脫羧反應(yīng)進(jìn)行到第2h時(shí)，向脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸，補(bǔ)加的左旋精氨酸的質(zhì)量為初始所加的左旋精氨酸的質(zhì)量的一半。
[0159]具體地，采用濃度為0.lmol/L的硫酸對(duì)胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗產(chǎn)物，即硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物的PH值為4。
[0160]對(duì)硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下:
[0161]I)將乙腈、四氫呋喃、甲醇按體積比為3:4:1混合均勻，得到混合溶劑；
[0162]2)將硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于步驟I)中的混合溶劑中，抽濾，得到硫酸胍基丁胺粗晶體；
[0163]3)將步驟2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過(guò)濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體。
[0164]底物左旋精氨酸的轉(zhuǎn)化率為92.1%，所制備純化的硫酸胍基丁胺晶體的純度達(dá)到98.7%。
[0165]對(duì)比例二
[0166]以左旋精氨酸作為底物，以精氨酸脫羧酶作為生物轉(zhuǎn)化催化劑，以磷酸吡哆醛作為輔酶，進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成胍基丁胺粗產(chǎn)物，將胍基丁胺粗產(chǎn)物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物。精氨酸脫羧酶與左旋精氨酸的質(zhì)量比為1:40;磷酸吡哆醛與左旋精氨酸的質(zhì)量比為1: 1000?？刂品磻?yīng)體系的溫度為35 °C ；控制反應(yīng)體系的pH值為6.5。
[0167]精氨酸脫羧酶為經(jīng)過(guò)固定化處理后的精氨酸脫羧酶，精氨酸脫羧酶的固定化處理包括如下步驟:
[0168]I)破碎含精氨酸脫羧酶的工程菌細(xì)胞，將工程菌細(xì)胞離心后，收集精氨酸脫羧酶液；
[0169]2)將步驟I)所收集的精氨酸脫羧酶液用卡拉膠固定，得到固定化處理后的精氨酸脫羧酶。
[0170]當(dāng)脫羧反應(yīng)進(jìn)行到第2h時(shí)，向脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸，補(bǔ)加的左旋精氨酸的質(zhì)量為初始所加的左旋精氨酸的質(zhì)量的一半。
[0171]對(duì)硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下:
[0172]I)將乙腈、四氫呋喃、甲醇按體積比為3:4:1混合均勻，得到混合溶劑；
[0173]2)將硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于步驟I)中的混合溶劑中，抽濾，得到硫酸胍基丁胺粗晶體；
[0174]3)將步驟2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過(guò)濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體。
[0175]底物左旋精氨酸的轉(zhuǎn)化率為91.1%，所制備純化的硫酸胍基丁胺晶體的純度達(dá)到98.2%。
[0176]對(duì)比例三
[0177]將本發(fā)明實(shí)施例一獲得的硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物采用如下方法進(jìn)行純化，具體純化方法如下:
[0178]對(duì)硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下:
[0179]I)將硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于乙腈中，抽濾，得到硫酸胍基丁胺粗晶體；
[0180]2)將步驟I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過(guò)濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體。
[0181]底物左旋精氨酸的轉(zhuǎn)化率為97.1%，所制備純化的硫酸胍基丁胺晶體的純度達(dá)到96.2%。
[0182]對(duì)比例四
[0183]將本發(fā)明實(shí)施例一獲得的硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物采用如下方法進(jìn)行純化，具體純化方法如下:
[0184]對(duì)硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下:
[0185]I)將硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于四氫呋喃中，抽濾，得到硫酸胍基丁胺粗晶體；
[0186]2)將步驟I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過(guò)濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體。
[0187]底物左旋精氨酸的轉(zhuǎn)化率為97.3%，所制備純化的硫酸胍基丁胺晶體的純度達(dá)到95.9%。
[0188]對(duì)比例五
[0189]將本發(fā)明實(shí)施例一獲得的硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物采用如下方法進(jìn)行純化，具體純化方法如下:
[0190]對(duì)硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下:
[0191 ] I)將硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于甲醇中，抽濾，得到硫酸胍基丁胺粗晶體；
[0192]2)將步驟I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過(guò)濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體。
[0193]底物左旋精氨酸的轉(zhuǎn)化率為97.0%，所制備純化的硫酸胍基丁胺晶體的純度達(dá)到95.8%。
[0194]將實(shí)施例一與對(duì)比例一對(duì)比可知，在固定化處理精氨酸脫羧酶的過(guò)程中，實(shí)施例一添加了添加劑，該添加劑可以提高精氨酸脫羧酶的活性。
[0195]將實(shí)施例一與對(duì)比例二對(duì)比可知，以載體固定精氨酸脫羧酶，精氨酸脫羧酶通過(guò)共價(jià)鍵或物理作用力固定在載體的表面，與底物左旋精氨酸無(wú)障礙接觸，與卡拉膠固定相比，也可以顯著提高底物左旋精氨酸的轉(zhuǎn)化率。
[0196]實(shí)施例一與對(duì)比例三、對(duì)比例四和對(duì)比例五對(duì)比可知，在硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物純化時(shí)，先將硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于乙腈、四氫呋喃、甲醇按體積比為3: 4: I抽濾再洗滌，所得晶體純度更高。
[0197]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法，首先，該方法利用載體固定精氨酸脫羧酶，固定后，精氨酸脫羧酶重復(fù)利用10次后反應(yīng)仍具有酶活，昂貴的酶可以循環(huán)利用，節(jié)省生產(chǎn)成本，并添加硫酸鐵、硫酸鎂等添加劑來(lái)提高酶活。
[0198]其二，本發(fā)明實(shí)施例以乙腈、四氫呋喃、甲醇按體積比為3:4:1的混合溶劑和乙醇純化，使得本發(fā)明實(shí)施例所得的硫酸胍基丁胺晶體純度達(dá)到98.5%以上，可見所得產(chǎn)品具有高純度，同時(shí)，通過(guò)向脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸能夠有效促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，提高產(chǎn)物的收率。
[0199]其三，本發(fā)明實(shí)施例提供的方法工藝流程簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0200]其四，本發(fā)明實(shí)施例提供的方法與單純的化學(xué)法相比，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，成本較低，污染少，且能完成在化學(xué)反應(yīng)中難以進(jìn)行的酶催化反應(yīng)。
[0201]其五，本發(fā)明實(shí)施例在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜法進(jìn)行監(jiān)控，直至底物完全利用。
[0202]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述方法包括:以左旋精氨酸作為底物，以精氨酸脫羧酶作為生物轉(zhuǎn)化催化劑，進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成胍基丁胺粗產(chǎn)物，將所述胍基丁胺粗產(chǎn)物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括:以磷酸吡哆醛作為輔酶，進(jìn)行脫羧反應(yīng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脫羧酶與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比不超過(guò)0.05 ；所述磷酸啦哆醛與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比不超過(guò)0.002。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脫羧酶與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比為1:40;所述磷酸吡哆醛與所述左旋精氨酸的質(zhì)量比為I: 1000。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脫羧反應(yīng)的反應(yīng)溫度為19-46°C;所述脫羧反應(yīng)的反應(yīng)體系的pH值為6-10。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脫羧酶為經(jīng)過(guò)固定化處理后的精氨酸脫羧酶，所述精氨酸脫羧酶的固定化處理包括如下步驟: 1)破碎含所述精氨酸脫羧酶的工程菌細(xì)胞，將所述工程菌細(xì)胞離心后，收集精氨酸脫羧酶液； 2)將步驟I)所收集的所述精氨酸脫羧酶液、添加劑和固定化載體按質(zhì)量比為1:0.6-0.8: 10-13加入pH值為6-8的緩沖溶液中，在25_35°C下恒溫?cái)嚢?_3h，離心后收集固體，得到固定酶載體;其中，所述添加劑包括硫酸鐵和硫酸鎂中的至少一種;所述固定化載體包括藻土、石英砂、含黏合劑型硅膠、活性氧化鈣、脂粉、明膠、氧化鋁和高嶺土中的至少一種； 3)將步驟2)中得到的所述固定酶載體用乙醇洗滌1-3次，干燥，即得到所述固定化處理后的精氨酸脫羧酶。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述添加劑包括硫酸鐵和硫酸鎂，所述硫酸鐵和所述硫酸鎂的質(zhì)量比為1:2;所述固定化載體為由藻土、石英砂、氧化鋁和明膠組成，藻土、石英砂、氧化鋁和明膠的質(zhì)量比為4:1:1: 3。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)脫羧反應(yīng)進(jìn)行到Ih以后，向所述脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)脫羧反應(yīng)進(jìn)行到第2h時(shí)，向所述脫羧反應(yīng)補(bǔ)加左旋精氨酸，補(bǔ)加的左旋精氨酸的質(zhì)量為初始所加的左旋精氨酸的質(zhì)量的一半。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，所述純化步驟如下: 1)向所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物中加入活性炭，在40°c?60°C下放置Ih?2h，再用孔徑為0.45um的過(guò)濾膜抽濾，將抽濾后所得的溶液蒸發(fā)去除雜質(zhì)，得到硫酸胍基丁胺粗晶體； 2)將步驟I)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過(guò)濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體； 或者所述純化步驟如下: 1)將乙腈、四氫呋喃、甲醇按體積比為2.5?3.5:3.5?5:1混合均勻，得到混合溶劑； 2)將所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物溶于步驟I)中的所述混合溶劑中，其中，所述硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物與所述混合溶劑的質(zhì)量比為1:8?13，抽濾，得到硫酸胍基丁胺粗晶體； 3)將步驟2)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶體用乙醇洗滌，過(guò)濾并干燥后，得到純化的硫酸胍基丁胺晶體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種硫酸胍基丁胺的生物轉(zhuǎn)化方法，屬于醫(yī)藥中間體領(lǐng)域。所述方法包括：以左旋精氨酸作為底物，以精氨酸脫羧酶作為生物轉(zhuǎn)化催化劑，進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成胍基丁胺粗產(chǎn)物，將所述胍基丁胺粗產(chǎn)物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗產(chǎn)物。所述方法工藝流程簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，該方法與單純的化學(xué)法相比，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，成本較低，污染少，且能完成在化學(xué)反應(yīng)中難以進(jìn)行的酶催化反應(yīng)。
【IPC分類】C12N11/14, C12P13/00, C07C279/12, C07C277/08
【公開號(hào)】CN105713938
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610181488
【發(fā)明人】陳建華
【申請(qǐng)人】江漢大學(xué)
【公開日】2016年6月29日
【申請(qǐng)日】2016年3月28日