專利名稱：檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是由垂體和下丘腦分泌的多肽，廣泛存在于神經(jīng)組織、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。作為一種廣譜有絲分裂原，其具有極強(qiáng)的生物活性①對(duì)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層的各種細(xì)胞均有促增殖作用、趨化作用和促細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)作用；②能促進(jìn)剖面毛細(xì)血管新生，改善了微循環(huán)和組織的營(yíng)養(yǎng)狀況，同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞的增殖，使肉芽迅速生長(zhǎng)；③增強(qiáng)源于中胚層的免疫細(xì)胞的活性，提高剖面的抗感染能力。研究表明，bFGF在機(jī)體內(nèi)參與多種組織的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程，是機(jī)體內(nèi)重要的創(chuàng)傷愈合因子之一。創(chuàng)傷后bFGF的含量高低能直接反映創(chuàng)面修復(fù)中的血管生成水平，為檢測(cè)和監(jiān)測(cè)創(chuàng)傷修復(fù)和組織愈合情況等提供依據(jù)。在臨床上，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可用于治療顱腦、脊髓、周?chē)窠?jīng)損傷，中毒， 感染，腦出血、腦梗塞、腦萎縮、腦發(fā)育不良，角膜潰瘍，神經(jīng)性耳聾，面癱，粘膜、皮膚損傷， 燒傷，慢性潰瘍，軟組織損傷，內(nèi)臟損害，骨折，一些內(nèi)分泌疾病，斷肢再植和各種手術(shù)后的傷口愈合等。bFGF可以促進(jìn)損傷愈合，大大縮短病程，改善預(yù)后，但迄今對(duì)于損傷創(chuàng)面中原發(fā)bFGF含量的檢測(cè)方法不多，且檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)限和抗干擾能力等亟待提高。目前，有關(guān) bFGF免疫檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)告和相關(guān)專利技術(shù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少，迫切需要開(kāi)發(fā)高效、準(zhǔn)確、 快速的新型免疫檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)狀，旨在提供一種用于檢測(cè)靈敏度較高，且操作簡(jiǎn)單、 重復(fù)性強(qiáng)，最低檢測(cè)限為mbFGF蛋白60pg/ml的檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)方式為，一檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球，是用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，用羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)方法偶聯(lián)抗 mbFGF多克隆抗體獲得的免疫膠乳微球，是由抗mbFGF蛋白多克隆抗體包被的微球，微球顆粒大小50nm。檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的制備方法，具體步驟如下(1)根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)小鼠bFGF基因表達(dá)序列；(2)將小鼠bFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST基因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；
所述谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因融合表達(dá)載體是PGEX-4T-3，構(gòu)建完成后的融合表達(dá)載體是 pGEX-4T-3-mbFGF ；(3)對(duì)細(xì)菌融合表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-mbFGF 融合蛋白；所述親合層析柱為Glutathione Sepharose 4B ；(4)利用凝血酶在柱切割GST-mbFGF融合蛋白，洗脫物經(jīng)親合層析柱去除凝血酶后，獲得小鼠 bFGF ；親合層析柱為 Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow (5)將弗氏佐劑溶合抗原后免疫兔，經(jīng)分離純化得到兔抗mbFGF多克隆抗體；所述抗原為mbFGF蛋白；(6)將步驟(5)所得到的兔抗mbFGF多克隆抗體，通過(guò)羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球；所述微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面載基團(tuán)為羧基，所述微球的活化是首先用活化劑碳化二亞胺活化微球，然后加入保護(hù)劑 Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子。檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的的應(yīng)用，通過(guò)酶標(biāo)儀， 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，檢測(cè)mbFGF樣品的bFGF。本發(fā)明采用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，用羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)方法偶聯(lián)抗mbFGF多克隆抗體獲得免疫膠乳微球，取材簡(jiǎn)單、操作方便；制備方法細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)，重復(fù)性高；所制備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)最低檢測(cè)限為重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子60pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 96。


圖1是羧基化聚苯乙烯微球掃描電鏡照片，圖2是mbFGF基因原序列，圖3是菌落PCR驗(yàn)證mbFGF基因插入片段電泳，
圖4是質(zhì)粒)(ba I酶切電泳，圖5是mbFGF表達(dá)載體測(cè)序，圖 6 是 mbFGF 蛋白 SDS-PAGE(A)和 Western Blotting(B)檢測(cè)，圖7是抗血清效價(jià)測(cè)定圖，圖8是ELISA法檢測(cè)mbFGF實(shí)物圖，圖9是ELISA法檢測(cè)mbFGF蛋白結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一種檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球是用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，用羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)方法偶聯(lián)抗mbFGF多克隆抗體獲得如圖1所示的的免疫膠乳微球。免疫膠乳微球由抗mbFGF蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小50nm。下面詳述一種檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的制備方法，具體步驟如下1、根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)小鼠bFGF基因表達(dá)序列，其具體步驟為(1)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)mbFGF基因序列，根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾，采用全基因合成技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)mbFGF基因，共462對(duì)堿基，克隆至載體pGEM_T Easy，結(jié)果如圖2所示。(2)通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證mbFGF基因片斷插入的正確性，結(jié)果如圖3所示。(3)將克隆mbFGF基因菌實(shí)施擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切和瓊脂糖電泳分析， 結(jié)果如圖4所示。(5)DNA測(cè)序，保證基因的全部序列100%準(zhǔn)確，結(jié)果如圖5所示。2、將小鼠bFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶GST基因融合表達(dá)載體PGEX-4T-3中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體pGEX-4T-3-mbFGF，具體的操作步驟如下(1)將mbFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入pGEX-4T-3載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體 pGEX-4T-3-mbFGF ；(2)將融合表達(dá)載體pGEX-4T-3-mbFGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)條件為200轉(zhuǎn)/分，溫度37°C ；(3)當(dāng)菌體生長(zhǎng)OD595值為0. 5-0. 8時(shí)，加入1. OmM的誘導(dǎo)劑IPTG，在25°C誘導(dǎo)2-3 小時(shí)。在4°C時(shí)，以5，OOOXg離心5分鐘，收集菌體；(4)菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗3次后，超聲破碎。破碎細(xì)胞在4°C時(shí)，以15，000 X g 離心1小時(shí)，收集上清液；(5)將上清循環(huán)通過(guò)Glutathione Sepharose 4B親合層析柱，4°C過(guò)夜。未結(jié)合蛋白用10倍床體積的1 XPBS沖洗；(6)將結(jié)合的GST-mbFGF融合蛋白用凝血酶在柱切割并用洗脫液洗脫，收集洗脫物；(7)將上述洗脫物通過(guò)Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow親合層析柱吸附凝血酶，經(jīng)洗脫后獲得蛋白抗原mbFGF。3、將弗氏佐劑溶合抗原后免疫兔，經(jīng)分離純化得到兔抗mbFGF多克隆抗體，具體的制備步驟如下(1)將mbFGF蛋白抗原與弗氏佐劑混合后，充分乳化。采用背部多點(diǎn)注射法免疫家兔。每次免疫的抗原量約100 μ g，免疫三次。每次免疫兩周后經(jīng)耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。(2)以500 μ g/ml濃度的抗原包被酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C過(guò)夜；(3)洗滌后，加入待檢的血清樣品，100 μ 1/孔，37°C 1小時(shí)；設(shè)陰性對(duì)照孔；(4)洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG的抗體試劑，100 μ 1/孔，37°C避光顯色20 分鐘；用2. 5M H2SO4終止反應(yīng)后，閱讀各孔的A490值。對(duì)制備的mbFGF抗體，經(jīng)ELISA法檢測(cè)，抗體能與mbFGF特異性結(jié)合，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到顯著水平，效價(jià)>1 6000，結(jié)果如圖7所示。4、兔抗mbFGF多克隆抗體通過(guò)羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球mbFGF抗體制備完成后，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)單分散羧基化聚苯乙烯微球，制備用于檢測(cè)mbFGF蛋白的免疫膠乳微球，具體的制備和檢測(cè)步驟如下
(1)將單分散羧基化聚苯乙烯微球用活化劑EDC(碳化二亞胺)活化，然后加入保護(hù)劑Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體；(2)加入抗mbFGF多克隆抗體，溫育1-2小時(shí)；(3)洗滌后，收集免疫微球；(4)通過(guò)酶標(biāo)儀，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法，檢測(cè)mbFGF樣品(如圖8所示)°經(jīng)ELISA方法驗(yàn)證，用于檢測(cè)mbFGF的免疫膠乳微球最低檢測(cè)限為重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子60pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 96，結(jié)果如圖9所示。由此可見(jiàn)，本發(fā)明所制備的用于檢測(cè)mbFGF的免疫膠乳微球檢測(cè)靈敏度較高，且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)，顯示了良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球，其特征在于是用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，用羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)方法偶聯(lián)抗mbFGF多克隆抗體獲得的免疫膠乳微球，是由抗mbFGF蛋白多克隆抗體包被的微球，微球顆粒大小50nm。
2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)小鼠bFGF基因表達(dá)序列；(2)將小鼠bFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST基因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；所述谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因融合表達(dá)載體是PGEX-4T-3，構(gòu)建完成后的融合表達(dá)載體是 pGEX-4T-3-mbFGF ；(3)對(duì)細(xì)菌融合表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-mbFGF融合蛋白；所述親合層析柱為Glutathione Sepharose 4B ；(4)利用凝血酶在柱切割GST-mbFGF融合蛋白，洗脫物經(jīng)親合層析柱去除凝血酶后，獲 H^Ml bFGFBenzamidine Sepharose 4B Fast Flow (5)將弗氏佐劑溶合抗原后免疫兔，經(jīng)分離純化得到兔抗mbFGF多克隆抗體；所述抗原為mbFGF蛋白；(6)將步驟( 所得到的兔抗mbFGF多克隆抗體，通過(guò)羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球；所述微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面載基團(tuán)為羧基，所述微球的活化是首先用活化劑碳化二亞胺活化微球，然后加入保護(hù)劑Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)小鼠bFGF基因表達(dá)序列的具體步驟為(1)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)mbFGF基因序列，根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾，采用全基因合成技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)mbFGF基因，共462對(duì)堿基，克隆至載體pGEM-T Easy，結(jié)果如圖2所示。(2)通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證mbFGF基因片斷插入的正確性，結(jié)果如圖3所示。(3)將克隆mbFGF基因菌實(shí)施擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切和瓊脂糖電泳分析，結(jié)果如圖4所示。(5) DNA測(cè)序，保證基因的全部序列100%準(zhǔn)確
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于將小鼠bFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST 基因融合表達(dá)載體PGEX-4T-3中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體pGEX-4T-3-mbFGF的具體操作步驟如下(1)將mbFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入pGEX-4T-3載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體 pGEX-4T-3-mbFGF ；(2)將融合表達(dá)載體pGEX-4T-3-mbFGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)條件為 200轉(zhuǎn)/分，溫度37°C ；(3)當(dāng)菌體生長(zhǎng)OD595值為0.5-0. 8時(shí)，加入1. OmM的誘導(dǎo)劑IPTG，在25°C誘導(dǎo)2-3小時(shí)。在4°C時(shí)，以5，OOOXg離心5分鐘，收集菌體；(4)菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗3次后，超聲破碎。破碎細(xì)胞在4°C時(shí)，以15，OOOXg離心 1小時(shí)，收集上清液；(5)將上清循環(huán)通過(guò)GlutathioneSepharose 4B親合層析柱，4°C過(guò)夜。未結(jié)合蛋白用 10倍床體積的IXPBS沖洗；(6)將結(jié)合的GST-mbFGF融合蛋白用凝血酶在柱切割并用洗脫液洗脫，收集洗脫物；(7)將上述洗脫物通過(guò)BenzamidineSepharose 4B Fast Flow親合層析柱吸附凝血酶，經(jīng)洗脫后獲得蛋白抗原mbFGF。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于將弗氏佐劑溶合抗原后免疫兔，經(jīng)分離純化得到兔抗mbFGF多克隆抗體的具體制備步驟如下(1)將mbFGF蛋白抗原與弗氏佐劑混合后，充分乳化。采用背部多點(diǎn)注射法免疫家兔。 每次免疫的抗原量約100 μ g，免疫三次。每次免疫兩周后經(jīng)耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。(2)以500μ g/ml濃度的抗原包被酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C過(guò)夜；(3)洗滌后，加入待檢的血清樣品，100μ1/孔，37°C 1小時(shí)；設(shè)陰性對(duì)照孔；(4)洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG的抗體試劑，100μ 1/孔，37°C避光顯色20分鐘；用2. 5M H2SO4終止反應(yīng)后，閱讀各孔的A490值。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于兔抗mbFGF多克隆抗體通過(guò)羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的具體制備步驟如下(1)將單分散羧基化聚苯乙烯微球用活化劑活化，然后加入保護(hù)劑 Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體；(2)加入抗mbFGF多克隆抗體，溫育1-2小時(shí)；(3)洗滌后，收集檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球。
7.權(quán)利要求1所述所述的檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)酶標(biāo)儀，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，檢測(cè)mbFGF樣品的bFGF。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)重組小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫膠乳微球及其制備方法和應(yīng)用。免疫膠乳微球由抗mbFGF蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒50nm；制備方法是，根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)mbFGF基因表達(dá)序列，將基因序列通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因融合表達(dá)載體中并進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)，利用親合層析柱純化和凝血酶在線切割獲得mbFGF蛋白，再將佐劑溶合抗原后免疫家兔，經(jīng)分離純化得到抗mbFGF多克隆抗體，將抗體通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化后的微球，得到檢測(cè)mbFGF蛋白的免疫膠乳微球。應(yīng)用是，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，檢測(cè)mbFGF蛋白樣品，最低檢測(cè)限為mbFGF蛋白60pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2＝0.96；本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C07K14/50GK102432685SQ20111033954
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者關(guān)瀟, 吳剛, 李俊生, 潘衛(wèi)東, 肖能文, 趙彩云, 陳法軍 申請(qǐng)人:中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院