專利名稱：幽門螺桿菌抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種得自幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)的抗原。也提供了這種抗原作為免疫原、以及包含它的藥物組合物，尤其是疫苗的用途，同樣地也提供了編碼這種抗原的重組核酸分子、包含這種核酸分子的載體和攜帶這種載體的宿主。
幽門螺桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其一直與慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍有很強(qiáng)的牽連(Marshall等人，澳大利亞醫(yī)藥雜志(Medical Journalof Australia)，142439-444(1985)；Buck，G.E.，臨床微生物雜志(Journalof Clinical Microbiology)，31-12(1990))。幽門螺桿菌抗原領(lǐng)域最初的研究焦點(diǎn)是為了診斷的目的。但是，興趣也集中在提供對(duì)抗這種常見(jiàn)生物體有效的疫苗的需要上。許多提交的專利編檔已公布了用于這種疫苗的候選抗原，包括WO96/25430，WO98/32768和UK專利申請(qǐng)第9806039.5號(hào)。
但是，始終有提供進(jìn)一步抗原的需要，以確保任一疫苗對(duì)全部的菌株具有最完全的可能的效力、特異性和防護(hù)?，F(xiàn)在我們已經(jīng)分離和鑒定了一種對(duì)幽門螺桿菌感染顯示較好的保護(hù)性質(zhì)的抗原。
因此，本發(fā)明首先提供了一種幽門螺桿菌抗原蛋白質(zhì)，其在還原性或非還原性條件下經(jīng)SDS-PAGE測(cè)量的分子量為35kDa，并且具有如下氨基酸序列MAKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDVLLKSVELIKDLTGKAPTGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKYDHSLMHNDFTPYYVRVGDSWSKIDYSLEAKDWMKPLIRGVETDLVEIPANWYLDDLPPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYAVFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK.
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以以基本上純的形式提供。例如，其可以以基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式提供。
如此處所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為抗原物質(zhì)是有用的。這種材料可是“抗原的”和/或“免疫原性的”。一般，“抗原的”是指這種蛋白質(zhì)能夠被用來(lái)提高抗體或在受試者中真正地能夠誘導(dǎo)抗體應(yīng)答。“免疫原性的”是指這種蛋白質(zhì)能夠在受試者中引起保護(hù)性的免疫應(yīng)答。因此，在后一種情況下，這種蛋白質(zhì)可能不僅是能產(chǎn)生抗體應(yīng)答，另外，也能產(chǎn)生非基于抗體的免疫應(yīng)答。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的同源物或衍生物在本發(fā)明的上下文中同樣地有用，即作為抗原的/免疫原性的物質(zhì)。因此，例如包括一個(gè)或多個(gè)添加、缺失、替代等等的蛋白質(zhì)包含在本發(fā)明之中。另外，也可能以另一個(gè)相似“類型”的氨基酸替代一個(gè)氨基酸。例如用其它的氨基酸替代一個(gè)疏水的氨基酸。
可以使用程序如CLUSTAL程序來(lái)比較氨基酸序列。這種程序比較氨基酸序列并通過(guò)以適當(dāng)?shù)姆绞皆趦蓚€(gè)序列中的任一個(gè)插入一個(gè)間隔來(lái)發(fā)現(xiàn)最理想的排列比較。能夠計(jì)算最理想排列比較的氨基酸的同一性或相似性(同一性加氨基酸型的保守)。象BLASTx這樣的程序?qū)⑴帕斜容^相似序列的最長(zhǎng)延伸，并且分配適合的分值。因此可能獲得在其中發(fā)現(xiàn)了每個(gè)都具有不同分值的幾個(gè)相似性區(qū)域的比較結(jié)果。兩種類型的同一性分析都在本發(fā)明的考慮之列。
就同源物和衍生物來(lái)說(shuō)，同源物或衍生物應(yīng)保有的最初蛋白質(zhì)的抗原性或免疫原性比此處描述的蛋白質(zhì)的同一性程度顯得更為重要。但是，適當(dāng)?shù)?，提供了與此處描述的蛋白質(zhì)或多肽具有至少60％相似性(如上討論)的同源物或衍生物。優(yōu)選地，提供至少具有70％相似性的同源物或衍生物，更優(yōu)選地至少具有80％相似性。更優(yōu)選地，提供至少具有90％或甚至95％相似性的同源物或衍生物。
另一種可供選擇的方法，同源物或衍生物可以是融合蛋白，整合部分使得純化更容易，例如通過(guò)有效地給想要的蛋白質(zhì)或多肽加標(biāo)簽?？赡苄枰コ皹?biāo)簽”或者是融合蛋白質(zhì)本身保有足夠的有用的抗原性。
在本發(fā)明的附加方面提供了的本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗原/免疫原性的片段，或其同源物或衍生物的片段。
對(duì)于此處描述的蛋白質(zhì)或多肽的片段，或其同源物或衍生物的片段，情況稍有不同。眾所周知有可能篩選一個(gè)抗原蛋白質(zhì)或多肽來(lái)鑒定表位區(qū)域，即負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)或多肽的抗原性或免疫原性的那些區(qū)域。進(jìn)行這種篩選的方法為本領(lǐng)域所熟知。因此，本發(fā)明的片段應(yīng)包括一個(gè)或多個(gè)這樣的表位區(qū)域或與保有它們的抗原/免疫原性特性的這種區(qū)域足夠相似。因此，對(duì)于按照本發(fā)明的片段，同一性的程度可能是不相干的，因?yàn)樗鼈儗?duì)于如此處所描述的蛋白質(zhì)或多肽、同源物或衍生物的特定部位可能是100％的相同。再一次地，關(guān)鍵問(wèn)題是片段保有抗原/免疫原性的特性。
因此，對(duì)于同源物、衍生物和片段來(lái)說(shuō)重要的是它們至少具有它們所衍生自的蛋白質(zhì)或多肽的一些抗原性/免疫原性。
使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N-末端序列來(lái)篩選TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)。發(fā)現(xiàn)了一個(gè)匹配序列，命名為HP0310。蛋白質(zhì)的功能是(并且事實(shí)上仍舊是)未知的，并且當(dāng)然數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有提供關(guān)于它的抗原性/免疫原性的信息。
可以使用基因克隆技術(shù)來(lái)以基本上純的方式提供本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如，這些技術(shù)公布在J.Sambrook等人的分子克隆第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)。因此，第三方面，本發(fā)明提供了一種重組核酸分子，其包含或由如下組成(i)序列ATGGCAAAAGAAATTTTAGTGGCTTATGGTGTGGATATTGATGCGGTGGCTGGTTGGTTAGGGAGCTATGGTGGGGAGGATTCGCCTGATGATATTTCGCGCGGGCTTTTTGCGGGTGAAGTGGGGATCCCACGGCTTTTGAAATTGTTTAAAAAATACCATCTCCCGGCGACTTGGTTTTCGCCGGGGCATTCTATTGAAACTTTCTCTGAACAAATGAAAATGATCGTGGATGCAGGGCATGAAGTGGGCGCGCATGGGTATTCGCATGAAAACCCTATCGCTATGACGGCCAAGCAAGAAGAAGACGTTTTGTTAAAAAGCGTTGAGTTGATTAAAGATCTCACCGGCAAAG
CCCCCACAGGCTATGTGGCGCCGTGGTGGGAGTTTTCTAATATCACTAATGAATTGCTTTTAAAACACGGCTTCAAATACGACCACTCGCTCATGCACAATGATTTCACGCCCTATTATGTGCGCGTGGGGGATAGTTGGAGCAAGATTGATTATAGTTTGGAAGCTAAGGATTGGATGAAGCCTTTAATCCGTGGGGTGGAAACCGATCTGGTGGAAATCCCTGCGAACTGGTATTTGGACGATTTACCGCCGATGATGTTCATCAAAAAGTCCCCCAATAGTTTTGGTTTTGTAAGTCCGCACGATATAGGGCAAATGTGGATCGATCAATTTGATTGGGTTTATCGTGAGATGGATTATGCGGTGTTTAGCATGACAATCCACCCTGATGTGAGCGCCCGTCCGCAAGTGTTGCTCATGCATGAAAAAATCATTGAGCATATCAACAAGCACGAGGGCGTGCGTTGGGTAACATTCAATGAAATCGCTGATGATTTCTTAAAACGAAACCCTAGAAAAAAA.；(ii)與(i)中序列互補(bǔ)的序列；(iii)與(i)或(ii)的那些序列編碼相同的蛋白質(zhì)的序列；(iv)與(i)、(ii)或(iii)的任一個(gè)具有基本上同一性的序列；(v)編碼如此處所描述的蛋白質(zhì)的同源物、衍生物或片段的序列。
本發(fā)明的核酸分子可以包括多種這樣的序列和/或片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)本發(fā)明能包括在此處作為例子的那些特定的新核酸分子的新變異體。這種變異體包括在本發(fā)明中。這些可以自然地發(fā)生，例如，因?yàn)榫曜儺?。例如，包括了添加、替代?或缺失。另外，并且特別地當(dāng)使用微生物表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，人們可能希望通過(guò)使用已知在特定生物體中用于表達(dá)的偏好密碼子來(lái)設(shè)計(jì)核酸序列。因此，合成的或非自然發(fā)生的變異體同樣地包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
當(dāng)為了確定同源性或同一性的程度的目的而比較核酸序列時(shí)可使用例如BESTFIT和GAP(兩個(gè)都是來(lái)自威斯康星遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG)軟件包)的程序。例如，BESTFIT比較兩個(gè)序列并且產(chǎn)生最相似部分的最理想的排列比較。GAP使得序列沿著它們的整個(gè)長(zhǎng)度排列比較并通過(guò)以適當(dāng)?shù)姆绞皆趦蓚€(gè)序列任一個(gè)各插入一個(gè)間隔來(lái)找到最理想的排列比較。適當(dāng)?shù)?，在本發(fā)明的上下文中當(dāng)討論核酸序列的同一性時(shí)，通過(guò)沿著它們整個(gè)長(zhǎng)度的序列比較的排列來(lái)進(jìn)行比較。
優(yōu)選地，具有基本上同一性的序列與上述序列至少具有50％的序列同一性，較合意地至少具有75％的序列同一性和更為合意地至少90或至少95％的序列同一性。在某些情況下序列同一性可以是99％或更高。
較合意地，術(shù)語(yǔ)“基本上同一性”指上述序列與此處描述的序列相比，比與現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的核酸序列相比具有更大程度的同一性。
但是應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明在它的范圍內(nèi)包括編碼此處描述的新的基因產(chǎn)物，或其新的部分的所有可能的序列。
核酸分子可以是分離的或重組的形式?？梢詫⑵湔系捷d體上，并且可以將載體導(dǎo)入到宿主中。這樣的載體和適宜的宿主已經(jīng)形成了本發(fā)明的另一方面。
于是，例如，通過(guò)使用以此處提供的核酸分子為基礎(chǔ)的探針可以鑒定在幽門螺桿菌中的基因。然后可以用限制酶切割所述基因并克隆到載體中。可以將載體導(dǎo)入到適宜的宿主中用于表達(dá)。
本發(fā)明的核酸分子可以通過(guò)使用互補(bǔ)于核酸分子部分序列的適當(dāng)?shù)奶结槒挠拈T螺桿菌中獲得。可以用限制酶或超聲生處理技術(shù)來(lái)獲得用作探針的適當(dāng)大小的片段。
可供選擇地，可以使用PCR技術(shù)來(lái)擴(kuò)增想要的核酸序列。因此可以用此處提供的序列數(shù)據(jù)來(lái)設(shè)計(jì)用于PCR的引物，以便可以靶定包括其整個(gè)的基因或片段的想要的序列，并擴(kuò)增到較高程度。
一般地引物至少有15-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
作為進(jìn)一步供替代的選擇，可以使用化學(xué)合成。這可以是自動(dòng)化的。相對(duì)短的序列可以化學(xué)合成并連接到一起以提供一段較長(zhǎng)的序列。
然而在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)、或其同源物或衍生物、和/或任何這些的片段的免疫原性/抗原組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原性/抗原組合物是一種疫苗或是為在診斷測(cè)定中使用。
就疫苗而言，可以包含適宜的附加的賦型劑、稀釋劑、佐劑等等。很多的這樣的例子在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
也可能利用此處描述的核酸序列制備所謂的DNA疫苗。因此，本發(fā)明也提供了包含一種或多種如此處所定義的核酸序列的疫苗組合物。在本領(lǐng)域中描述了DNA疫苗(見(jiàn)例如，Donnelly等人，免疫學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Immunol.)，15617-648(1997))并且技術(shù)人員可以使用這種領(lǐng)域描述的技術(shù)按照本發(fā)明來(lái)生產(chǎn)和使用DNA疫苗。
另外，此處描述的蛋白質(zhì)、其同源物或衍生物，和/或任何這些片段均可以在檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌的方法中使用。這種方法可以基于可能存在于受試者中的針對(duì)這類蛋白質(zhì)的抗體的檢測(cè)。因此本發(fā)明提供了用于幽門螺桿菌檢測(cè)和診斷的方法，其包括使如此處所描述的蛋白質(zhì)、或同源物、衍生物或其片段與要被測(cè)試的樣品接觸的步驟。適合地，樣品是生物學(xué)樣品，例如從將要被測(cè)試的受試者中得到的組織樣品或血液或唾液樣品。
作為一種可選擇的方法，可以使用此處描述的蛋白、或同源物、衍生物和/或其片段來(lái)制備抗體，其反過(guò)來(lái)可以用于檢測(cè)抗原，并且因此檢測(cè)幽門螺桿菌。這樣的抗體形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面。在本發(fā)明范圍之內(nèi)的抗體可以是單克隆的或多克隆的。
當(dāng)將如此處所描述的蛋白質(zhì)、或同源物、衍生物或其片段注射到動(dòng)物中時(shí)通過(guò)刺激多克隆抗體在適宜的動(dòng)物宿主(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、綿羊、山羊或猴)中的生產(chǎn)能制備多克隆抗體。如果需要，可以將佐劑與蛋白質(zhì)一起施用。眾所周知的佐劑包括費(fèi)氏佐劑(完全的和不完全的)和氫氧化鋁。然后抗體可以通過(guò)它們結(jié)合于如此處所描述的蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)來(lái)得到純化。
單克隆抗體可以從雜交瘤中得到生產(chǎn)。這可以通過(guò)為了形成無(wú)限增殖細(xì)胞系而融合骨髓瘤細(xì)胞和產(chǎn)生所希望的抗體的脾細(xì)胞來(lái)形成。因此可以使用眾所周知的Kohler和Milstein的技術(shù)(自然(Nature)256(1975))或后來(lái)的根據(jù)這種技術(shù)的變化。
用于產(chǎn)生結(jié)合于特定多肽/蛋白質(zhì)的單克隆和多克隆抗體的技術(shù)目前在本領(lǐng)域已經(jīng)成熟。它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)教科書(shū)中進(jìn)行了討論，例如Roitt等人，免疫學(xué)第二版(Immunology second edition)(1989)，ChruchillLivingstone，London。
除完整抗體之外，本發(fā)明包括完整抗體的衍生物，其能夠結(jié)合于如此處所描述的蛋白質(zhì)等。因此，本發(fā)明包括抗體片段和合成的構(gòu)建體?？贵w片段和合成構(gòu)建體的例子由Dougall等人在Tibtech 12 372-379(9月1994)中給出。
例如，抗體片段包括Fab、F(ab’)2和Fv片段。Fab片段(這些在Roitt等人[如上述]中進(jìn)行了討論)?？梢孕揎桭v片段以產(chǎn)生被認(rèn)為是單鏈Fv(scFv)分子的合成構(gòu)建體。這包括共價(jià)連接Vh和Vl區(qū)域的一個(gè)肽接頭，其有助于分子的穩(wěn)定性。可以使用的其它合成構(gòu)建體包括CDR肽。這些是包含抗原結(jié)合決定簇的合成的肽。也可以使用肽模擬物。這些分子通常是構(gòu)象上受限制的有機(jī)環(huán)，其模擬CDR環(huán)的結(jié)構(gòu)并且其包括抗原相互作用的側(cè)鏈。
合成構(gòu)建體包括嵌合分子。因此，例如，人源化(或靈長(zhǎng)類源化)抗體或其衍生物在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。人源化抗體的例子是具有人構(gòu)架區(qū)，但是嚙齒類動(dòng)物高變區(qū)的的抗體。例如Morrison等人在PNAS，81，6851-6855(1984)中和Takeda等人在自然(Nature).314，452-454(1985)中討論了生產(chǎn)嵌合抗體的方法。
合成構(gòu)建體也包括帶有為分子提供了抗原結(jié)合以外的一些期望性質(zhì)的附加部分的分子。例如所述部分可以是一個(gè)標(biāo)記(例如熒光或放射性標(biāo)記)?？晒┻x擇地，其可以是藥學(xué)活性劑。
抗體或其衍生物在幽門螺桿菌的檢測(cè)/診斷中有用。因此，在另一方面本發(fā)明提供了用于幽門螺桿菌檢測(cè)/診斷的方法，其包括使能夠結(jié)合于此處所描述的蛋白質(zhì)、或其同源物、衍生物和/或片段的抗體與被測(cè)試的樣品接觸的步驟。
另外，可以使用所謂的“親和抗體(Affibody)”。這些是從α-螺旋細(xì)菌受體結(jié)構(gòu)域的組合文庫(kù)中篩選的結(jié)合蛋白質(zhì)(Nord等人，)。因此，能夠特異地結(jié)合于不同靶蛋白質(zhì)的小的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域能使用組合方法篩選。
同樣地清楚此處描述的核酸序列可用于檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌。因此，在更進(jìn)一方面，本發(fā)明提供了幽門螺桿菌的檢測(cè)/診斷的方法，其包括使至少一種此處描述的核酸序列與被測(cè)試的樣品接觸的步驟。較合適地，此樣品是生物樣品，例如，從受試者獲得的組織樣品或血液或唾液樣品。這種樣品在本發(fā)明的方法中使用之前可經(jīng)預(yù)處理。因此，例如，樣品可被處理來(lái)提取DNA。然后，基于此處描述的核酸序列的DNA探針(即一般為這種序列的片段)可用于檢測(cè)來(lái)自幽門螺桿菌的核酸。
在附加方面，本發(fā)明提供了(a)一種給受試者接種抗幽門螺桿菌疫苗的方法，其包括給受試者施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其衍生物、同源物或其一個(gè)或多個(gè)片段，或本發(fā)明免疫原性組合物的步驟；(b)一種給受試者接種抗幽門螺桿菌疫苗的方法，其包括給受試者施用如此處所定義的核酸分子的步驟；(c)一種用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防或治療的方法，其包括給受試者施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其衍生物、同源物或其一個(gè)或多個(gè)片段，或本發(fā)明免疫原性組合物的步驟；(d)一種用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防或治療的方法，其包括給受試者施用如此處所定義的核酸分子；(e)一種在檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌感染中使用的試劑盒，其包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)、或同源物、衍生物或其一個(gè)或多個(gè)片段，或本發(fā)明的抗原組合物；和(f)一種在檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌感染中使用的試劑盒，其包括如此處所定義的的一個(gè)或多個(gè)核酸分子；(g)一種在檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌感染中使用的試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)如此處所定義的一個(gè)或多個(gè)抗體；(h)一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其衍生物、同源物或其一個(gè)或多個(gè)片段，或本發(fā)明的抗原組合物在用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防和治療的藥物生產(chǎn)中的用途。
(i)如此處所定義的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，或其一個(gè)或多個(gè)片段在用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防和治療的藥物生產(chǎn)中的用途。
僅在現(xiàn)在將參考下面的實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，其不應(yīng)以任何本發(fā)明范圍限制的方式來(lái)構(gòu)建。實(shí)施例涉及的圖如下

圖1a顯示了從濃縮的幽門螺桿菌超聲處理物的Mono Q陰離子交換色譜得到的典型的連續(xù)流動(dòng)紫外吸收?qǐng)D。圖中的豎條代表供進(jìn)一步加工而收集的級(jí)分(級(jí)分11-14)；圖1b顯示了從幽門螺桿菌超聲處理物的Mono Q分級(jí)分離收集的組分的典型的脲酶活性圖。按照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定酶活性。數(shù)據(jù)已經(jīng)通過(guò)減去對(duì)照吸收值得到校正。
圖1c顯示了從Mono Q柱收集的級(jí)分11-14的SDS-PAGE分析。箭頭指示了包含35kDa抗原的目的蛋白質(zhì)的位置(級(jí)分11-13，下劃線)。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)從上到下是94kDa、67kDa、43kDa、30kDa、20.1kDa；圖2a顯示了從如圖1所鑒定的選定Mono Q組分的Superose 6FPLC體積排阻色譜得到的典型的連續(xù)流動(dòng)紫外吸收?qǐng)D。豎條代表供進(jìn)一步加工而收集的級(jí)分(組分19-21)；圖2b顯示了在來(lái)自Mono Q柱的級(jí)分11-13中收集的蛋白質(zhì)經(jīng)Superose 6 FPLC分級(jí)分離后收集的級(jí)分中典型的脲酶活性圖。
圖2c顯示了經(jīng)Superose 6 FPLC后收集的級(jí)分的SDS-PAGE分析。35kDa的蛋白質(zhì)存在于下劃線和箭頭所指示的級(jí)分18-21中。分子量標(biāo)準(zhǔn)從上到下為94kDa、67kDa、43kDa、30kDa、20.1kDa；圖3顯示了來(lái)自幽門螺桿菌的最終經(jīng)過(guò)純化的35kDa蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。分子量標(biāo)準(zhǔn)如所標(biāo)記的那樣；圖4顯示了每組用HP0310IPP免疫接種過(guò)的或未免疫接種過(guò)的小鼠之回收的活菌(平均值)；圖5顯示了HP0310基因PCR擴(kuò)增和寡核苷酸序列的克隆；圖6顯示了RT-PCR擴(kuò)增方案；圖7顯示了HP0310基因PCR產(chǎn)物(B)和在克隆載體pCR2.1中的克隆片段(C)的瓊脂糖凝膠(電泳)；和圖8顯示了重組HP0310蛋白質(zhì)表達(dá)的12％SDS-PAGE。(A)對(duì)照大腸桿菌蛋白質(zhì)圖，(B)表達(dá)HP0310抗原的重組大腸桿菌，(C)經(jīng)過(guò)純化的重組HP0310，和(D)經(jīng)過(guò)純化的天然HP0310。注意在重組HP0310中的大小的差異是由于組氨酸標(biāo)簽的存在。分子量標(biāo)記如所指示的那樣。
實(shí)施例1來(lái)自幽門螺桿菌的HP0310抗原的鑒定和分離1.1.方法細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)幽門螺桿菌菌株NCTC11637在巧克力瓊脂平板上培養(yǎng)，然后收獲、洗和重懸于pbs緩沖液中(pH7.2)。
蛋白質(zhì)純化使用具有9.5mm探頭的Sanyo Soniprep 150超聲粉碎機(jī)對(duì)幽門螺桿菌細(xì)胞懸浮液進(jìn)行超聲處理。聲幅水平設(shè)定在6μ米，并且機(jī)器使用25個(gè)由MSE程序計(jì)時(shí)器控制的30秒開(kāi)和60秒關(guān)的循環(huán)運(yùn)行。將用超聲處理的制品在10,000g離心10分鐘并且上清液通過(guò)0.45和0.22μm的濾器過(guò)濾。使用0.05M Tris緩沖液(pH8.2)和包含0.24M NaCl和1.0M NaCl的Tris緩沖液的兩步梯度通過(guò)在Mono Q HR10/10柱(PharmaciaBiotech Ltd，Uppsala，瑞典)上的陽(yáng)離子交換FPLC部分純化超聲處理的上清液。將包含50/52kDa的蛋白質(zhì)級(jí)分合并、濃縮，且在Superose 6柱(Pharmacia Biotech Ltd，Uppsala，瑞典)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾FPLC。用0.05M Tris緩沖液(pH7.2)洗脫。將包含50/52kDa的蛋白質(zhì)級(jí)分合并，并通過(guò)在DEAE-Sepharose CL6B(Pharmacia Biotech Ltd，Uppsala，瑞典)，和羥基磷灰石(Biorad Laboratories，Sydney，澳大利亞)上的低壓液相色譜獲得進(jìn)一步純化。
扼要地，將合并的Superose 6級(jí)分上樣至用50mM Tris緩沖液(pH7.4)平衡的DEAE-Sepharose CL6B的小(2.5ml)柱上，用此緩沖液徹底沖洗，然后用包含補(bǔ)加有25，50和75mM NaCl的50mM Tris(pH7.4)的梯度按順序洗脫。將最后一步的梯度洗脫物上樣至用5mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)平衡的羥基磷灰石的小(2.5ml)柱上。在從這個(gè)柱的最初流出液中收集35kDa的亞單位蛋白質(zhì)。在280nm連續(xù)監(jiān)測(cè)所有使用的色譜柱上的蛋白質(zhì)級(jí)分，并且測(cè)定了收集級(jí)分的脲酶活性。并且通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行了分析。將包含純化的35kDa的亞單位蛋白質(zhì)級(jí)分合并，用PBS緩沖液(pH7.2)徹底透析并貯存在-70℃以備后用。
蛋白質(zhì)鑒定。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce，Rockford，II，美國(guó))來(lái)確定總蛋白質(zhì)的濃度。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。通過(guò)不連續(xù)SDS-PAGE(5％堆積膠，12％分離膠)，在還原性或者非還原性的條件下，或通過(guò)自然PAGE(8-25％梯度)的分析來(lái)評(píng)估級(jí)分或純化的35kDa的亞單位蛋白質(zhì)純度。
氨基酸測(cè)序。將純化的35kDa的亞單位蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(BioRad，悉尼，澳大利亞)；這種過(guò)程中使用的所有的緩沖液都補(bǔ)充有0.1mM的巰基乙酸(Sigma，St Louis，MO，美國(guó))，用酰胺黑(Sigma，St Louis，MO，美國(guó))將轉(zhuǎn)移的膜染色，然后脫色并隨后將亞單位蛋白條帶切下。在新城蛋白質(zhì)測(cè)序設(shè)備(新城蛋白，新城大學(xué))上進(jìn)行N-末端氨基酸測(cè)序。1.2結(jié)果1.3本研究描述了來(lái)自病原體幽門螺桿菌的具有35kDa分子量的亞單位蛋白質(zhì)的成功純化。根據(jù)用于已經(jīng)成功地發(fā)展為在患者中檢測(cè)幽門螺桿菌感染的治療點(diǎn)(point-of-care)免疫診斷試劑盒的粗反應(yīng)抗原級(jí)分制備的方案的改進(jìn)，已經(jīng)將這種蛋白質(zhì)純化。從Mono Q和Superose 6 FPLC柱收集的級(jí)分的典型的蛋白質(zhì)洗脫、脲酶活性和還原型SDS-PAGE圖分別示于圖1(a-c)和圖2(a-c)中。在經(jīng)過(guò)Superose 6凝膠過(guò)濾后收集和合并的級(jí)分被認(rèn)為含有脲酶的成分，其先前已經(jīng)顯示了在小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸鹈庖弑Ｗo(hù)反應(yīng)和病原體的有效根除。接下來(lái)的通過(guò)DEAE-Sepharose CL6B陰離子交換色譜分級(jí)分離，用75mM NaCl洗脫，有效地去除了在合并的蛋白質(zhì)中的脲酶，如通過(guò)SDS-PAGE分析和脲酶活性測(cè)定(數(shù)據(jù)沒(méi)有給出)所確定的。曾上樣于羥基磷灰石的合并蛋白質(zhì)的洗脫，將35kDa亞單位蛋白質(zhì)從存在于單步分離中的其它污染蛋白質(zhì)中分開(kāi)。使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法在這些組分中沒(méi)有檢測(cè)到脲酶活性，在延長(zhǎng)孵育至24小時(shí)后也沒(méi)有檢測(cè)到(數(shù)據(jù)沒(méi)有給出)。在用PBS緩沖液(pH7.2)對(duì)35kDa亞單位蛋白質(zhì)徹底透析和用結(jié)晶聚乙二醇(PEG)濃縮后獲得了完全相同的結(jié)果。在運(yùn)用經(jīng)過(guò)Centricon-30(Amicon，Beverly，MA，美國(guó))離心法進(jìn)一步濃縮后的35kDa亞單位蛋白質(zhì)制品經(jīng)SDS-PAGE的銀染色，未顯示任一脲酶亞單位成分的存在。
經(jīng)過(guò)純化的35kDa亞單位蛋白質(zhì)在還原性和非還原性條件下的變性PAGE上已經(jīng)得到了進(jìn)一步的評(píng)定。通過(guò)變性的PAGE分析顯示，這種蛋白質(zhì)在還原和非還原的條件下都作為離散的35kDa亞單位蛋白質(zhì)存在(圖3)。
在新城蛋白質(zhì)設(shè)備上的N-末端測(cè)序之后，經(jīng)過(guò)純化的35kDa亞單位蛋白質(zhì)得到鑒定。所獲得的相應(yīng)于在還原性SDS-PAGE上觀察到的純化35kDa亞單位條帶之前12個(gè)氨基酸殘基的序列數(shù)據(jù)是AKEILVAYGVDI。通過(guò)使用Swiss-Prot在線數(shù)據(jù)庫(kù)和在T.L.G.R的幽門螺桿菌菌株26696基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的這種序列的BLAST(Basic Local Alignment Sequence Tool)分析，獲得了此蛋白質(zhì)初步的鑒定。這些組合分析表明，這種蛋白質(zhì)相當(dāng)于命名為HP0310的預(yù)測(cè)的保守的假想蛋白質(zhì)。然而關(guān)于此蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的功能是未知的，由于(i)在其它的實(shí)驗(yàn)室其從來(lái)沒(méi)有得到過(guò)純化，和(ii)比較序列分析表明同源蛋白質(zhì)具有不同的功能。
下面的數(shù)據(jù)使天然NCTC 11637菌株蛋白質(zhì)的序列與這種蛋白質(zhì)在菌株26695中的預(yù)測(cè)的序列和由本實(shí)驗(yàn)室中的Richard McCoy博士克隆的重組NCTC 11637蛋白質(zhì)所確定的的序列進(jìn)行排列比較。使用來(lái)自菌株26695的HP0310的預(yù)測(cè)的序列獲得了BLAST分析只給出了顯著的匹配(即P(N)＜0.001)。上面3個(gè)匹配的排列比較未產(chǎn)生關(guān)于純化的35kDa蛋白質(zhì)的功能同一性或重要性的理解，所述35kDa蛋白質(zhì)具有相當(dāng)于(i)來(lái)自集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis.sp.)的屬之假想的蛋白質(zhì)、(ii)來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌的節(jié)蛋白(nodB)，(iii)和在嗜熱脂肪芽孢桿菌中的假想蛋白質(zhì)的序列同源區(qū)。序列排比Native AKEILVAYGVDIRacomb AKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWF26695 NAKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWF 60Racomb PGHSIETFPEQMKMIVDAGHESGKSIELIKDLTGKAP26695 SPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDVLLKSVELIKDLTGKAP 120Recomb QAMWRRGGKFSNITNELRLKHGFKYSLEAKDWMKP26695 TGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKYDHSLMHNDFTPYYVRVGDSWSKIDYSLEAKDWMKP 180RecombIRGVDVAPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYA26695 LIRGVETDLVEIPANWYLDDLPPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYA 240Recomb VFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK26695 VFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK 293BLAST分析Query＝MySequence(293字符)高概率序列產(chǎn)生高得分區(qū)段配對(duì)得分 P(N) Ngi|2313％06| (AE000549) 保守的假擬 15905.0e-212 1gnl|PID|d1018374 (D90907)假擬蛋白質(zhì) [Sy..1841.4e-161pir||B47692結(jié)瘤蛋白質(zhì)nodB同源區(qū)-Ba…1322.4e-091sp|Q04729|YFU2_BACST 假擬 30.6 KD 1322.4e-091gi|2626811| (D83967)Yfjs[枯草芽孢桿菌 ]＞g...1252.3e-081gnl|PID|e325402 (Z97209)假擬蛋白質(zhì)[Schiz… 961.3e-0729nl|PID|e1185261 (Z99112)其他基因名稱 ymxI；.1121.5e-061sp|P50850|YLXY_BACSU 假擬 31.5 KD.. 1051.4e-051gi|2612882| (AF015825) NodB-樣蛋白質(zhì) [Bacill…950.000341gnl|PID|e325211 (Y14082)假擬蛋白質(zhì)[Bacil...780.000613gnl|PID|e1251975 (AL021897) 假擬蛋白質(zhì).930.000651序列同源區(qū)1.＞gnl|PID|d1018374(D90907)假擬蛋白質(zhì)[集胞藍(lán)細(xì)菌]長(zhǎng)度＝335得分＝184(85.0bits)期望＝1.4e-16，P＝1.4e-16同一性＝39/104(37％)， 相似性＝58/104(55％)Query42 GIPRLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQE 101G+PR+L L KY + TG ++E + ++ K IV GHE AHG+ +N MTA QEsbjct95 GVPRILDLLDKYKIKITSHMSGRTVEMYPDRAKEIVQRGHEAAAHGWDWDNEFNMTAPQE 154Query 102 EDVLLKSVELIKDLTGKAPTGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKY 145D + ++V++I +TG+ GY APS +L + GF YSbjct 155 RDFIQRNVDIILKVTGQRAVGYNAPGLRGSVNILTVLNELGFVY 1982.＞pir||B47692結(jié)瘤蛋白質(zhì)nodB同源區(qū)-嗜熱脂肪芽孢桿菌長(zhǎng)度＝265得分＝132(61.0bits)， 期望＝2.4e-09，P＝2.4e-09同一性＝28/82(34％)， 相似性＝49/82(59％)QueRY45 RLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDV 104++L + KK+ + AT+F GH ++T + +K +V GH VG H +SH + ++A + +Sbjct84 KILDVLKKHDVHATFFVTGHYLKTAPDLVKRMVKEGHIVGNHSWSHPDMTTISADKIKKE 143Query 105 LLKSVELIKDLTGKAPTGYVAP 126L+ +K+LTG+ T YV PSbjct 144 LDAVSDKVKELTGQEGTVYVRP 1653.＞sp|Q04729|YFU2_BACST FUMA 3’區(qū)前體中假擬30.6KD蛋白質(zhì)(ORF2)＞gi|551706|(L05611)[fumA(Bst)]基因產(chǎn)物[嗜熱脂肪芽孢桿菌]長(zhǎng)度＝265得分＝132(61.0bits)，期望＝2.4e-09，P＝2.4e-09同一性＝28/82(34％)，相似性＝49/82(59％)Query45 RLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDV 104++L + KK+ + AT+F GH ++T + +K +V GH VG H +SH + ++A + +sbjct84 KILDVLKKHDVHATFFVTGHYLKTAPDLVKRMVKEGHIVGNHSWSHPDMTTISADKIKKE 143Query 105 LLKSVELIKDLTGKAPTGYVAP 126L+ +K+LTG+ T YV PSbjct 144 LDAVSDKVKELTGQEGTVYVRP 1652.檢驗(yàn)從NCTC菌株11637中分離的作為疫苗抗原的天然幽門螺桿菌蛋白質(zhì)HP03102.1方法小鼠的免疫接種使用預(yù)防免疫接種法在小鼠的幽門螺桿菌感染模型中檢驗(yàn)了此抗原。
雌性、不含特定病原體的C57BL/6小鼠從澳大利亞、NSW、新城大學(xué)的中心動(dòng)物房獲得。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行獲得了新城大學(xué)的動(dòng)物照料與倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并且在有隔離器的籠子里每籠放5只。通過(guò)集合淋巴小結(jié)內(nèi)途徑(IPP)免疫小鼠來(lái)測(cè)試作為候選疫苗的抗原的效能，由于這種免疫途徑已經(jīng)顯示了產(chǎn)生最大的腸免疫(1，2)，并且因而對(duì)于篩選具有作為口服疫苗抗原潛力的蛋白質(zhì)是有用的。在等量的PBS和費(fèi)氏不完全佐劑的勻漿中包含有抗原HP0310(0.5g蛋白質(zhì)/ml)。對(duì)于IPP免疫法，每只小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射200μl的氯胺酮、噻拉嗪(Bayer)混合物(通過(guò)混合10ml氯胺酮(100μg/ml)和1ml噻拉嗪(100μg/ml)而制備)得到麻醉。腹部剃毛并用70％的乙醇擦洗，且在皮膚和肌肉層做中間線切口以暴露腸。可見(jiàn)的集合淋巴小于沿著腸的長(zhǎng)度排列，直接注射約3μl的勻漿到每個(gè)集合淋巴小結(jié)的漿膜之下。縫合肌肉和皮膚層并且將小鼠保溫直到其從麻醉狀態(tài)蘇醒。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，免疫10只小鼠而另10只未經(jīng)處理作為非免疫的對(duì)照組。用幽門螺桿菌感染小鼠在免疫后兩周感染小鼠。幽門螺桿菌悉尼菌株1(SS1)從澳大利亞悉尼NSW大學(xué)A.Lee教授處獲得。該幽門螺桿菌菌株已經(jīng)顯示了成功地定居于C57BL/6小鼠的胃(3)。幽門螺桿菌在微需氧37℃保溫箱中的巧克力平板上生長(zhǎng)3天，然后收獲至PBS中。幽門螺桿菌的濃度由405nm讀取的光密度，和使光密度與幽門螺桿菌濃度相關(guān)的回歸曲線確定。用管飼法連續(xù)3天用約含108個(gè)幽門螺桿菌的100μl體積感染小鼠，并且在巧克力瓊脂上培養(yǎng)連續(xù)10倍稀釋的活幽門螺桿菌制品3天，來(lái)確定活的幽門螺桿菌的實(shí)際濃度。因此分別計(jì)算活的幽門螺桿菌的實(shí)際劑量。在連續(xù)的3天的劑量為2.0×108、5.0×108、1.0×108。樣品收集在感染后4周通過(guò)腹膜內(nèi)注射過(guò)量的戊巴比妥將小鼠殺死并移出胃。將胃縱向切成兩半，一半于1ml的PBS中勻漿并且將連續(xù)稀釋的小份涂于巧克力平板上培養(yǎng)3天。計(jì)數(shù)菌落以確定在每個(gè)小鼠的半個(gè)胃中幽門螺桿菌的菌落形成單位(CFU)數(shù)。計(jì)算每組的平均值±SEM。2.2結(jié)果表1和圖4中顯示了從每組小鼠的半個(gè)胃中的活菌平均回收。
表1從勻漿的半個(gè)胃中回收的細(xì)菌
組間非配對(duì)的“T-檢驗(yàn)”的比較顯示，在用HP0310免疫的組中平均的CFU明顯地較低(P＜0.001)。用免疫組與非免疫組相比較時(shí)細(xì)菌的清除百分率為97％。結(jié)論當(dāng)以預(yù)防的目的用于防止小鼠中幽門螺桿菌的感染時(shí)，來(lái)自幽門螺桿菌菌株NCTC11637的蛋白質(zhì)HP0310是一種保護(hù)抗原。期望這種蛋白質(zhì)在治療的疫苗中也能有效。3.幽門螺桿菌NCTC 11637 HP0310基因的克隆和表達(dá)3.1前言在關(guān)于超聲處理細(xì)菌制品的可溶性部分的蛋白質(zhì)分析中，首次注意到來(lái)自幽門螺桿菌NCTC11637菌株的HP0310蛋白質(zhì)。通過(guò)比較從分離的蛋白質(zhì)中獲得的氨基酸序列與TIGR幽門螺桿菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定了此蛋白質(zhì)。使用純化的天然蛋白質(zhì)的免疫接種和攻擊研究表明了明顯的保護(hù)誘導(dǎo)并且成為試圖克隆用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的基因的根據(jù)。3.2方法和結(jié)果寡核苷酸直接用TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)的幽門螺桿菌菌株26695的HP0310序列設(shè)計(jì)HP03105′和3′末端的寡核苷酸。(圖5)。為了容納隨后的擴(kuò)增基因克隆至表達(dá)質(zhì)粒載體中，在每個(gè)寡核苷酸的5′末端引入限制酶切位點(diǎn)。在使用適當(dāng)?shù)能浖M(jìn)行關(guān)于幽門螺桿菌菌株26695的HP0310序列酶位點(diǎn)搜尋并且考慮到在pQE30系列載體的多克隆位點(diǎn)的可用酶位點(diǎn)后選擇了被選的酶位點(diǎn)，5′和3′引物分別為SphI和HindIII。
RNA生產(chǎn)使用Boehringer Mannheim高純RNA分離試劑盒，從培養(yǎng)3天的幽門螺桿菌NCTC11637菌株中制備總RNA。從細(xì)菌中分離RNA的標(biāo)準(zhǔn)程序參照如在試劑盒的方法中扼要描述的，并且包括用DNA酶I處理。將分離的RNA制成用DEPC處理的滅菌去離子水(dd.H2O)中的50μl的終體積。
cDNA生產(chǎn)為了從分離的RNA中產(chǎn)生cDNA，將5μl的總RNA與2μl每種寡核苷酸引物(以約0.5μg/μl)、2μl含有2.5μM的每種dNTP的dNTP混合物、5μl的5×反應(yīng)緩沖液(Promega)、3μl的1mg/ml的牛血清白蛋白、10個(gè)單位的RNasin(Promega)、和200個(gè)單位的莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)混合。用dd.H2O補(bǔ)至體積為25μl并在42℃保溫60分鐘。反應(yīng)通過(guò)在70℃保溫10分鐘終止并用dd.H2O補(bǔ)至終體積為50μl。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增使用Taq DNA聚合酶(Promega)和1、2和5mM濃度的MgCl2對(duì)5μl的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR混合物用dd.H20補(bǔ)至50μl并在擴(kuò)增前在微離心管中脈沖標(biāo)記。使用如圖6扼要描述的方法在Hybaid Touchdown熱循環(huán)控制儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束后緊接著將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到4℃，并且10μl的每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行1％瓊脂糖(Progen，澳大利亞)凝膠電泳。瓊脂糖凝膠用溴化乙啶染色，與1千堿基對(duì)梯狀條帶(Progen)比較，檢查在約900堿基對(duì)處的條帶(圖7)。
PCR片段純化與克隆一旦成功擴(kuò)增反應(yīng)，即包含有預(yù)期大小的片段的反應(yīng)的鑒定之后，使用純化試劑盒(Boehringer Mannheim)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化。然后將純化產(chǎn)物從1％瓊脂糖凝膠上切下，并使用ProgenBand Pure純化試劑盒純化片段。然后將分離的片段與pCR2.1質(zhì)粒載體以提供的最初的TA克隆試劑盒(Invitrogen，美國(guó))所述的方式連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的TOP10F′大腸桿菌菌株，并涂在含有100μg氨芐青霉素/ml的LB瓊脂平板上，用含有1mM IPTG(Progen)和0.02％X-gal(Amresco，美國(guó))的瓊脂覆蓋。檢查平板中的集落，挑選提示片段插入到pCR2.1載體中的缺少β-半乳糖苷酶活性的菌落，選擇了6個(gè)這樣的菌落使用Pharmacia Flexiprep系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的制備。分離的克隆質(zhì)粒DNA用Eco RI降解，以切下插入片段并在1％的瓊脂糖凝膠上檢查(圖7)。然后將含有正確大小片段的克隆這到澳大利亞新城大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室DNA測(cè)序部使用ABI Prism 377 DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行核苷酸測(cè)序。
克隆至pQE表達(dá)載體使用引入到PCR引物中的SphI和HindIII限制酶位點(diǎn)，從pCR2.1載體上將克隆的NCTC11637 HP0310基因切下。將此片段連接到pQE31表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)中的相應(yīng)位點(diǎn)，并且轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109大腸桿菌菌株。菌落在LB氨芐青霉素的平板上得到生長(zhǎng)并且再一次的選擇6個(gè)可能的克隆用于質(zhì)粒DNA分析?？寺⊥ㄟ^(guò)限制酶分析和測(cè)序得到證實(shí)?？寺∽C實(shí)之后，選擇2個(gè)克隆并且在LB肉湯中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物用于在-70℃甘油貯藏。
重組HP0310蛋白質(zhì)的表達(dá)pQE系列載體的表達(dá)是在具有兩個(gè)Lac操縱子序列的T5啟動(dòng)子的控制之下。為了表達(dá)克隆的HP0310基因，將pQE31-HP0310質(zhì)粒克隆轉(zhuǎn)化包含pREP4質(zhì)粒的M15大腸桿菌菌株細(xì)胞。pREP4質(zhì)粒提供用于控制插入基因表達(dá)的Lac阻遏物基因。轉(zhuǎn)化通過(guò)質(zhì)粒DNA分析得到證實(shí)，并且在含有100μg氨芐青霉素/ml和25μg卡那霉素/ml(LBA/AK)的LB瓊脂上制備菌落的新鮮平板，卡那霉素抗性基因由pREP4質(zhì)粒攜帶。將在M15細(xì)胞中表達(dá)克隆的單菌落接種至含有氨芐青霉素和卡那霉素(LB/AK)的5ml的LB肉湯中，在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用0.5ml的過(guò)夜培養(yǎng)物接種4.5ml的新鮮的LB/AK肉湯，并且這種培養(yǎng)物在37℃生長(zhǎng)2小時(shí)。通過(guò)加入100mM的IPTG至2mM的終濃度來(lái)誘導(dǎo)基因的表達(dá)，培養(yǎng)物在37℃再孵育另外的4小時(shí)。在結(jié)束表達(dá)孵育之后，將細(xì)胞在Beckman GPR bench top離心機(jī)上在10℃下以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液。將細(xì)胞重懸于2.5ml0.1M磷酸二氫鈉和0.01M Tris、pH7.8的裂解緩沖液中的8M尿素中。使用在MSE程序計(jì)時(shí)器的控制之下的具有3mm直徑探頭的SanyoSoniprep 150超聲儀，在20秒的非超聲之后20秒超聲的4個(gè)循環(huán)中，以7微米的振幅在冰上將細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲處理。將超聲制品如前所述離心15分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到一新管中。沉淀重懸于1ml的PBS中。10μl的每種上清液和沉淀制品加入等體積的含4％SDS的PAGE還原性上樣緩沖液，在具有4％丙烯酰胺堆積層(Bio Rad，美國(guó))的12％丙烯酰胺小預(yù)制膠上電泳。凝膠在80V進(jìn)行約15分鐘然后在180V電泳，直到溴酚蘭標(biāo)記染色。將所得膠在0.1％的考馬斯亮藍(lán)染料中染色并檢查應(yīng)在約35kDa處的重組蛋白質(zhì)(圖8)。
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gaacaaatga aaatgatcgt ggatgcaggg 240catgaagtgg gcgcgcatgg gtattcgcat gaaaacccta tcgctatgac ggccaagcaa 300gaagaagacg ttttgttaaa aagcgttgag ttgattaaag atctcaccgg caaagccccc 360acaggctatg tggcgccgtg gtgggagttt tctaatatca ctaatgaatt gcttttaaaa 420cacggcttca aatacgacca ctcgctcatg cacaatgatt tcacgcccta ttatgtgcgc 480gtgggggata gttggagcaa gattgattat agtttggaag ctaaggattg gatgaagcct 540ttaatccgtg gggtggaaac cgatctggtg gaaatccctg cgaactggta tttggacgat 600ttaccgccga tgatgttcat caaaaagtcc cccaatagtt ttggttttgt aagtccgcac 660gatatagggc aaatgtggat cgatcaattt gattgggttt atcgtgagat ggattatgcg 720gtgtttagca tgacaatcca ccctgatgtg agcgcccgtc cgcaagtgtt gctcatgcat 780gaaaaaatca ttgagcatat caacaagcac gagggcgtgc gttgggtaac attcaatgaa 840atcgctgatg atttcttaaa acgaaaccct agaaaaaaa879<210>3<211>12<212>PRT<213>幽門螺桿菌<400>3Ala Lys Glu Ile Leu Val Ala Tyr Gly Val Asp Ile1 5 10<210>4<211>59<212>PRT<213>幽門螺桿菌<400>4Ala Lys Glu Ile Leu Val Ala Tyr Gly Val Asp Ile Asp Ala Val Ala1 5 10 15Gly Trp Leu Gly Ser Tyr Gly 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1.一種幽門螺桿菌抗原蛋白質(zhì)，如在還原性或非還原性條件下由SDS-PAGE所測(cè)量的具有35kDa的分子量，并且具有如下氨基酸序列MAKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDVLLKSVFLIKDLTGKAPTGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKYDHSLMHNDFTPYYVRVGDSWSKIDYSLEAKDWMKPLIRGVETDLVEIPANWYLDDLPPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYAVFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK.
2.如權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其以基本上純的形式提供，優(yōu)選基本上不含其它蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)之抗原/免疫原性同源物或衍生物。
4.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)之同源物或衍生物的一種或多種抗原/免疫原性片段。
5.一種重組核酸分子，其包含或由如下組成(i)序列ATGGCAAAAGAAATTTTAGTGGCTTATGGTGTGGATATTGATGCGGTGGCTGGTTGGTTAGGGAGCTATGGTGGGGAGGATTCGCCTGATGATATTTCGCGCGGGCTTTTTGCGGGTGAAGTGGGGATCCCACGGCTTTTGAAATTGTTTAAAAAATACCATCTCCCGGCGACTTGGTTTTCGCCGGGGCATTCTATTGAAACTTTCTCTGAACAAATGAAAATGATCGTGGATGCAGGGCATGAAGTGGGCGCGCATGGGTATTCGCATGAAAACCCTATCGCTATGACGGCCAAGCAAGAAGAAGACGTTTTGTTAAAAAGCGTTGAGTTGATTAAAGATCTCACCGGCAAAGCCCCCACAGGCTATGTGGCGCCGTGGTGGGAGTTTTCTAATATCACTAATGAATTGCTTTTAAAACACGGCTTCAAATACGACCACTCGCTCATGCACAATGATTTCACGCCCTATTATGTGCGCGTGGGGGATAGTTGGAGCAAGATTGATTATAGTTTGGAAGCTAAGGATTGGATGAAGCCTTTAATCCGTGGGGTGGAAACCGATCTGGTGGAAATCCCTGCGAACTGGTATTTGGACGATTTACCGCCGATGATGTTCATCAAAAAGTCCCCCAATAGTTTTGGTTTTGTAAGTCCGCACGATATAGGGCAAATGTGGATCGATCAATTTGATTGGGTTTATCGTGAGATGGATTATGCGGTGTTTAGCATGACAATCCACCCTGATGTGAGCGCCCGTCCGCAAGTGTTGCTCATGCATGAAAAAATCATTGAGCATATCAACAAGCACGAGGGCGTGCGTTGGGTAACATTCAATGAAATCGCTGATGATTTCTTAAAACGAAACCCTAGAAAAAAA.；(ii)與(i)中序列互補(bǔ)的序列；(iii)與(i)或(ii)的那些序列編碼相同蛋白質(zhì)的序列；(iv)與(i)、(ii)或(iii)的那些中任一個(gè)具有基本上的同一性的序列；(v)編碼如此處所描述的蛋白質(zhì)的同源物、衍生物或片段的序列。
6.一種包含如權(quán)利要求5的核酸序列的載體。
7.一種包含如權(quán)利要求6的載體的宿主細(xì)胞。
8.一種包含如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所定義的蛋白質(zhì)、和/或如權(quán)利要求3所定義的同源物或衍生物、和/或如權(quán)利要求4所定義的一個(gè)或多個(gè)片段的免疫原性/抗原組合物
9.如權(quán)利要求8的免疫原性/抗原組合物，其是疫苗或是用于診斷鑒定。
10.一種包含一種或多種如權(quán)利要求5所定義的核酸序列的疫苗組合物。
11.一種用于幽門螺桿菌檢測(cè)/診斷的方法，其包括使如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求3所定義的同源物或衍生物或如權(quán)利要求4所定義的其片段與待測(cè)試的樣品相接觸的步驟。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中樣品是生物學(xué)樣品，如從待測(cè)試的受試者中得到的組織樣品或者血液或唾液樣品。
13.一種能結(jié)合于如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求3所定義的同源物或衍生物或如權(quán)利要求4所定義的片段的抗體。
14.一種用于幽門螺桿菌檢測(cè)/診斷的方法，其包括使如權(quán)利要求13所定義的至少一種抗體與待測(cè)試的樣品相接觸的步驟。
15.一種用于幽門螺桿菌檢測(cè)/診斷的方法，其包括使如權(quán)利要求5所定義的至少一種核酸序列與待測(cè)試的樣品相接觸的步驟。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中樣品是生物學(xué)樣品，如從待測(cè)試的受試者中得到的組織樣品或者血液或唾液樣品。
17.一種免疫接種受試者抗幽門螺桿菌的方法，其包括給受試者施用如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求3所定義的衍生物或同源物、如權(quán)利要求4所定義的其一個(gè)或多個(gè)片段、或如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所定義的免疫原性組合物的步驟。
18.一種免疫接種受試者抗幽門螺桿菌的方法，其包括給受試者施用如權(quán)利要求5所定義的核酸分子的步驟。
19.一種用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防或治療的方法，其包括給受試者施用如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求3所定義的衍生物或同源物、如權(quán)利要求4所定義的其一個(gè)或多個(gè)片段、或如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所定義的免疫原性組合物的步驟。
20.一種用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防或治療的方法，其包括給受試者施用如權(quán)利要求5所定義的核酸分子的步驟。
20.一種在檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌感染中使用的試劑盒，其中包含如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求3所定義的同源物或衍生物、如權(quán)利要求4所定義的其一個(gè)或多個(gè)片段、或如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所定義的抗原組合物。
21.一種在檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌感染中使用的試劑盒，其中包含如權(quán)利要求5所定義的一種或多種核酸分子。
22.一種在檢測(cè)/診斷幽門螺桿菌感染中使用的試劑盒，其中包含如權(quán)利要求13所定義的一種或多種抗體。
23.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求3所定義的同源物或衍生物、如權(quán)利要求4所定義的其一個(gè)或多個(gè)片段、或如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所定義的抗原組合物在制備幽門螺桿菌感染的預(yù)防或治療的藥物中的用途。
24.如權(quán)利要求5所定義的一個(gè)或多個(gè)核酸分子、或其一個(gè)或多個(gè)片段在幽門螺桿菌感染的預(yù)防或治療的藥物的生產(chǎn)中的用途。
全文摘要
公布了一種得自幽門螺桿菌的新抗原。也描述了它的診斷和治療用途,也描述了包含抗原和/或編碼此抗原的核酸分子的試劑盒。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1330662SQ9981463
公開(kāi)日2002年1月9日 申請(qǐng)日期1999年11月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月17日
發(fā)明者M·頓克雷, S·哈瑞斯 申請(qǐng)人:普羅瓦利斯英國(guó)有限公司