專利名稱：愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及果汁原料中的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的檢測方法及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
已知在用作果汁飲料和果汁加工食品的原料的果汁中，可能含有即使在通常的酸性飲料或食品的加熱殺菌條件下也能生存的耐熱性嗜酸菌(TAB)。在代表性耐熱性嗜酸菌即 Alicyclobacillus 屬的細(xì)菌中，已知 Alicyclobacillus acidoterrestris (AAT)及 Alicyclobacillus acidiphiIus (AAP)為愈創(chuàng)木酌·產(chǎn)生菌(以下稱作愈創(chuàng)木酌■產(chǎn)生菌)。特別是有報道指出AAT菌經(jīng)由香草醛及香草酸產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚(果汁協(xié)會報2005年12月號，P. 1-15 ;非專利文獻(xiàn)2)。愈創(chuàng)木酚雖沒有毒性，但具有異臭，所以產(chǎn)品中含有愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌時，飲料的風(fēng)味顯著惡化。特別是原料果汁中的AAT經(jīng)常被視為問題。因此，檢查原料果汁和果汁飲料產(chǎn)品中的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的存在，在原料及產(chǎn)品的品質(zhì)管理中非常重要。作為AAT的檢測方法，已知下述方法在添加有香草醛的液體培養(yǎng)基中添加果汁飲料進(jìn)行培養(yǎng)，利用感官檢查確認(rèn)愈創(chuàng)木酚的臭氣的方法(日本特開平7-123998;專利文獻(xiàn)I);在香草酸的存在下培養(yǎng)含有試樣的培養(yǎng)液，進(jìn)一步通過使用過氧化物酶法的處理使生成的愈創(chuàng)木酚顯色，通過定性或使用特別裝置的分光定量分析確認(rèn)愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的存在的方法(日本特開2004-201668 ;專利文獻(xiàn)2);使用對于愈創(chuàng)木酚生成酶基因特異性的引物，通過PCR檢測的方法(日本特開2003-000259 ;專利文獻(xiàn)3)等。目前廣泛使用的AAT的檢測方法基于上述專利文獻(xiàn)2的技術(shù)，是一種過氧化物酶法，即，在含有香草酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)試樣,檢測所生成的愈創(chuàng)木酚，由此間接地辨別有無AAT。但是，在過氧化物酶法中，為了在液體培養(yǎng)基中使AAT增殖，需要適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)，因此操作變得煩雜，需要花費時間來得到結(jié)果。例如，為了定量地檢測試樣的AAT，首先在平板培養(yǎng)基中形成菌落，選擇多個菌落，將各個菌落進(jìn)一步在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這是煩雜的操作且需要4 6天的時間。進(jìn)而，使用過氧化物酶法辨別有無AAT時，在過氧化物酶的作用下使愈創(chuàng)木酚轉(zhuǎn)化為四愈創(chuàng)木酚，染成棕色，由此進(jìn)行辨別，因此，在試樣為接近該色調(diào)的橙汁等的原料或培養(yǎng)基時，難以辨別。由于顏色也受到原料的不同批量和培養(yǎng)基的高壓滅菌器條件等的影響，所以為了通過目視進(jìn)行比色判定，需要判定者相當(dāng)熟練。另外，為了正確的判定，對每個試樣及每個培養(yǎng)基制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上，需要用分光光度計進(jìn)行分析、或用GC-MS進(jìn)行分析，因此還需要昂貴的分析儀器和煩雜的操作。另一方面，作為使用固體培養(yǎng)基的方法已知有30°C培養(yǎng)法，其原理是根據(jù)培養(yǎng)溫度進(jìn)行愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌和愈創(chuàng)木酚非產(chǎn)生菌的分選。例如，在低于AAT的生長最佳溫度(40 50°C )的30°C下進(jìn)行培養(yǎng)，確認(rèn)菌落的有無。但是，由于在30°C培養(yǎng)時AAT的生長也下降，所以不僅AAT的檢測靈敏度下降，而且有時也檢測出生長溫度區(qū)域低的對象外的愈創(chuàng)木酚非產(chǎn)生菌。因此，進(jìn)行30°C培養(yǎng)法時，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，提高AAT的檢測靈敏度，此時，所有步驟需要花費8 10天的時間，并且選擇性也不能說很充分。進(jìn)而，由于進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，所以存在不能得到定量性的問題。進(jìn)而，已知柑橘類的水果和葡萄中含有的多酚類等成分抑制AAT的增殖。因此，檢查100%果汁等果汁濃度高的原料時，需要適當(dāng)稀釋試樣進(jìn)行試驗。例如，如果為橙汁時稀釋至I %進(jìn)行試驗，但需要根據(jù)果汁的種類和產(chǎn)地研究稀釋率，這使上述各試驗的操作更加復(fù)雜。因此，人們謀求一種不需要復(fù)雜的操作、昂貴的儀器或操作者的熟練度、且能在短時間內(nèi)正確判斷原料果汁中是否存在愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的方法。還需要在果實生產(chǎn)地和果汁原料制造設(shè)施中也能檢查的簡便方法。 本說明書中引用的參考文獻(xiàn)如下所述。下述文獻(xiàn)中記載的內(nèi)容全部作為參照引入本說明書中。專利文獻(xiàn)I :日本特開平7-123998專利文獻(xiàn)2 :日本特開2004-201668專利文獻(xiàn)3 日本特開2003-000259非專利文獻(xiàn)I 耐熱性嗜酸菌統(tǒng)一檢查法手冊”，社團(tuán)法人日本果汁協(xié)會，2005年P(guān). 25非專利文獻(xiàn)2 :果汁協(xié)會報2005年12月號p. 1-1
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于檢測果汁原料等試樣中存在的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的、迅速且簡便的方法。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過使用以特定的濃度范圍含有具有甲氧基苯酚骨架的化合物的固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌能夠選擇性地增殖，形成菌落。通過檢測固體培養(yǎng)基上的菌落形成，能簡便地檢測被檢試樣中是否存在愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌，進(jìn)而通過計算菌落，能簡便地測定被檢試樣中存在的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的數(shù)量。本發(fā)明提供了一種試樣中的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的檢測方法，其特征在于，在含有一種以上下式表示的化合物的嗜酸菌用固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)試樣或其稀釋物，檢測所形成的菌落，
權(quán)利要求
1.一種試樣中的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的檢測方法，其特征在于，在含有I種以上下式表示的化合物的嗜酸菌用固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)試樣或其稀釋物，檢測所形成的菌落，
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有I種以上的下述化合物香草醛、香草酸、阿魏酸、愈創(chuàng)木酚、4-羥基-3-甲氧基苯丙烯醛、4-羥基-3-甲氧基苯基丙酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醇、甲氧基對苯二酚、4-羥基-3-甲氧基苯乙醛及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有香草醛、香草酸或阿魏酸。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項所述的方法，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上的香草酸、500ppm以上的香草醛或25ppm以上的阿魏酸。
5.如權(quán)利要求I 3中任一項所述的方法，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上、225ppm以下的香草酸。
6.如權(quán)利要求I 3中任一項所述的方法，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上、75ppm以下的香草酸。
7.如權(quán)利要求I 6中任一項所述的方法，其中，所述培養(yǎng)在20°C 55°C下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述培養(yǎng)在27°C 33°C下進(jìn)行。
9.一種用于檢測試樣中的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的試劑盒，所述試劑盒含有經(jīng)滅菌的嗜酸菌用固體培養(yǎng)基，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有I種以上下式表示的化合物，
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有I種以上的下述化合物香草醛、香草酸、阿魏酸、愈創(chuàng)木酚、4-羥基-3-甲氧基苯丙烯醛、4-羥基-3-甲氧基苯基丙酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醇、甲氧基對苯二酚、4-羥基-3-甲氧基苯乙醛及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。
11.如權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有香草醛、香草酸或阿魏酸。
12.如權(quán)利要求9 11中任一項所述的試劑盒，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上的香草酸、500ppm以上的香草醒或25ppm以上的阿魏酸。
13.如權(quán)利要求9 11中任一項所述的試劑盒，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上、225ppm以下的香草酸。
14.如權(quán)利要求9 11中任一項所述的試劑盒，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上、75ppm以下的香草酸。
15.—種愈創(chuàng)木酹產(chǎn)生菌檢測培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基由含有I種以上下式表不的化合物的嗜酸菌用固體培養(yǎng)基構(gòu)成，
16.如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有I種以上的下述化合物香草醛、香草酸、阿魏酸、愈創(chuàng)木酚、4-羥基-3-甲氧基苯丙烯醛、4-羥基-3-甲氧基苯基丙酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醇、甲氧基對苯二酚、4-羥基-3-甲氧基苯乙醛及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。
17.如權(quán)利要求15或16所述的培養(yǎng)基，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有香草醛、香草酸或阿魏酸。
18.如權(quán)利要求15 17中任一項所述的培養(yǎng)基，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上的香草酸、500ppm以上的香草醒或25ppm以上的阿魏酸。
19.如權(quán)利要求15 17中任一項所述的培養(yǎng)基，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上、225ppm以下的香草酸。
20.如權(quán)利要求15 17中任一項所述的培養(yǎng)基，其中，所述嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上、75ppm以下的香草酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種試樣中的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的檢測方法，其特征在于，在含有1種以上的下式[式中，R為-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3的烷基或C1-C3的鏈烯基，該烷基及鏈烯基可以被-OH、-C(O)H或-COOH取代]表示的化合物的嗜酸菌用固體培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)試樣或其稀釋物，檢測形成的菌落。優(yōu)選的例子中，嗜酸菌用固體培養(yǎng)基含有50ppm以上的香草酸，平板培養(yǎng)在20℃～55℃下進(jìn)行。本發(fā)明還提供用于檢測試樣中的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌的嗜酸菌用固體培養(yǎng)基及試劑盒。根據(jù)本發(fā)明，能夠通過迅速且簡便的方法檢測果汁原料等試樣中存在的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌。
文檔編號C12Q1/04GK102803503SQ20108003260
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日
發(fā)明者村上弘晃, 高瀨雅典 申請人:卡爾皮斯株式會社