選地為植物來源。特別地，可以使用碳水化合物，因為通常碳水化合物可從生物可更新來源如農(nóng)產(chǎn)品(優(yōu)選地農(nóng)業(yè)廢料)中大量獲得。優(yōu)選地，使用選自下組的碳水化合物葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蔗二糖、淀粉、纖維素和半纖維素。尤其優(yōu)選的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包含葡萄糖的多糖。另外，也可以使用氨基酸或其衍生物、谷氨酸或其衍生物和/或鳥氨酸或其衍生物作為碳源?？梢允褂煤袩o機氮的化合物例如胺、銨鹽、尿素、硝酸鹽和亞硝酸鹽，或含有有機氮的化合物例如氨基酸或其衍生物，更特別地谷氨酸或其衍生物和/或鳥氨酸或其衍生物，作為氮源。在本文中提及生物催化劑時，其可表示表達至少一種與生物催化功能相關的酶的生物，或其可表示至少一種得自或源自生物的酶。生物可以是真核或原核的。特別地，生物可選自動物(包括人)、植物、細菌、古細菌、酵母和真菌。在一個實施方案中，生物催化劑源自動物，特別地源自動物部分，例如肝、胰、腦、 腎、心或其他器官。動物可特別地選自哺乳動物的組，更特別地選自靈長類動物(如Homo sapiens)、Leporidae、Muridae、Suidae 禾口 Bovidae 的組。作為生物催化劑來源的合適植物特別是選自Asplenium ；Cucurbitaceae，特別是 Cucurbita,例如 Cucurbita moschata (南瓜)，或 Cucumis ；Mercurial is，例如 Mercurial is perennis ；Hydnocarpus ；禾口 Ceratonia 組的植物。作為生物催化劑來源的合適細菌可特別選自Acinetobacter，Agrobacterium， Alcaligenes，Bacillus，Brevibacterium，Clostridium，Corynebacterium, Deinococcus， Enterobacter， Enterococcus， Erwinia, Escherichia， Geobacillus， Klebsiella， Lactobacillus， Lactococcus， Legionella， Mycobacterium, Neisseria， Nitrosomonas， Novosphingobium， Paracoccus， Proteus， Pseudomonas， Ralstonia， Rhodobacter, Rhodopseudomonas，Salmonella，Shigella，Staphylococcus, Streptococcus， Streptomyces，Thermus，Vibrio 禾口 Zymomonas 的組。作為生物催化劑來源的合適古細菌可特別地選自Aeropyrum，Archaeoglobus， Halobacterium， Methanobacterium， Methanobrevibacter， Methanocaldococcus， Methanococcus， Methanopyrus, Methanosarcina, Methanosphaera, Pyrobaculum 禾口 Thermoplasma作為生物催化劑來源的合適真菌可特別地選自Aspergi 1 Ius，Neurospora, Penicillium, Rhizopus 禾口 Trichoderma 的組。作為生物催化劑來源的合適酵母可特別地選自Candida，Cytophagia，Hansenula， Humicola, Kluyveromyces, Mucor, Rhizoctonia, Saccharomyces 禾口 Yarrowia 的組。本領域技術人員應當明白，在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以利用具有合適活性的天然存在的生物催化劑(野生型)或天然存在的生物催化劑的突變體。可以通過本領域技術人員已知的生物學技術，例如分子進化或合理設計(rational design)改進天然存在的生物催化劑的特性?？衫缤ㄟ^使用本領域技術人員已知的誘變技術(隨機誘變、定點誘變、定向進化、基因重組等)修飾下述生物的編碼DNA來制造野生型生物催化劑的突變體，所述生物能夠發(fā)揮生物催化劑的作用或者能夠生產(chǎn)生物催化劑部分(如酶)。具體地，可以修飾 DNA,使其編碼與野生型酶差異至少一個氨基酸的酶，使其編碼與野生型相比包含一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突變體組合兩個或更多親本酶的序列，或者影響合適的(宿主)細胞中藉此被修飾的DNA的表達。后者可以通過本領域技術人員已知的方法如密碼子優(yōu)化或密碼子對優(yōu)化來實現(xiàn)，例如基于W02008/000632中所述方法。突變體生物催化劑可具有經(jīng)改進的特性，例如關于一個或多個以下方面底物選擇性、活性、穩(wěn)定性、溶劑耐受性、PH譜、溫度譜、底物譜、對抑制的敏感性、輔因子利用和底物親和力。可以通過應用例如合適的高通量篩選或選擇方法，基于本領域技術人員已知的這類選擇方法，來鑒定具有改進的特性的突變體。涉及來自具體來源的生物催化劑(特別是酶)、來自供體生物但是實際上在(經(jīng)遺傳修飾的)宿主生物中生產(chǎn)的重組生物催化劑(特別是酶)時，特定地旨在包括來自所述第一生物的生物催化劑(特別是酶)。本發(fā)明上下文中任何生物催化步驟的反應條件可根據(jù)生物催化劑(特別是酶)的已知條件、本文公開的信息和任選地一些常規(guī)實驗來選擇。使用的反應培養(yǎng)基的pH可以在寬泛的界限內(nèi)選擇，制藥生物催化劑在所述pH條件下有活性即可。可以使用堿性、中性或酸性條件，取決于生物催化劑和其它因素。當所述方法包括使用微生物(例如用于表達催化本發(fā)明方法的酶)時，選擇PH使得所述微生物能夠發(fā)揮其預期的一種或多種功能。在25°C下基本水性體系的情況下，特別可在低于中性pH 四個PH單位和高于中性pH兩個pH單位的范圍內(nèi)選擇pH，即在pH 3和pH9之間選擇。如果水是唯一的溶劑或主要的溶劑(以總液體為基礎> 50wt. %，特別是> 90wt. % )，則系統(tǒng)被認為是水性的，其中例如小量的醇或另一種溶劑(以總液體為基礎< 50wt. %，特別是 < IOwt. 可以下述濃度溶解(例如作為碳源)，所述濃度使得可以存在的微生物保持活性。特別是在使用酵母和/或真菌的情況下，可優(yōu)選酸性條件，特別是25°C下基于基本水性體系的PH可以在pH 3到pH 8的范圍內(nèi)。需要時可以使用酸和/或堿調(diào)節(jié)或者用合適的酸和堿的組合緩沖pH。孵育條件可以在在廣闊的界限內(nèi)選擇，只要生物催化劑顯示足夠的活性和/或生長即可。這包括需氧、微需氧、限氧和厭氧的條件。厭氧條件在本文中被定義為下述條件無任何氧，或其中生物催化劑(特別是微生物)基本不消耗氧并且通常對應于少于5mmol/l. h的氧消耗，特別是小于2. 5mmol/l. h 的氧消耗，或小于lmmol/1. h的氧消耗。需氧條件是下述條件，其中對不受限制的生長而言足夠水平的氧溶于培養(yǎng)基中， 能夠支持至少10mmol/l. h、更優(yōu)選地多于20mmol/l. h、進一步更優(yōu)選地多于50mmol/l. h、 最優(yōu)選地多于lOOmmol/1. h的氧消耗速率。限氧條件被定義為下述條件其中氧消耗由從氣體轉移至液體的氧限制。限氧條件的下限由厭氧條件的上限決定，即至少lmmol/1. h，特別是至少2. 5mmol/l. h，或至少 5mmol/l.h。限氧條件的上限由需氧條件的下限決定，即少于lOOmmol/1. h、少于50mmol/ 1. h、少于 20mmol/l. h 或少于 10mmol/l. h。條件是需氧、厭氧還是限氧取決于所述方法進行的條件，特別是進入氣流的量和組成、使用的設備的實際混合/質量轉移特性、使用的微生物的類型和微生物密度。使用的溫度不是關鍵性的，只要生物催化劑(特別是酶)顯示大量活性即可。通常，溫度可以是至少0°c，特別是至少15°C，更特別是至少20°C。想要的最大溫度取決于生物催化劑。通常這類最大溫度是本領域已知的，例如在可商業(yè)獲得的生物催化劑的情況下在產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中指出，或者可以基于公知常識和本文公開的信息常規(guī)地測定。溫度通常是 90°C或更少，優(yōu)選地是70°C或更少，特別是50°C或更少，更特別是40°C或更少。特別地，如果在宿主生物外進行生物催化反應，包含有機溶劑的反應培養(yǎng)基可以以高濃度(例如大于50%，或大于90wt. %)使用(使用在包含有機溶劑的反應培養(yǎng)基中保持足夠活性的酶時)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)作為DAB的N-保護的前體的 N5-保護的鳥氨酸的生物催化方法。例如，N5-乙酰基鳥氨酸的制備可包含一個或多個以下的被酶催化的反應
1)谷氨酸到N-乙?；劝彼?) N-乙?；劝彼岬?-磷酸N-乙?；劝彼?3) 5-磷酸N-乙?；?谷氨酸到N-乙?；?谷氨酸半醛4) N-乙?；?谷氨酸半醛到N2-乙?；?鳥氨酸5) N2-乙酰基-鳥氨酸到N5-乙?；?鳥氨酸反應1)可由選自?；D移酶(EC 2. 3. 1)組、優(yōu)選地選自氨基酸N-乙?；D移酶 (EC 2. 3. 1. 1)組的酶催化。優(yōu)選地，酶對作為乙?；w的乙?；?CoA和作為乙酰基受體的谷氨酸而言是特異性的。氨基酸N-乙?；D移酶可源自原核生物或真核生物。能夠催化反應1)的示范性蛋白質在表1中給出，并給出它們在Uniprot數(shù)據(jù)庫的登記號及其來源 (微)生物。反應幻可由選自乙?；?谷氨酸激酶(EC 2. 7. 2. 8)組的酶催化。所述酶可使用 ATP作為輔因子。乙?；?谷氨酸激酶可源自原核生物或真核生物。能夠催化反應幻的示范性蛋白質在表1中給出，并給出它們在toiprot的登記號及其來源(微)生物。反應幻可由選自氧化還原酶(EC 1. 2. 1)組，優(yōu)選地選自N-乙酰基-γ -谷氨?；?磷酸還原酶(EC 1. 2. 1. 38)組的酶催化。所述酶可使用NADH或NADPH作為輔因子。 N-乙?；?γ-谷氨?；?磷酸還原酶可源自原核生物或真核生物。能夠催化反應幻的示范性蛋白質在表1中給出，并給出它們在Uniprot的登記號及其來源(微)生物。反應4可由選自轉氨酶(EC 2.6. 1)組、優(yōu)選地選自乙?；B氨酸轉氨酶(EC 2.6. 1.11)組的酶催化。乙酰基鳥氨酸轉氨酶可使用谷氨酸作為氨基供體。乙酰基鳥氨酸轉氨酶可源自原核生物或真核生物。能夠催化反應4)的示范性蛋白質在表1中給出，并給出它們在Uniprot的登記號及其來源(微)生物。反應幻可由N-?；D移酶如谷氨酸N-乙?；D移酶(EC 2. 3. 1. 35)催化。谷氨酸可通過本領域公知的谷氨酸生物合成反應源自合適的碳源。優(yōu)選地，使用累積大量谷氨酸的微生物，例如Corynekicterium glutamicum。用于(例如通過遺傳工程) 改進谷氨酸生產(chǎn)的方法，是本領域公知的(Kimura E.，Adv Biochem Eng Biotechnol. 2003 ； 79 37-57)。或者，N5-乙酰基鳥氨酸的制備可包括一個或多個以下由酶催化的反應
6)谷氨酸到N-乙?；劝彼?) N-乙酰基-谷氨酸加鳥氨酸到N2-乙?；?鳥氨酸8) N2-乙?；?鳥氨酸到N5-乙酰基-鳥氨酸表1 用于反應步驟1-8的酶
反應步 UniProt登
酶微生物
驟記號
1/6 P0A6C5氨基酸乙?；D移酶Escherichia coli
^1/6 P40360氨基酸乙?；D移酶，線粒體 SflccZwramyc^
權利要求
1.用于制備1，4-二氨基丁烷[DAB]的方法，所述方法涉及至少一個生物催化步驟，所述生物催化步驟包括以生物催化的方式生產(chǎn)至少一種DAB的N-保護的前體，以及隨后將所述DAB的N-保護的前體體外轉化成DAB。
2.用于制備DAB的方法，所述方法涉及至少一個生物催化步驟，并且包括以下步驟a)以生物催化的方式制備DAB的N-保護的前體，得到含有所述DAB的N-保護的前體的生物催化反應混合物，b)從所述生物催化反應混合物中回收所述N-保護的前體，c)將所述N-保護的前體轉化成DAB。
3.根據(jù)權利要求1或2任一項所述的方法，其中所述DAB的N-保護的前體選自由N5-保護的鳥氨酸、N-保護的DAB和N-保護的4-氨基丁醛組成的組。
4.根據(jù)權利要求1或2任一項所述的方法，其中所述至少一種DAB的N-保護的前體選自由N5-乙?；B氨酸、N-乙酰基DAB和N-乙?；?-氨基丁醛組成的組。
5.根據(jù)權利要求1或2任一項所述的方法，其中所述生物催化步驟是發(fā)酵步驟。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟在單細胞宿主中發(fā)生。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟在選自由動物細胞、植物細胞、細菌、古細菌、酵母和真菌組成的組的宿主細胞中發(fā)生。
8.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中從所述生物催化反應混合物中對所述N-保護的前體的回收通過至少一個選自下組的步驟進行，所述組由過濾、沉降、結晶、親和層析、尺寸排除色譜、膜分離和蒸發(fā)組成。
9.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述N-保護的前體轉化成DAB的轉化步驟c)涉及至少一個酶處理或化學處理步驟。
10.根據(jù)權利要求1到9中任一項的用于制備DAB的方法，其中使用水解酶將所述N-保護的DAB轉化成DAB。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中使用下述水解酶，所述水解酶選自由羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、脂肪酶和肽酶組成的組，尤其選自脂肪酶和肽酶。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述水解酶是下述水解酶，所述水解酶選自由絲氨酸型羧肽酶、金屬羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、絲氨酸內(nèi)肽酶、半胱氨酸內(nèi)肽酶、天冬氨酸內(nèi)肽酶和金屬內(nèi)肽酶組成的組，尤其選自絲氨酸內(nèi)肽酶。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述絲氨酸內(nèi)肽酶是枯草桿菌蛋白酶，優(yōu)選地是枯草桿菌蛋白酶Carlsberg。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備1，4-二氨基丁烷[DAB]的新穎方法。根據(jù)本發(fā)明的方法涉及至少一個生物催化步驟，所述生物催化步驟包括以生物催化的方式生產(chǎn)至少一種DAB的N-保護的前體。本發(fā)明還涉及用于制備DAB的方法，所述方法涉及至少一個生物催化步驟，并且包括步驟a)以生物催化的方式制備DAB的N-保護的前體，得到含有DAB的N-保護的前體的生物催化反應混合物，b)從生物催化反應混合物中回收N-保護的前體，和c)將N-保護的前體轉化成DAB。更特別地，本發(fā)明涉及用于制備DAB的方法，其中至少DAB的N-保護的前體選自由N5-保護的鳥氨酸、N-保護的DAB和N-保護的4-氨基丁醛組成的組。
文檔編號C12P13/00GK102471789SQ201080032668
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權日2009年7月24日
發(fā)明者吳亮, 彼托納拉·凱瑟琳娜·拉伊馬克斯-弗蘭肯 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權資產(chǎn)管理有限公司