專利名稱：獲得肌成纖維細(xì)胞的方法
獲得肌成纖維細(xì)胞的方法本發(fā)明涉及獲得肌成纖維細(xì)胞的方法。在下面的說明書中，方括號(hào)([])中的參考文獻(xiàn)是指在文本的末端所給出的參考文獻(xiàn)的列表。肌成纖維細(xì)胞代表稱為CAF、“與癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞”(換而言之與癌相關(guān)聯(lián)的成纖維細(xì)胞)的特定類型的成纖維細(xì)胞。其還牽涉在各種生物過程，比如例如組織的重構(gòu)中。其表達(dá)平滑肌α -肌動(dòng)蛋白或SMA標(biāo)志物。在下文中，術(shù)語成纖維細(xì)胞是在廣義上使用。它不僅將這里“嚴(yán)格意義上”稱為成纖維細(xì)胞的成纖維細(xì)胞歸在一起，而且還將成纖維細(xì)胞的衍生物比如激活的成纖維細(xì)胞、 CAF及肌成纖維細(xì)胞也歸在了一起。因此，包括腫瘤性過程中牽涉的成纖維細(xì)胞，還包括其中涉及肌成纖維細(xì)胞的任何其它生物過程中牽涉的那些成纖維細(xì)胞。尤其，通過腫瘤的酶消化，不論是否接著一個(gè)或多于一個(gè)的純化步驟，從腫瘤獲取成纖維細(xì)胞是已知的(Orimo 等，Cell 2005,121 :335-348 [1]或 Allinen 等，Cancer Cell 2004,6 :17-32[2])。迄今，成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物已經(jīng)在含血清的培養(yǎng)基(通常5-20%血清)中獲得，且培養(yǎng)物含有可變百分比的肌成纖維細(xì)胞。例如，在含有5%血清的培養(yǎng)基中的CAF(Asterand)可從市場(chǎng)上購得，比如其通過簡(jiǎn)單的目視檢查來確定。學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室在含有10%血清的培養(yǎng)基中生產(chǎn)出了 CAF的群體。通過平滑肌α -肌動(dòng)蛋白標(biāo)志物的測(cè)量來確定這些細(xì)胞的表型。因此，這些群體含有可變百分比的CAF，最多平均30%。從市場(chǎng)上還可購得在含有20%血清的培養(yǎng)基中的人肝臟肌成纖維細(xì)胞(Dominion Wiarmakine)，只有50-60%的肌成纖維細(xì)胞表達(dá)平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(SMA)標(biāo)志物。在肝臟中及也在胰腺中，衍生肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞是星狀細(xì)胞，其具有在培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出自發(fā)激活 SMA 標(biāo)志物的表達(dá)的特定性質(zhì)(Kinnman 等，Lab Invest 2001,81 1709-1716 [3] ；Omary 等，JCI 2007，117 50-59 [4]) ο然而，血清例如胎牛血清或新生小牛血清的使用具有以下缺點(diǎn)-與血清的收集有關(guān)的倫理問題，-血清是組成可變的生物學(xué)液體，-血清的確切組成是未知的，不可能準(zhǔn)確地確定細(xì)胞的需求，-血清含有可干擾在制藥工業(yè)中對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞使用的測(cè)試的因子(生長(zhǎng)因子， 拮抗劑等)，-當(dāng)血清從培養(yǎng)基中省去時(shí)，適應(yīng)了在血清中生長(zhǎng)的細(xì)胞改變表型或死亡。簡(jiǎn)而言之，迄今已知且在體外研究的從病理組織中分離的成纖維細(xì)胞的群體-是異質(zhì)的，-含有可變百分比的肌成纖維細(xì)胞，及-在含有血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，血清的存在具有上述的缺點(diǎn)。
在本文中，本發(fā)明所解決的主要目的是獲得肌成纖維細(xì)胞的群體，其特征在于便于這些細(xì)胞的任何研究，及尤其是獲得盡可能純的肌成纖維細(xì)胞群體。出于該目的，本發(fā)明涉及獲得肌成纖維細(xì)胞的方法，特征在于(a)制備基本上包括成纖維細(xì)胞的細(xì)胞樣品；及(b)將所述細(xì)胞樣品在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。基本上包括成纖維細(xì)胞的細(xì)胞樣品表示其包含的細(xì)胞至少50%是成纖維細(xì)胞，優(yōu)選地至少70%。無論如何，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道如何通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施細(xì)胞樣品必須包含的成纖維細(xì)胞的百分比。本發(fā)明具有生產(chǎn)比現(xiàn)有技術(shù)的那些更純的肌成纖維細(xì)胞的群體且該群體生長(zhǎng)在不含血清的培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)。因此，通過根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的肌成纖維細(xì)胞使得例如準(zhǔn)確地且可重現(xiàn)性地研究這些細(xì)胞的生物學(xué)并鑒定潛在的治療靶標(biāo)成為可能。由于缺少血清，其還使得研究細(xì)胞的需求及確定因子成為可能，例如誘導(dǎo)其分化、 使其能維持其表型、保持其增殖和/或牽涉在這些細(xì)胞的過早衰老中的因子。在無血清的培養(yǎng)基中一代或兩代后，用根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的肌成纖維細(xì)胞的群體可總共達(dá)到多于95%的肌成纖維細(xì)胞。無血清的培養(yǎng)基優(yōu)選地包括為用于上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。事實(shí)上，從這樣的基礎(chǔ)培養(yǎng)基所獲得的培養(yǎng)基使得獲得生長(zhǎng)良好的肌成纖維細(xì)胞成為可能。這一無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基尤其可以是用于人乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。選擇性地，例如，這可以是已知用于支氣管、胎盤或腎臟上皮細(xì)胞的培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。這一無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基可用一種或多于一種的典型地用于細(xì)胞培養(yǎng)的補(bǔ)充物補(bǔ)充。作為補(bǔ)充物的實(shí)例，可引用激素、生長(zhǎng)因子、絲裂原及抗生素。因此，它可包含例如至少一種選自胰島素、皮質(zhì)醇、上皮生長(zhǎng)因子或EGF、牛垂體浸膏或ΒΡΕ、及抗生素的補(bǔ)充物。抗生素對(duì)于細(xì)胞的良好生長(zhǎng)不是必需的，但是其存在防止微生物污染?？股乜梢允抢绨☉c大霉素和兩性霉素B或normocin的GA-1000。在細(xì)胞培養(yǎng)中常用的任何抗生素可用于本發(fā)明，及，例如，可引用青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、卡那霉素及泰樂菌素。例如，根據(jù)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基可以是用于人乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，比如可從市場(chǎng)上購得的名為MEGM(乳腺上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基)的培養(yǎng)基(Cambrex)。選擇性地，例如，這可以是已知用于支氣管、胎盤或腎臟上皮細(xì)胞的培養(yǎng)的無血清
培養(yǎng)基。MEGM的起始配方是培養(yǎng)基MCDB 170的配方(Hammond等，PNAS1984，81 5435-5439 [5] )0開發(fā)了這一培養(yǎng)基MCDB 170，隨后是MEGM，且迄今特定地用于正常人乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。在本發(fā)明中，這種培養(yǎng)基的使用對(duì)于肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)是特別有利的。它由基礎(chǔ)培養(yǎng)基，即確切配方已知的名為MEBM的培養(yǎng)基(乳腺上皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基)， 和5種補(bǔ)充物胰島素、皮質(zhì)醇、EGF、牛垂體浸膏和抗生素GA-1000組成。乙醇胺和磷酸乙醇胺是包括在MCDB 170的基礎(chǔ)配方中及包括在MEGM中的脂質(zhì)前體?？捎糜诒景l(fā)明的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基的又一實(shí)例如表1所示。左邊一欄列出了包含在這種培養(yǎng)基的組成中的產(chǎn)品。右邊一欄顯示了，對(duì)于每一種產(chǎn)品，其在培養(yǎng)基中的摩爾濃度，以每升培養(yǎng)基中的摩爾計(jì)。事實(shí)上，這種無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括1 1比例的DMEM培養(yǎng)基和 HamF 12 (Invitrogen)培養(yǎng)基的混合物。這種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，與EGF(P^rotech)、皮質(zhì)醇(SIGMA)、BPE(Invitrogen)、包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒的ITS-X(Invitrogen)及抗生素比如normocin(Invitrogen)混合，提供了可用于本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基。所獲得的培養(yǎng)基稱為“無血清DMEM/HamF12培養(yǎng)基”。DMEM 的組合物和 HamF 12 的組成是例如在 R. Ian Freshney,"Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique (動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng).基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè))”，2005 B]中指出的那些。表 權(quán)利要求
1.用于獲得肌成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于(a)制備基本上包括成纖維細(xì)胞的細(xì)胞樣品；及(b)將所述細(xì)胞樣品在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基是用于乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無血清培養(yǎng)基還含有至少一種選自胰島素、皮質(zhì)醇、EGF、牛垂體浸膏及抗生素的補(bǔ)充物。
3.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括 -從生物樣品比如生物組織獲得細(xì)胞懸液；然后-在有利于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞，例如在含有血清的培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括 -從生物樣品比如生物組織獲得細(xì)胞懸液；然后-純化細(xì)胞亞群以獲得基本上包括成纖維細(xì)胞的所述細(xì)胞樣品。
5 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述生物樣品是腫瘤，優(yōu)選地是癌。
6.如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品含有肌成纖維細(xì)胞。
7.通過權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法所獲得的肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，其含有的細(xì)胞至少80%是肌成纖維細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其是無血清的。
9.如權(quán)利要求7或8所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中其含有的細(xì)胞至少95%是肌成纖維細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法的用途，用于獲得其中細(xì)胞包括至少80%的肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述細(xì)胞是在無血清培養(yǎng)基中。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述細(xì)胞包括至少95%的肌成纖維細(xì)胞。
13.無血清培養(yǎng)基的用途，所述無血清培養(yǎng)基是為了人乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)而開發(fā)的， 用于從基本上包括成纖維細(xì)胞的細(xì)胞樣品中獲得肌成纖維細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述無血清培養(yǎng)基含有至少一種選自胰島素、皮質(zhì)醇、EGF、牛垂體浸膏及抗生素的補(bǔ)充物。
全文摘要
本發(fā)明涉及獲得肌成纖維細(xì)胞的方法。根據(jù)所述方法(a)制備基本上包括成纖維細(xì)胞的細(xì)胞樣品；及(b)將所述細(xì)胞樣品在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的主要目的是獲得肌成纖維細(xì)胞的群體，其特征為能夠研究所述細(xì)胞，及尤其是獲得具有最高的可能的肌成纖維細(xì)胞純度的群體?？蓪?shí)施本發(fā)明用于尤其以下用途肌成纖維細(xì)胞生物標(biāo)志物的鑒定，治療靶標(biāo)的鑒定，抗腫瘤化合物的鑒定和驗(yàn)證，用于藥物化合物或化妝用化合物的篩選的體外模型。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102471761SQ201080032436
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日
發(fā)明者尼古拉斯·雅克·魯耶, 羅伯特·巴塞爾 申請(qǐng)人:昂科生物技術(shù)公司