一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥中間體的制備領(lǐng)域，特別涉及一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胍基丁胺是左旋精氨酸脫羧酶(L-ADC)催化精氨酸脫羧基的產(chǎn)物，是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的大部分器官和組織內(nèi)均有分布，其特異性地存在于某些細(xì)胞內(nèi)，如腎上腺嗜鉻細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和頸動(dòng)脈體的球細(xì)胞等。研究資料表明，胍基丁胺有降血糖、降血壓、利尿、抗炎、抗抑郁、抑制細(xì)胞增生等生物活性，特別是對N-甲基-D-天冬氨酸(匪DA)受體的拮抗作用較強(qiáng)而持久，具有對動(dòng)物嗎啡依賴性的戒斷作用，是一種極具開發(fā)價(jià)值的戒毒類藥物。且胍基丁胺通過刺激釋放下丘腦的荷爾蒙來工作，包括促黃體激素和生長激素。通過兩種途徑來提高一氧化氮的含量:刺激釋放一氧化氮和抑制一氧化氮酶的合成?？商岣呱眢w耐受度，加快身體恢復(fù)(一般指運(yùn)動(dòng)后的恢復(fù))，提高身體性能，表現(xiàn)出驚人和長久的能量供輸，提高全身構(gòu)成。
[0003]目前市面上胍基丁胺多數(shù)以硫酸鹽形式存在，硫酸胍基丁胺作為胍基丁胺的藥用硫酸鹽，具有多種藥理學(xué)活性，硫酸胍基丁胺的市場運(yùn)用前景廣闊。在現(xiàn)有技術(shù)中，硫酸胍基丁胺的化學(xué)合成方法是用I，4_丁二胺為原料，先對它進(jìn)行單胺基保護(hù)，再使用1-硝基胍基-3，5-二甲基吡唑?qū)α硪粋€(gè)胺基進(jìn)行硝胍基化，后經(jīng)還原、脫保護(hù)、成鹽，最終制得硫酸胍基丁胺。該路線步驟多、收率低、成本高、不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。另一種以己二酸二乙酯為原料合成硫酸胍基丁胺，首先將乙二酸二乙酯與水合肼反應(yīng)制得己二酸二酰肼，在與亞硝酸鈉反應(yīng)得重氮鹽，加熱脫氮，生成I，4_二異氰酸酯丁烷，水解得到關(guān)鍵中間體I，4_丁二胺，然后再與S-甲基異硫脲硫酸鹽反應(yīng)制得硫酸胍基丁胺。此路線步驟較多，生產(chǎn)過程大量放氮，易爆炸，并且使用S-甲基異硫脲硫酸鹽作為胍基化試劑不可避免產(chǎn)生氣味難聞的烷基硫醇，對環(huán)境造成較大污染。而用I，4_丁二胺為原料，使用S-甲基異硫脲硫酸鹽作為胍基化試劑，同樣也存在環(huán)境污染問題。例如中國公開專利CN1834085A和CN101121677均報(bào)道了用I，4_丁二胺和3-甲基異硫脲反應(yīng)，得到硫酸胍基丁胺。但該方法的不足之處是:(I)反應(yīng)收率低(僅為40%左右)；(2)反應(yīng)易產(chǎn)生三廢，特別是產(chǎn)生的烷基硫醇?xì)馕峨y聞，易對環(huán)境造成污染，不利于勞動(dòng)保護(hù)，更不符合節(jié)能減排的產(chǎn)業(yè)政策。
[0004]因此，研發(fā)一種高效的硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法顯得十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有高效的硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法。所述技術(shù)方案如下:
[0006]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法，所述方法包括:以左旋精氨酸作為底物，以精氨酸脫羧酶作為生物轉(zhuǎn)化催化劑，進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成胍基丁胺粗產(chǎn)物，將所述胍基丁胺粗產(chǎn)物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物。
[0007]具體地，所述方法還包括:以磷酸吡哆醛作為輔酶，進(jìn)行脫羧反應(yīng)。
[0008]進(jìn)一步地，所述精氨酸脫羧酶與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比不超過0.05 ;所述磷酸吡哆醛與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比不超過0.002。
[0009]進(jìn)一步地，所述精氨酸脫羧酶與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比為1:40;所述磷酸吡哆醛與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比為1:1000。
[0010]具體地，所述脫羧反應(yīng)的反應(yīng)溫度為19-46°C;所述脫羧反應(yīng)的反應(yīng)體系的pH值為
6-10o
[0011]具體地，所述精氨酸脫羧酶為經(jīng)過固定化處理后的精氨酸脫羧酶，所述精氨酸脫羧酶的固定化處理包括如下步驟:
[0012]I)破碎含所述精氨酸脫羧酶的工程菌細(xì)胞，將所述工程菌細(xì)胞離心后，收集精氨酸脫羧酶液；
[0013]2)將步驟I)所收集的所述精氨酸脫羧酶液、添加劑和固定化載體按質(zhì)量比為1:0.6-0.8: 10-13加入pH值為6-8的緩沖溶液中，在25_35°C下恒溫?cái)嚢?_3h，離心后收集固體，得到固定酶載體;其中，所述添加劑包括硫酸鐵和硫酸鎂中的至少一種;所述固定化載體包括藻土、石英砂、含黏合劑型硅膠、活性氧化鈣、脂粉、明膠、氧化鋁和高嶺土中的至少一種；
[0014]3)將步驟2)中得到的所述固定酶載體用乙醇洗滌1-3次，干燥，即得到所述固定化處理后的精氨酸脫羧酶。
[0015]進(jìn)一步地，所述添加劑包括硫酸鐵和硫酸鎂，所述硫酸鐵和所述硫酸鎂的質(zhì)量比為1:2;所述固定化載體為由藻土、石英砂、氧化鋁和明膠組成，藻土、石英砂、氧化鋁和明膠的質(zhì)量比為4:1:1:3。
[0016]具體地，當(dāng)脫羧反應(yīng)進(jìn)行到Ih以后，向所述脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸。
[0017]具體地，當(dāng)脫羧反應(yīng)進(jìn)行到第2h時(shí)，向所述脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸，補(bǔ)加的左旋精氨酸的質(zhì)量為初始所加的左旋精氨酸的質(zhì)量的一半。
[0018]具體地，所述方法還包括對所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，所述純化步驟如下:
[0019]I)向所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物中加入活性炭，在40°C?60°C下放置Ih?2h，再用孔徑為0.45um的過濾膜抽濾，將抽濾后所得的溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除雜質(zhì)，得到硫酸胍基丁胺粗晶體；
[0020]2)將步驟I)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體；
[0021 ]或者所述純化步驟如下:
[0022]I)將乙腈、四氫呋喃、甲醇按體積比為2.5?3.5:3.5?5:1混合均勻，得到混合溶劑；
[0023]2)將所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于步驟I)中的所述混合溶劑中，其中，所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物與所述混合溶劑的質(zhì)量比為1:8?13，抽濾，得到硫酸胍基丁胺粗晶體；
[0024]3)將步驟2)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明實(shí)施例提供了一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法，工藝流程簡單，對設(shè)備無特殊要求，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，該方法與單純的化學(xué)法相比，反應(yīng)條件溫和，操作簡便，成本較低，污染少，且能完成在化學(xué)反應(yīng)中難以進(jìn)行的酶催化反應(yīng)。
【附圖說明】
[0026]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0027]圖1是本發(fā)明實(shí)施例一提供的純化后的硫酸胍基丁胺的液相圖，其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)mAU為電信號；
[0028]圖2是本發(fā)明實(shí)施例一提供的精氨酸脫羧酶液重復(fù)利用10次的比活力數(shù)據(jù)圖，其中，橫坐標(biāo)為次數(shù)，縱坐標(biāo)為每毫克酶活力。
【具體實(shí)施方式】
[0029]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0030]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法，該方法包括:以左旋精氨酸作為底物，以精氨酸脫羧酶作為生物轉(zhuǎn)化催化劑，進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成胍基丁胺粗產(chǎn)物，將胍基丁胺粗產(chǎn)物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物。
[0031]具體地，該方法還包括:以磷酸吡哆醛作為輔酶，進(jìn)行脫羧反應(yīng)。
[0032]進(jìn)一步地，精氨酸脫羧酶與左旋精氨酸的質(zhì)量比不超過0.05;磷酸吡哆醛與左旋精氨酸的質(zhì)量比不超過0.002。
[0033]進(jìn)一步地，精氨酸脫羧酶與左旋精氨酸的質(zhì)量比為1:40;磷酸吡哆醛與左旋精氨酸的質(zhì)量比為1:1000。
[0034]具體地，脫羧反應(yīng)的反應(yīng)溫度為19_46°C;脫羧反應(yīng)的反應(yīng)體系的pH值為6-10。
[0035]具體地，精氨酸脫羧酶為經(jīng)過固定化處理后的精氨酸脫羧酶，精氨酸脫羧酶的固定化處理包括如下步驟:
[0036]I)破碎含精氨酸脫羧酶的工程菌細(xì)胞，將工程菌細(xì)胞離心后，收集精氨酸脫羧酶液；
[0037]2)將步驟I)所收集的精氨酸脫羧酶液、添加劑和固定化載體按質(zhì)量比為1:0.6-0.8: 10-13加入pH值為6-8的緩沖溶液中，在25_35°C下恒溫?cái)嚢?_3h，離心后收集固體，得到固定酶載體;其中，緩沖溶液可以為磷酸鹽緩沖溶液;添加劑可以包括硫酸鐵和硫酸鎂中的至少一種；固定化載體可以包括藻土、石英砂、含黏合劑型硅膠(硅膠G)、活性氧化鈣、月旨粉、明膠、氧化鋁和高嶺土中的至少一種；
[0038]3)將步驟2)中得到的固定酶載體用乙醇洗滌1-3次，干燥，即得到固定化處理后的精氨酸脫羧酶。
[0039]進(jìn)一步地，添加劑包括硫酸鐵和硫酸鎂，硫酸鐵和硫酸鎂的質(zhì)量比為1:2;固定化載體為由藻土、石英砂、氧化鋁和明膠組成，藻土、石英砂、氧化鋁和明膠的質(zhì)量比為4:1:1: 3。
[0040 ]具體地，當(dāng)脫羧反應(yīng)進(jìn)行到I h以后，向脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸。
[0041 ]具體地，當(dāng)脫羧反應(yīng)進(jìn)行到第2h時(shí)，向脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸，補(bǔ)加的左旋精氨酸的質(zhì)量為初始所加的左旋精氨酸的質(zhì)量的一半。
[0042]具體地，采用濃度為0.lmol/L的硫酸對胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗產(chǎn)物，即硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物的PH值為4?5。
[0043]具體地，該方法還包括對硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下:
[0044]I)向硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物中加入活性炭，在40 0C?60 0C下放置Ih?2h，再用孔徑為0.45um的過濾膜抽濾，將抽濾后所得的溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除雜質(zhì)，得到硫酸胍基丁胺粗晶體;其中，活性炭的加入量可使黃色的硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物吸附至無色即可。同時(shí)，可利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)和高效液相色譜法(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC)進(jìn)行監(jiān)控，直至底物完全利用；
[0045]2)將步驟I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁