專利名稱：一種幽門螺桿菌蛋白及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白，具體地說(shuō)是涉及一種幽門螺桿菌蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是公認(rèn)的人體慢性胃炎和消化性潰瘍的致病菌，與胃癌和胃淋巴瘤等疾病的發(fā)生關(guān)系密切，在全球人群中有很高的感染率。目前，臨床上主要采用抗生素治療幽門螺桿菌的感染，短期內(nèi)雖有較好的療效，但由于存在細(xì)菌耐藥性不斷增加、治療費(fèi)用高、不能防止復(fù)發(fā)和重復(fù)感染等問(wèn)題，使這類方案的實(shí)用性受限。因此，幽門螺桿菌感染的防制只能建立在有效疫苗的應(yīng)用的基礎(chǔ)上。
在疫苗研究中，篩選高效的免疫抗原是關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)。目前，雖然已經(jīng)對(duì)多種幽門螺桿菌抗原的免疫活性進(jìn)行了鑒定，但至今尚未找到一種免疫保護(hù)效果令人滿意的抗原成分。目前研究的主要缺點(diǎn)有①全菌體抗原組分復(fù)雜，經(jīng)口接種后可造成消化道粘膜損傷，且幽門螺桿菌培養(yǎng)要求條件較高；②從菌體蛋白中純化單一抗原組分，效率低，制備成本高；③已知的基因重組抗原免疫保護(hù)率均不理想。④基因重組載體和宿主菌不適宜，使表達(dá)效率低，或使表達(dá)蛋白純化困難，或使表達(dá)產(chǎn)物喪失原天然蛋白的免疫活性。
此外，幽門螺桿菌感染的臨床診斷也存在缺陷。臨床上采用通過(guò)胃鏡取胃粘膜進(jìn)行幽門螺桿菌培養(yǎng)的診斷方法不僅具有創(chuàng)傷性，不易被患者接受，且試驗(yàn)技術(shù)要求高，檢出率低；而現(xiàn)有的免疫診斷試劑受診斷抗原免疫活性的影響，診斷效率有待提高。
據(jù)報(bào)道，相當(dāng)多的革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，這些外膜蛋白作為抗體和免疫細(xì)胞攻擊的主要靶標(biāo)，可以介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌最直接有效的殺滅作用，是決定免疫反應(yīng)是否對(duì)人體具有保護(hù)性的關(guān)鍵因素。本發(fā)明所述幽門螺桿菌蛋白是一種外膜蛋白，并命名為HP-C101。其編碼基因具有高度的保守性，有望成為重要的免疫抗原，但目前國(guó)內(nèi)外均未檢索到有關(guān)HP-C101抗原活性和免疫保護(hù)性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的首先在于提供一種幽門螺桿菌蛋白抗原，其次，還包括其制備方法以及應(yīng)用，為幽門螺桿菌疫苗的研制提供一種免疫抗原，并為幽門螺桿菌感染診斷試劑的研制提供一種診斷抗原。
本發(fā)明的目的可通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的蛋白，其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq 2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq 2同源性高于或等于60％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明涉及的蛋白來(lái)源于幽門螺桿菌，同時(shí)也可來(lái)源于其它菌種，只要其氨基酸序列滿足與seq 2同源性高于或等于60％的要求。
本發(fā)明編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq 2的核酸分子相比，具有高于或等于60％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于60％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；
P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SalIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明蛋白的制備方法是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明所述蛋白應(yīng)用是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。本發(fā)明的蛋白的應(yīng)用，特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。本發(fā)明所述蛋白的應(yīng)用，其特征在于前述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明所述蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下1.應(yīng)用本文所述的PCR引物，成功地克隆到幽門螺桿菌蛋白HP-C101的基因片段，說(shuō)明本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物效能良好。
2.構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)TBl(pMAL-c2X-HP-C101)具有較高表達(dá)效率，表達(dá)的重組蛋白純化方便，純化產(chǎn)物的純度達(dá)90％，說(shuō)明這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)是制備和研究這種蛋白抗原的理想工具。
3.通過(guò)對(duì)小鼠的皮下免疫接種，證明了幽門螺桿菌蛋白HP-C101的基因重組表達(dá)蛋白rHP-C101具有良好的免疫活性，具有疫苗應(yīng)用價(jià)值。
4.應(yīng)用幽門螺桿菌感染的小鼠動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)用rHP-C101免疫小鼠能夠顯著減少幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)的定植，能夠得到較高的免疫保護(hù)率，免疫保護(hù)效果與幽門螺桿菌尿素酶B和熱休克蛋白A的基因融合表達(dá)蛋白(rHU)相似。此研究結(jié)果顯示rHP-C101具有較強(qiáng)免疫保護(hù)效果，可以作為疫苗抗原。


圖1TBl(pMAL-c2X-HP-C101)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析(1低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2TBl(pMAL-c2X-HP-C101)誘導(dǎo)3hr的蛋白組分；3TBl(pMAL-c2X)誘導(dǎo)3hr的蛋白組分；4TBl菌體在誘導(dǎo)劑作用3hr的蛋白組分)圖2重組蛋白rHP-C101純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析(1純化的rHP-C101；2TBl(pMAL-c2X-HP-C101)誘導(dǎo)3hr的蛋白組分；3TBl(pMAL-c2X)誘導(dǎo)3hr的蛋白組分；4TBl菌體在誘導(dǎo)劑作用3hr的蛋白組分；5低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn))圖3各組小鼠胃組織內(nèi)Hp尿素酶活性比較(1rHP-C101+rCTB組；2rHU+rCTB組；3rCTB組；4column buffer組)具體實(shí)施方式
本發(fā)明以下結(jié)合附圖和實(shí)施例作以詳細(xì)的描述實(shí)施例1
本發(fā)明的蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq 2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq 2同源性高于或等于60％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明的蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq 2的核酸分子相比，具有高于或等于60％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于60％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SalIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例2本發(fā)明的蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq 2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq2同源性高于或等于70％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明的蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq 2的核酸分子相比，具有高于或等于70％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于70％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SalIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例3、本發(fā)明的蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq2
MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq2同源性高于或等于80％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明的蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq2的核酸分子相比，具有高于或等于80％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于80％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SalIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例4、本發(fā)明的蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq2同源性高于或等于90％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明的蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq2的核酸分子相比，具有高于或等于90％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于90％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SaIIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例5、本發(fā)明的蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120
AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq2同源性等于100％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明的蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq2的核酸分子相比，具有100％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有100％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SalIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例6、本發(fā)明的蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq2同源性等于100％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明的蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq2的核酸分子相比，具有高于或等于90％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于70％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SalIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例7本發(fā)明的蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180
DYVFTF186相同或包含有與seq2同源性高于或等于90％的的氨基酸序列片段。
本發(fā)明的蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq2的核酸分子相比，具有高于或等于80％的同源性。
本發(fā)明蛋白的制備方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于90％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’SalIP25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’PstI。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
本發(fā)明蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例8、一、本發(fā)明的技術(shù)方案1.幽門螺桿菌HP-C101基因的克隆及測(cè)序采用本室從鄭州胃炎患者胃部分離的幽門螺桿菌菌株MEL-Hp27的染色體DNA為模板，應(yīng)用用PCR方法，得到HP-C101基因片段，將其插入到克隆載體pNEB193中，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。
2.幽門螺桿菌HP-C101基因高效表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化和免疫活性研究用限制性內(nèi)切酶從前面構(gòu)建的重組質(zhì)粒中切下HP-C101，用DNA連接酶，將目的基因連接到原核表達(dá)載體pMAL-c2X中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到能夠使目的基因和麥芽糖結(jié)合蛋白基因融合表達(dá)的重組表達(dá)載體。用酶切和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒。采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。用多糖樹脂制備親合層析柱，純化表達(dá)的重組蛋白rHP-C101。應(yīng)用SDS-PAGE方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物進(jìn)行分析。用純化的rHP-C101和幽門螺桿菌菌體抗原免疫小白鼠，用制備的免疫血清與重組蛋白進(jìn)行Western blot反應(yīng)。
3.重組蛋白rHP-C101免疫保護(hù)活性分析
rHU為基因重組的幽門螺桿菌hspA和ureB融合基因的表達(dá)產(chǎn)物，來(lái)自本室其它研究。采用重組霍亂毒素rCTB為免疫佐劑。將小白鼠分成4組，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠分別用rHP-C101+rCTB、rHU+rCTB經(jīng)口免疫，這些抗原均溶于相同的緩沖液中；2個(gè)對(duì)照組的小鼠分別經(jīng)口灌喂rCTB和緩沖液。每周1次，共免疫4次。距末次免疫7d后，各組均用幽門螺桿菌進(jìn)行攻擊感染，每次每只小鼠經(jīng)口灌喂幽門螺桿菌菌液200μl(5×108CFU)，共接種2次，間隔8hr。在攻擊感染后14d處死小鼠，取鼠胃作尿素酶定性試驗(yàn)和半定量試驗(yàn)、幽門螺桿菌培養(yǎng)、涂片Gram’s染色鏡檢和組織學(xué)檢查，檢測(cè)免疫接種對(duì)幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)定植的影響。
4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSl2.0，計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
二、達(dá)到效果酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示，幽門螺桿菌HP-C101基因被克隆到pNEB193中。MEL-HP27菌株的HP-C101基因的核苷酸序列長(zhǎng)度均為561bp，編碼的氨基酸序列長(zhǎng)186aa。
Seq1HP-C101結(jié)構(gòu)基因序列atgattaaaa gaattgcttg tattttaagc ttgagcacga gtttagcgct tgctggcgaa 60gtgaatgggt tttttatggg tgcgggttat cagcaaggtc gttatggccc ttataacagc 120aattactctg attggcgcca tggcaatgat ctttatggtt tgaatttcaa attaggtttt 180gtaggctttg ccaataaatg gtttggggct agggtgtatg gctttttaga ttggtttaac 240acttcaggga ctgagcacac aaaaaccaat ttgctcacct atggtggcgg tggcgatttg 300attgtcaatc tcattccttt ggataaattc gctctaggtc ttattggtgg cattcagtta 360gccggaaaca cttggatgtt cccttatgat gtcaatcaaa cgagattcca gttcctatgg 420aatttaggcg gaagaatgcg cgttggggat cgcagtgcgt ttgaagcggg cgtgaaattc 480cctatggtta atcagggcag caaagatgta gggcttatcc gctactattc ttggtatgtg 540
gattatgtct ttactttcta a 561Seq 2HP-C101結(jié)構(gòu)基因編碼的氨基酸序列MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186對(duì)構(gòu)建的高效表達(dá)載體pMAL-c2X-HP-C101鑒定結(jié)果正確。用表達(dá)系統(tǒng)TBl(pMAL-c2X-HP-C101)表達(dá)的重組蛋白rHP-C101的分子量70kDa，重組蛋白的表達(dá)量分別占全菌總蛋白的20％，純化后的重組蛋白純度均達(dá)90％。Western blot結(jié)果顯示，該重組蛋白能被相應(yīng)的小鼠免疫血清和小鼠抗幽門螺桿菌菌體抗原血清所識(shí)別。研究結(jié)果說(shuō)明構(gòu)建的TB1(pMAL-c2X-HP-C101)具有較高的表達(dá)效率，且表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。
應(yīng)用幽門螺桿菌感染的小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，定性和半定量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示用rHP-C101免疫接種小鼠，能顯著減少小鼠胃內(nèi)幽門螺桿菌的定殖量，能得到41.2％(7/17)的完全保護(hù)率，與rHU的免疫保護(hù)效果44.4％(8/18)基本相同。
三、實(shí)施方案實(shí)施方案A幽門螺桿菌HP-C101基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建與表達(dá)產(chǎn)物的制備1.材料1.1菌株幽門螺桿菌MEL-Hp27菌株本室從鄭州一例慢性淺表性胃炎患者體內(nèi)分離并保種。
大腸桿菌TBl菌株購(gòu)自英國(guó)New England Biolabs(NEB)公司。
1.2載體克隆載體pNEB193和原核表達(dá)載體pMAL-c2X均購(gòu)自英國(guó)New EnglandBiolabs公司1.3試劑材料和試劑配制1.3.1試劑材料胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、β-巰基乙醇購(gòu)自Sigma公司，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、蛋白酶K、RNA酶、1kb DNA ladder購(gòu)自上海Sangon公司，Taq酶購(gòu)自上海Promega，PstI、SalI、EcoRI、Pyrobest DNA polymerase、dNTP、SDS、T4 DNA連接酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)購(gòu)自TaKaRa公司，DNA純化試劑盒購(gòu)自Vitagene公司。
1.3.2試劑的配制誘導(dǎo)劑IPTG取2g IPTG溶于8ml純水，定容至10ml，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于4℃貯存。
重組蛋白純化試劑過(guò)柱緩沖液(Colomn buffer)取5ml 1M Tris-Cl緩沖液，0.5ml 0.5M EDTA，NaCl2.93g溶于200ml蒸餾水中，調(diào)pH值到7.4，高壓滅菌，于4℃貯存。用前加β-巰基乙醇0.175ml。溶液含20mmol/L Tris-Cl，200mmol/L NaCl，1MEDTA，10mmol/L β-巰基乙醇。
抑制含MBP重組蛋白降解的細(xì)菌培養(yǎng)基取0.8g胰蛋白胨，0.4g酵母浸出粉，0.4g NaCl，溶于80ml蒸餾水中，用10M NaOH調(diào)PH值至7.2，高壓滅菌，4℃貯存，用前加0.8ml 20％葡萄糖。
細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取和SDS-PAGE所用試劑的配制均參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(J.薩姆布魯克著，第二版)。
1.4儀器設(shè)備STRATOS Tgradient溫度梯度基因擴(kuò)增儀(德國(guó)Biomtre公司)，ABl-310測(cè)序儀(日本日立公司)，凝膠圖像分析儀Gene Genius(美國(guó)syugene公司)，SIM-F124雪花制冰機(jī)和MDF-U4086S超低溫水箱(日本三洋公司)，Millipore臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)，SDC-6數(shù)控超低溫恒溫槽(上海新芝生物技術(shù)研究所)，落地式高速冷凍離心機(jī)(HITACH公司)，U-2001紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本HITACH公司)，TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，GNP-9080型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，HH-42型快速恒溫?cái)?shù)顯水箱(常州國(guó)華電器有限公司)，ZD-85型恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)，SK-1型快速混勻器(江蘇金壇醫(yī)療器械廠)，PL-2000C型自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀(江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司)，燭缸式厭氧罐(上海)，DYY-III型瓊脂糖凝膠垂直電泳槽(北京六一儀器廠)，DYY-III型瓊脂糖凝膠水平電泳槽(北京六一儀器廠)。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1幽門螺桿菌的培養(yǎng)與保存采用布氏培養(yǎng)基培養(yǎng)國(guó)內(nèi)幽門螺桿菌菌株MEL-Hp27。幽門螺桿菌培養(yǎng)與保存的方法祥見(jiàn)本研究第三部分。
2.2幽門螺桿菌染色體DNA的提取用接種環(huán)刮取2～3環(huán)用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的幽門螺桿菌菌落，混懸于0.5ml經(jīng)高壓處理的純水中，加入100μl SDS(10％)，100℃水浴5min。加入3μl RNA酶(50μg/ml)，37℃水浴1hr。加入3μl蛋白酶K(50μg/ml)，42℃水浴1hr。依次分別用600μl飽和酚、酚氯仿、氯仿異戊醇各抽提一次。加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇和60μl 2.5M醋酸鈉，于-20℃下放置1hr。15000rpm離心10min。用70％乙醇洗滌沉淀2次，室溫下放置，待乙醇完全揮發(fā)后，將沉淀溶入100μl純水中。
2.3PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank報(bào)導(dǎo)的幽門螺桿菌J99的基因序列，應(yīng)用生物軟件自行設(shè)計(jì)PCR引物，引物由北京賽百盛生物公司合成，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。
P15’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’(SalI)P25’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’(PstI)2.4PCR反應(yīng)2.4.1PCR反應(yīng)體系采用50μl PCR反應(yīng)體系10×Buffer 5.0μl，4×dNTP 4.0μl，上游引物1.5μl，下游引物1.5μl，模板DNA 5.0μl，pyrobest polymerase 0.25μl，去離子H2O 32.75μl。
2.4.2PCR反應(yīng)參數(shù)擴(kuò)增幽門螺桿菌HP-C101基因的PCR反應(yīng)參數(shù)熱啟動(dòng)，95℃ 4min，×1；94℃ 50s，55℃ 40s，72℃ 40s，×30；72℃ 10min，×1。
2.4.3PCR反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定用1.2％的瓊脂糖凝膠鑒定PCR產(chǎn)物。鑒定結(jié)果幽門螺桿菌HP-C101基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳的結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為560bp。
2.5目的的DNA片段的酶切和回收2.5.1幽門螺桿菌HP-C101基因PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體的酶切幽門螺桿菌HP-C101 PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系含PCR產(chǎn)物22μl、10×Buffer 4.0μl、PstI 2.0μl、SalI 2.0μl、去粒子H2O 10μL。
克隆載體pNEB193的酶切反應(yīng)體系含pNEB1934μL(0.5μg/μl)、10×Buffer 4.0μl、PstI 2.0μl、SalI 2.0μl、去離子H2O28μl。
2.5.2目的片段的回收用凝膠DNA回收試劑盒(Vitagene)純化回收酶切后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體?；厥盏倪^(guò)程如下將酶切后的DNA加入到1％的瓊脂糖凝膠中，電泳50min，于紫外燈下切取目的片段所在位置的凝膠，稱量凝膠重量。根據(jù)試劑盒說(shuō)明，每1mg凝膠折算成1μl的體積，計(jì)算出凝膠的體積。加入3倍凝膠體積的DE-A溶液，用槍頭混勻后，75℃水浴加熱8分鐘，其間間斷混勻2次。加入0.5倍凝膠體積的DE-B溶液，充分混勻。然后轉(zhuǎn)移至DNA制備管中，3600g離心1min。棄濾液，將制備管置回離心管中，加入500μl Wl溶液，3600g離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管中，加入700μl W2溶液，3600g離心30s，棄濾液。用W2再洗滌1次。將制備管置回離心管中，12000g離心1min，棄濾液。將制備管放入1個(gè)1.5ml離心管中，在制備管裝帶的DNA吸附膜的中央位置滴加25μl洗脫液，室溫下放置1min，12000g離心1min，將目的DNA洗脫至離心管中。
2.6制備感受態(tài)細(xì)胞從LB培養(yǎng)基平板上挑選E.coli TBl單菌落，接種到5ml LB液體培養(yǎng)基中，180rpm搖振過(guò)夜。取1ml菌液加入100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)約80min，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600≈0.5)時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至兩個(gè)50ml的聚丙烯管中，于冰中放置20min。于4℃，4000g離心10min，倒出上清。用10ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2重懸細(xì)菌，置于冰中30min。于4℃，4000g離心10min，倒出上清。每管中加4ml 0.1M的CaCl2溶液，重懸細(xì)菌，按每管200μl菌液進(jìn)行分裝。加甘油后，置于-70℃下貯存。
2.7載體和目的片段的連接幽門螺桿菌HP-C101基因與載體連接反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物3μl、10×Buffer 2μl、pNEB 1932μl、T4DNA ligase 1μl、去離子H2O 12μl。于22℃下進(jìn)行連接反應(yīng)8hr。
2.8轉(zhuǎn)化與篩選將連接產(chǎn)物分成7μl和13μl兩份，分別加到兩個(gè)裝有200μl感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，用槍頭混勻，置冰上放置30min，再42℃水浴2min。迅速將離心管轉(zhuǎn)移至冰中，冷卻2min。在每管中加入800μl LB培養(yǎng)基，于37℃下，180rpm搖振培養(yǎng)45min。8000g離心2min，棄上清800μl，用剩余的上清將細(xì)菌重懸。在預(yù)先涂有40μl X-gal和4μl IPTG的、含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基平板上將菌液涂勻。于37℃溫箱中，培養(yǎng)14hr。
2.9重組質(zhì)粒的鑒定2.9.1提取質(zhì)粒挑選白色菌落，接種到5ml含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖振培養(yǎng)8hr。取1ml菌液，10000g離心2min，棄上清。加預(yù)冷的質(zhì)粒提取液I 100μl，充分混勻，再加入質(zhì)粒提取液II 200μl，混勻后，置冰上2min。加預(yù)冷的質(zhì)粒提取液III 150μl，混勻，冰上放置3min，12000g離心10min。取上清，用等體積的酚氯仿和氯仿異戊醇各抽提1次，12000g離心5min。取上層液體，加2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后，于-20℃放置2hr。12000g離心5min，棄上清，用500μl 70％乙醇洗滌沉淀1次。12000g離心5min，棄上清，室溫下放置至乙醇揮發(fā)干凈，加40μl去離子水和3μlRNA酶(10mg/ml)，37℃水浴30min。提取的質(zhì)粒置于-20℃下貯存。
2.9.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定pNEB193-HP-C101重組質(zhì)粒的鑒定將提取的質(zhì)粒用PstI和SalI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠圖像分析儀進(jìn)行分析鑒定。鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒酶切后電泳圖譜為2條帶，一條帶與酶切后空載體分子量相近，另一條帶與基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分子量相近，證明基因片段己被插入到克隆載體中。
2.10重組質(zhì)粒中目的基因的測(cè)序pNEB193-HP-C101重組質(zhì)粒委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序部對(duì)克隆的幽門螺桿菌MEL-HP 27菌株HP-C101基因進(jìn)行測(cè)序。
HP-C101基因的測(cè)序結(jié)果2.11基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建重組質(zhì)粒pNEB193-HP-C101和表達(dá)載體pMAL-c2X均用SalI和PstI進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用Vitagene試劑盒對(duì)目的DNA片段進(jìn)行回收。將酶切純化的目的基因、質(zhì)粒pMAL-c2X于4℃水浴連接16hr。取200μl常規(guī)方法制備的E.coli TB1感受態(tài)細(xì)菌，加入10μl的連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂于含氨芋青霉素(100μg/ml)、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上，37℃孵育約16hr。
挑選白色單菌落，接種在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下，190rpm搖菌12hr，然后提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用PstI和SalI進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定。重組質(zhì)粒酶切后電泳圖譜為2條帶，一條帶與酶切后的空載體分子量相近，另一條帶與基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分子量相近。證明基因片段已被插入到表達(dá)載體中。
2.12目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定過(guò)的陽(yáng)性克隆菌落接種到5ml含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下，180rpm搖菌過(guò)夜。取800μl菌液加入到80ml的相同的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下，250rpm，搖菌80min，加入48μl的IPTG，誘導(dǎo)3hr后終止。
2.1.3重組蛋白的純化將誘導(dǎo)完成后得到的菌液分裝到兩個(gè)50ml的離心管中，于4℃下，在低溫離心機(jī)中，4000rpm離心20min。倒去上清，加入5ml過(guò)柱緩沖液，置-20℃下放置過(guò)夜。置冷水中融化后，進(jìn)行超生粉碎。超生過(guò)程中采用碎冰制冷，工作參數(shù)為功率600W，粉碎10s，間歇10s，工作總時(shí)間為200s。于4℃下，以9000g轉(zhuǎn)速離心20min，吸取上清。在20ml的注射器中放入3層硅烷化的石棉網(wǎng)，加入500μl的多糖樹脂(amylose resin)，緩慢勻速加入4ml的過(guò)柱緩沖液。然后加入細(xì)菌上清液，棄濾過(guò)液。用5ml加有麥芽糖的過(guò)柱緩沖液洗脫重組蛋白，收集濾過(guò)液，于-20℃貯存。
2.1.4表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析分析誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，取1ml菌液，4000rpm離心1min，棄上清，在沉淀中加入100μl蒸餾水和100μl的2倍濃度的SDS-PAGE樣品緩沖液，混勻后，100℃水浴5min，上樣前10000rpm離心5min，取上清加樣。
分析純化產(chǎn)物時(shí)，取20μl收集的樣品中加等體積的2倍濃度的SDS-PAGE樣品緩沖液，于100℃水浴5min，10000g離心5min，取上清加樣。
采用5％的濃縮膠和12％的分離膠。電泳開(kāi)始時(shí)采用90mV電壓，待溴酚蘭泳至分離膠時(shí)，電壓換成140mV，電泳總時(shí)間約4.5hr。凝膠用考馬斯亮蘭R250染色。
結(jié)果用表達(dá)系統(tǒng)TB1(pMAL-c2X-HP-C101)表達(dá)的重組蛋白rHP-C101的分子量70kDa，重組蛋白的表達(dá)量分別占全菌總蛋白的20％，純化后的重組蛋白純度均達(dá)90％。
實(shí)施方案B幽門螺桿菌基因重組表達(dá)蛋白rHP-C101的免疫保護(hù)效果1.材料1.1菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物幽門螺桿菌由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供3周齡，雄性昆明小鼠20只，每只體重16g～18g左右。
1.2試劑材料和配制1.2.1試劑材料胰蛋白胨、酵母提取購(gòu)自O(shè)XOID公司，抑菌劑多粘菌素B購(gòu)自AMRESC公司，萬(wàn)古霉素購(gòu)自GIBCO公司，兩性霉素B購(gòu)自Sigma公司，磺胺增效劑購(gòu)自中國(guó)藥品檢驗(yàn)所，革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自四川邁克科技有限公司。小牛血清為天津H&Y生物技術(shù)有限公司。rHU為本室在其它研究中構(gòu)建的幽門螺桿菌熱休克蛋白基因和尿素酶基因融合表達(dá)蛋白。粘膜佐劑rCTB由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院黃留玉研究員惠贈(zèng)1.2.2試劑配制固定液的配制中性緩沖甲醛溶液；37％的甲醛100ml，磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)4g，磷酸氫二鈉(無(wú)水)6.5g，用蒸餾水定容至1000ml。Warthin-Starry硝酸銀染色試劑(1)醋酸鹽緩沖液取無(wú)水醋酸鈉8.2g，醋酸12.5ml，用蒸餾水定容至1000ml，測(cè)定pH值應(yīng)在3.6～3.8之間，使用時(shí)稀釋100倍用作為工作液。
(2)1％AgNO3取AgNO30.5g，溶入醋酸鹽緩沖液50ml中。
(3)顯影液包括下列三種溶液A液對(duì)苯二酚300mg溶入醋酸鹽緩沖液10ml(3％)。
B液明膠10g溶入醋酸鹽緩沖液200ml中(5％)。
C液AgNO32g溶入醋酸鹽緩沖液100ml中(2％)。
Giemsa染色液取6g Giemsa染料加蒸餾水300ml，輕搖使之溶解，室溫貯存，用前過(guò)濾。
HE染色試劑(1)蘇木素染色液先將2.5g蘇木素溶于25ml無(wú)水乙醇中，將預(yù)先已溶解2.5g明礬的蒸餾水加入蘇木素乙醇液中，加熱使溶液盡快沸騰后，熄滅火源，緩慢加入氧化汞1.25g，防止溶液濺出，繼續(xù)煮沸2min，將燒杯立即浸入冷水中，至染液冷卻后，加入20ml冰醋酸，用蒸餾水將總體積調(diào)至500ml，室溫保存，用前過(guò)濾。
(2)伊紅Y染色液將0.75g伊紅Y溶解于75ml蒸餾水中，然后加入25ml95％乙醇，加冰醋酸1～2滴。
(3)蘇木素分色液取濃鹽酸1ml，，用75％的乙醇加至100ml。
尿素酶試劑蛋白胨0.1g，NaCl 0.5g，KH2PO4 0.2g，葡萄糖0.1g，尿素2g，加蒸餾水至100ml，4℃保存。用前加0.5％酚紅1.5ml。
1.3儀器和設(shè)備組織切片機(jī)(上海醫(yī)療器械廠)，GNP-9080型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，燭缸式厭氧罐(上海)，U-2001紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本HITACH公司)。
2實(shí)驗(yàn)方法2.1H.pylori的培養(yǎng)、鑒定和保存2.1.1固體培養(yǎng)采用布氏肉湯培養(yǎng)基，配制方法如下取胰蛋白胨2g、酵母浸出粉0.2g、大豆蛋白胨2g、氯化鈉1g、亞硫酸鈉0.02g、瓊脂粉3g，加入200ml蒸餾水，調(diào)pH值至7.2，121℃高壓滅菌20min。待培養(yǎng)基冷卻至50℃～60℃，加入16ml抗凝羊血，按如下劑量加入抗生素0.1ml多粘菌素(2500u/L)，0.5ml兩性霉素(2mg/L)，0.5ml萬(wàn)古霉素(10mg/L)，0.2ml TMP(5mg/L)，充分混勻后，倒入經(jīng)高壓滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中。接種幽門螺桿菌后，將培養(yǎng)板置厭氧罐中，37℃下培養(yǎng)3d～4d。
2.1.2液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的配制與固體培養(yǎng)基不同的是不加瓊脂粉和羊血，而在每100ml培養(yǎng)基中加入10ml的胎牛血清。高壓前即將培養(yǎng)基裝入帶有兩個(gè)通氣管的三角燒瓶中，高壓后加入血清和抗生素，在200ml培養(yǎng)基中加入200μl保存的菌液，在培養(yǎng)瓶中充入含80％氮?dú)狻?5％二氧化碳和5％氧氣的混合氣體。37℃下，120rpm，搖震培養(yǎng)72hr。
2.1.3幽門螺桿菌的鑒定形態(tài)學(xué)先肉眼觀察菌落形態(tài)，劃線接種的幽門螺桿菌菌落呈透明針尖樣，直徑約1mm。然后制作細(xì)菌涂片，在潔凈載玻片上滴加1滴生理鹽水，用接種環(huán)刮取固體培養(yǎng)的幽門螺桿菌菌落，在生理鹽水中將細(xì)菌涂勻，室溫晾干，用酒精燈火焰固定標(biāo)本。標(biāo)本經(jīng)Gram’s染色后，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌著紅色，為Gram’s染色陰性細(xì)菌。菌體呈短桿狀或海鷗，多數(shù)有明顯的彎曲。未見(jiàn)有球形變菌體。從形態(tài)看，細(xì)菌狀態(tài)良好，可以用于攻擊感染小鼠。
生化反應(yīng)采用尿素酶反應(yīng)試驗(yàn)。用接種環(huán)刮取一環(huán)幽門螺桿菌菌落，加入到2ml自制的尿素酶試劑中，試劑顏色在5分鐘內(nèi)即由淺黃色變成紅色。
2.1.4保存從固體培養(yǎng)平板上刮取菌落，在裝有200μl保存液的離心管中將細(xì)菌涂散，與保存液混勻后，置-80℃冰箱中保存。復(fù)蘇時(shí)，從冰箱中取出后即手握暖融，然后置冰上，盡快接種到培養(yǎng)基中。本室采用的幽門螺桿菌保存液含10％的蔗糖和50％的小牛血清。
2.2動(dòng)物分組和免疫方案1組為實(shí)驗(yàn)組，含小鼠18只，經(jīng)口灌喂rHP-C101+rCTB 200μl只/次，含rHP-C101 40μg，rCTB 5μg。
2組為實(shí)驗(yàn)組，含小鼠18只，同時(shí)灌喂rHU+rCTB 200μl/只/次，含rHU 40μg，rCTB 5μg。
3組為免疫佐劑對(duì)照組，含小鼠8只，經(jīng)口灌喂rCTB 200μl/只/次，含rCTB 5μg。
4組為陰性對(duì)照組，含小鼠18只，經(jīng)口灌喂過(guò)柱緩沖液200μl/只/次。過(guò)柱緩沖液的配方見(jiàn)第二部分。
在經(jīng)口免疫前，小鼠禁食12hr，禁水4hr。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別按上述分組執(zhí)行免疫方案，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第0、7、14、21天各免疫一次，免疫后4小時(shí)恢復(fù)食水。
2.3幽門螺桿菌攻擊感染在末次免疫后1w，各組均用幽門螺桿菌進(jìn)行攻擊感染，攻擊感染前禁食24hr，禁水4hr，每只小鼠經(jīng)口灌喂幽門螺桿菌菌液200μl，含幽門螺桿菌菌體5×108CFU，間隔8hr，共攻擊感染2次。距末次攻擊后4hr，解除禁食。在攻擊感染14d后處死小鼠。
2.4細(xì)菌定植的評(píng)價(jià)斷頸處死小鼠后立即剖腹取胃，沿大彎側(cè)將鼠胃剪開(kāi)，以無(wú)菌生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物，沿縱軸將胃切為2部分，一份置10％福爾馬林中固定供組織學(xué)檢查，另一份胃組織再分成3份分別用于尿素酶試驗(yàn)、涂片和幽門螺桿菌培養(yǎng)鑒定。
2.4.1尿素酶反應(yīng)的半定量和定性試驗(yàn)先從胃竇部取3mm×3mm大小全層胃組織，置于裝有500μl尿素酶檢測(cè)試劑的1.5ml離心管中，室溫靜置6小時(shí)，測(cè)定試劑在550nm的OD值。用5只同批購(gòu)進(jìn)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理的小鼠的胃組織，求取尿素酶反應(yīng)的基線值。用OD值均數(shù)加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為陽(yáng)性判別標(biāo)準(zhǔn)。
2.4.2涂片Gram’s染色取胃竇部胃組織，將粘膜面貼在干凈載玻片上，用鑷子按壓組織，并使之在玻片上滑動(dòng)，涂片后，自然干燥，酒精燈火焰固定，Gram’s染色，油鏡下觀察，幽門螺桿菌染成紅色。根據(jù)幽門螺桿菌形態(tài)特征，對(duì)幽門螺桿菌進(jìn)行初步鑒定。
2.4.3幽門螺桿菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)取胃竇部胃組織，將粘膜面貼在固體布氏培養(yǎng)基平板上，用鑷子按壓組織，在培養(yǎng)基上反復(fù)涂抹，接種完成后，將培養(yǎng)平板置于厭氧罐中，按前述的方法進(jìn)行幽門螺桿菌的培養(yǎng)和鑒定。
2.4.4組織學(xué)檢查組織塊用10％福爾馬林常規(guī)固定后，經(jīng)70％～100％濃度成梯度分布的乙醇上行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備組織蠟塊。用組織蠟塊作垂直切片，將切下的蠟帶用毛筆掃入溫水中，用常規(guī)處理過(guò)的載玻片，撈起蠟帶。60℃烤片2hr。用下述3種染色方法進(jìn)行染色。
Warthin-Starry硝酸銀染色石蠟切片按一定的方向裝入染色架，入二甲苯中脫蠟4min，重復(fù)一次。依次經(jīng)100％，100％，95％，90％，80％，70％乙醇下行入水，在自來(lái)水中，流水沖洗3min，至切片清晰。入醋酸緩沖液洗一次。切片置1％AgNO3溶液中，孵育30min。將預(yù)先配制的明膠和對(duì)苯二酚液混合后，加入2％的AgNO3液，混勻后倒入染色缸中，5％明膠、3％對(duì)苯二酚和2％硝酸銀的混合比例為15∶1∶2。室溫下觀察切片上組織顏色的變化情況。組織變棕黃色后，立即倒去顯色液，用55℃溫水洗2次，醋酸緩沖液洗1次。用70％～100％乙醇依次上行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。標(biāo)本上，組織的細(xì)胞核和幽門螺桿菌菌體顯黑色，組織細(xì)胞胞漿和粘液著淺黃色。
改良的Giemsa染色石蠟切片入二甲苯中脫蠟4min，重復(fù)一次。依次經(jīng)100％，100％，95％，90％，80％，70％乙醇下行入水，在自來(lái)水中，流水沖洗3min，至切片清晰。入2％Giemsa染色液中染色30min，自來(lái)水流水洗去染液，100％乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。幽門螺桿菌菌體顯深藍(lán)色。
HE染色組織切片經(jīng)脫蠟和梯度乙醇處理下行入水，入蘇木素染色液中染色15min，流水洗去染液。采用1％鹽酸酒精分色。流水沖洗1min以上，以去除切片中的酸性物質(zhì)，伊紅染色5min，常規(guī)脫水、透明、封片。胞核染成藍(lán)色，胞漿和幽門螺桿菌均染成淡紅色。
3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組計(jì)量資料之間的比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD法。計(jì)數(shù)資料分析采用x2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
應(yīng)用尿素酶試驗(yàn)對(duì)小鼠胃組織尿素酶活性進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表1，各組小鼠胃組織尿素酶活性的比較見(jiàn)圖3。免疫/攻擊后，采用4種檢測(cè)方法檢測(cè)小鼠胃內(nèi)幽門螺桿菌定植的陽(yáng)性率，檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表2。四種方法的檢測(cè)結(jié)果并不完全一致。本研究依據(jù)幽門螺桿菌培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算各種抗原的免疫保護(hù)率。組間保護(hù)率差異性的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示rHP-C101+rCTB組、rHU+rCTB組的免疫保護(hù)率高于緩沖液組和rCTB組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而rHP-C101+rCTB組與rHU+rCTB組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；保存液組和rCTB組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
表1 小鼠胃組織尿素酶活性的檢測(cè)結(jié)果(x±s)Table 4.1 Result of urease assay with mouse gastric tissue(x±s)

NoterHP-C101+rCTB Group vs rCTB，P＜0.05；rHP-C101+rCTB Group vs columnbuffer，P＜0.05；rHP-C101+rCTB Group vs rHU+rCTB，P＞0.05；rCTB group vs columnbuffer，P＞0.05.
表2 各組小鼠的幽門螺桿菌定植情況Table 2 Colonjzation of H.pylori in the mice of different groups

權(quán)利要求
1.一種蛋白，其特征在于其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq 2MIKRIACILSLSTSLALAGEVNGFFMGAGYQQGRYGPYNSNYSDWRHGNDLYGLNFKLGF 60VGFANKWFGARVYGFLDWFNTSGTEHTKTNLLTYGGGGDLIVNLIPLDKFALGLIGGIQL120AGNTWMFPYDVNQTRFQFLWNLGGRMRVGDRSAFEAGVKFPMVNQGSKDVGLIRYYSWYV180DYVFTF186相同或包含有與seq 2同源性高于或等于60％的的氨基酸序列片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白，其特征在于編碼所述蛋白的核酸分子與編碼所述氨基酸序列seq 2的核酸分子相比，具有高于或等于60％的同源性。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述蛋白的方法，其特征在于它是采用與下列核苷酸序列P1、P2中任一序列具有大于或等于60％同源性的核苷酸序列為擴(kuò)增所述蛋白基因的引物；P1 5’-GGGGTCGACATGATTAAAAGAATTGCT-3’Sal IP2 5’-GGGCTGCAGTTAGAAAGTAAAGACATA-3’Pst I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白制備方法，其特征在于它是采用原核表達(dá)載體構(gòu)建所述蛋白基因的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的蛋白制備方法，其特征在于它是用上述基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，實(shí)施所述蛋白基因的重組表達(dá)和純化制備。
6.一種如權(quán)利要求1所述蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白是用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷，包括制備預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗、藥物或診斷試劑。
7.根據(jù)權(quán)利求6所述蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種組合物，該組合物包含免疫原性有效量如權(quán)利要求1的蛋白，或包含保持抗幽門螺桿菌感染保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述蛋白，任選包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、疫苗載體及免疫佐劑。
8.根據(jù)權(quán)利求7所述蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述組合物應(yīng)用于幽門螺桿菌感染的預(yù)防、治療和診斷。
9.根據(jù)權(quán)利求6所述蛋白的應(yīng)用，其特征在于制備一種人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷試劑或診斷試劑盒，其中含有被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利求6所述的蛋白的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白用于人類及其他哺乳動(dòng)物幽門螺桿菌感染的診斷，其包括如下步驟①將與固相載體結(jié)合的權(quán)利要求1所述蛋白與從人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的體液接觸；②檢測(cè)來(lái)自上述體液與上述蛋白抗原結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種幽門螺桿菌蛋白及其制備方法與應(yīng)用，其氨基酸序列與下列幽門螺桿菌蛋白氨基酸序列seq2相同或包含有與seq2同源性高于或等于60％的氨基酸序列片段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下成功地克隆到幽門螺桿菌蛋白的基因片段，說(shuō)明本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物效能良好。構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)具有較高表達(dá)效率，表表達(dá)系統(tǒng)是制備和研究這種蛋白抗原的理想工具。證明了幽門螺桿菌蛋白的基因重組表達(dá)蛋白具有良好的免疫活性，具有疫苗應(yīng)用價(jià)值。此研究結(jié)果顯示具有較強(qiáng)免疫保護(hù)效果，可以作為疫苗抗原。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1840541SQ20051001747
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日
發(fā)明者段廣才, 張榮光 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)