幽門螺桿菌定性和定量多重基因檢測體系及其試劑盒和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多重基因檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測體系，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 幽門螺桿菌(H.pylori)是一種革蘭陰性、微需氧、彎曲狀桿菌，主要寄居在人體胃 部。幽門螺桿菌感染與慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤和胃癌等 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此引起臨床的廣泛關(guān)注。1994年，國際癌癥研究機構(gòu)IARC已將其列為 人類I類致癌因子，是目前為止唯一被列為明確對人類致癌的細菌性病原微生物。很多報告 認為幽門螺桿菌感染與冠心病、類風濕、肝膽病、肺結(jié)核、妊娠嘔吐、直結(jié)腸癌及多種皮膚病 等疾病有關(guān)。流行病學顯示，全球幾乎有一半的人口感染此菌，發(fā)展中國家甚至高達60%~ 70%。因此，幽門螺桿菌感染是世界各國需要面對的公共衛(wèi)生問題。
[0003] 幽門螺桿菌致病性與其感染量密切相關(guān)。目前幽門螺桿菌檢測和鑒定方法均有其 局限性。例如：1)分離培養(yǎng)鑒定:幽門螺桿菌培養(yǎng)成菌落后，經(jīng)生化反應鑒定。由于幽門螺桿 菌培養(yǎng)需要微需氧條件，對營養(yǎng)條件要求苛刻，因此檢出率極低，作為常規(guī)診斷手段不易推 廣，且幽門螺桿菌培養(yǎng)需要一定的時間，不利于快速診斷。2)組織病理切片染色法:該方 法是把患者胃鏡檢查活檢組織切片，染色后可觀察到組織中的幽門螺桿菌。該方法受幽門 螺桿菌載量影響明顯，且操作繁瑣、費時，不適于大通量樣本的檢測。3)尿素酶依賴性試驗 (尿素呼氣試驗）：根據(jù)標志物不同分為 13C呼吸試驗及14C呼吸試驗，臨床應用廣泛。缺點是 費用高、易受抑菌藥物和抑酸藥物的影響、敏感度低。4)免疫學檢查:檢測血清中或唾液和 尿液中抗體(IgG)或直接檢測糞便中幽門螺桿菌的抗原成分。其缺點是不能反映現(xiàn)癥感染。 5)核酸分析法:包括測序、PCR、寡核苷酸探針雜交等，但是這些檢查方法檢測位點少，特異 性低，通量小，成本較高，且不能做定量分析。6)定量分析：常用的定量分析方法是real-time PCR， 但該方法檢測單一，通量小，對多個基因分析時成本高。
[0004] 綜上所述，如何快速、準確、全面地對幽門螺桿菌進行鑒定和定量分析是本領(lǐng)域的 技術(shù)人員迫切亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以快速、準確、低成本的幽門螺桿菌定性 和定量多重基因檢測體系及其試劑盒，以及采用該檢測體系在制備診斷產(chǎn)品方面的應用。
[0006] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:一種幽門螺桿菌定性和定量 多重基因檢測體系，可在同一個反應體系中進行其菌種鑒定、定量、毒力和耐藥性分析。包 括對菌種鑒定基因 16S rRNA進行檢測的引物，分別對毒力基因 cagA、vacA-sl、vacA-s2、 ￥&0厶111、￥30厶112、；[06厶1、；^6厶2、(1卯厶、€^厶和11^3進行檢測的引物，分別對耐藥基因233 rRNA的2143位點、rdxA的148位點、pbplA的1777位點和gyrA的261位點的進行多態(tài)性檢測的 引物，以及分別對幽門螺桿菌的拷貝數(shù)進行定量分析的基因 ureC和β-globin進行檢測的引 物;所述各引物的正向引物的5'端均設(shè)有正向通用引物序列，所述各引物的反向引物的5' 端均設(shè)有反向通用引物序列。所述檢測體系進行PCR反應后進行毛細管電泳分析。
[0007] 針對16S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，針對16S rRNA 基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 針對cagA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，針對cagA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示； 針對vacA-sl或vacA-s2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，針對vacA- sl或VacA-s2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示； 針對vacA-ml基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.7所示，針對￥&〇六-!111基因的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示； 針對vacA-m2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.9所示，針對￥&〇六-!112基因的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 針對iceAl基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，針對iceAl基因的反向 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示； 針對iceA2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示，針對iceA2基因的反向 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示； 針對dupA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示，針對dupA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 針對oipA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示，針對oipA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 針對luxS基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示，針對luxS基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示； 針對23S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，對應23S rRNA基因 2143位點為堿基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，對應23S rRNA基因2143 位點為堿基G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 針對rdxA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，對應rdxA基因148位點 為堿基C的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，對應rdxA基因148位點為堿基T的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 26所示； 針對pbplA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，對應pbplA基因1777位 點為堿基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 28所示，對應pbplA基因1777位點為堿基 G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 29所示； 針對gyrA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示，對應gyrA基因261位點 為堿基C或T的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 31所示，對應gyrA基因261位點為堿基G 或A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 32所示； 針對ureC基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，針對ureC基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示； 針對β-globin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.35所示，以及針對6-81〇1^11 基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 36所示； 所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示； 所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示。
[0008] 針對16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、dupA、oipA 和luxS基因的正向引物在檢測體系中的終濃度均為200nM;針對16S rRNA、ureC、cagA、 vacA-sl、vacA_ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、oipA、luxS、和β-globin基因的反向引物在檢測 體系中的終濃度均為ΙΟΟηΜ;針對dupA和β-globin基因的正向引物在檢測體系中的終濃度 均為ΙΟΟηΜ; 針對23S rRNA基因的2143位點、rdxA基因的148位點、pbp 1A基因的1777位點和gyrA基 因的261位點的正向引物在檢測體系中的終濃度均為1 OOnM;對應23S rRNA基因2143位點為 堿基A的反向引物在檢測體系中的終濃度均為300nM;對應23S rRNA基因2143位點為堿基G 的反向引物在檢測體系中的終濃度均為350nM;對應rdxA基因148位點為堿基C、對應pbplA 基因1777位點為堿基A、對應gyrA基因261位點為堿基C或T的反向引物、對應rdxA基因148位 點為堿基T、對應pbplA基因1777位點為堿基G的反向引物在檢測體系中的終濃度均為 400nM;對應gyrA基因261位點為堿基G或A的反向引物在檢測體系中的終濃度均為450nM。
[0009] 上述幽門螺桿菌檢測體系還包括PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs、熱啟動DNA聚合 酶、帶熒光的通用標簽混合物和DNA模板;所述帶熒光的通用標簽混合物中包括反向通用引 物和帶有熒光標記的正向通用引物。
[0010] 上述熒光標記為CY5、CY3或FAM等。
[0011] 上述幽門螺桿菌檢測體系還包括陽性對照液和陰性對照液;所述陽性對照物是包 括所有目的基因靶點的質(zhì)?；旌衔?所述陰性對照液是無核酸酶超純水。
[0012] 上述幽門螺桿菌檢測體系反應時體系中的組分用量為10 X的PCR緩沖液1體積，帶 熒光的通用標簽混合物和2mmol/L的dNTPs共1體積，25mmol/L的MgCl2溶液2體積，引物混合 物1體積，5U/yL的熱啟動DNA聚合酶1體積，DNA模板2體積，純水2體積。
[0013] 上述DNA模板的使用量為5~50ng/體系。
[0014] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題