一種幽門螺桿菌快速生長添加劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種幽門螺桿菌快速生長添加劑，該快速生長添加劑制備用各組份以質量份表示如下：豬胃500份；牛肉500份；氯化鈉7份；不溶性淀粉1份；尿素1份；純凈水適量；碳酸氫鈉適量，調節(jié)pH值7.4～7.6。通過依次對原材料預處理、切塊、兩次煮沸、過濾、合并濾液冷藏、再煮沸、冷卻，過濾，定容、加氯化鈉、不溶性淀粉和尿素溶解、調節(jié)pH、滅菌、貯存。本發(fā)明的快速生長添加劑能夠促使指示菌縮短體外培養(yǎng)時的延滯期時間，有效縮短指示菌在培養(yǎng)基上生長繁殖的時代時間，提高檢測陽性率，供制備出優(yōu)質的幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基。該快速生長添加劑可采用本發(fā)明所披露的制備方法制備得到。
【專利說明】一種幽門螺桿菌快速生長添加劑及其制備方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及一種快速生長添加劑，具體涉及一種用于制備優(yōu)質幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基的幽門螺桿菌快速生長添加劑及其制備方法。
【背景技術】
[0003]一般細菌的生長繁殖具有以下特征:
一、細菌的個體生長繁殖
細菌通常以簡單的無性二分裂法繁殖，極個別的細菌可有分枝狀分裂的方式。在適宜條件下，多數(shù)細菌繁殖速度很快，分裂一次僅需20?30min ;少數(shù)細菌繁殖較慢，如結核桿菌約18?20h分裂一次。
[0004]二、細菌的群體生長繁殖
細菌繁殖很快，一般細菌以20min分裂一次，即一代。按此速度計算，經IOh后，一個細菌將繁殖成23°個菌，細菌群體將出現(xiàn)龐大至難以想象的程度。但由于細菌營養(yǎng)物質的耗竭，毒性產物的積累，經過一段時間后，細菌繁殖速度逐漸減慢，死亡菌數(shù)則不斷增多，活菌增長率隨之將趨于停滯至衰退。
[0005]經適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細菌群體的生長繁殖一般可分為四期:. (I)、延滯期:
延滯期(O?a)——細菌數(shù)目保持不變或略有下降，倍增速率為零。
[0006]遲緩期:此時細菌尚未開始繁殖，只是為繁殖作準備。以菌種、菌齡與接種量和營養(yǎng)物的不同而異，遲緩期可從數(shù)小時至數(shù)天不等。
[0007]注:適應新的環(huán)境，合成新的酶，有時可見到接種群體大部分死亡，如果接種用的是饑餓的細菌或新的培養(yǎng)基的營養(yǎng)不豐富，則該時期延長。
[0008]加速生長期(a?b)——細菌開始增殖，倍增速率(世代時間的倒數(shù)，即單位時間內的分裂次數(shù))隨時間的延長，而使菌數(shù)增大。
[0009](2)、對數(shù)期:
對數(shù)生長期(b?c)——倍增速率達到最大值，且保持垣定，它說明平均世代時間不變，細菌數(shù)目以幾何級數(shù)增長。
[0010]細菌生長迅速，以恒定的速度進行分裂繁殖，通常菌數(shù)以幾何級數(shù)增長。此時的細菌的形態(tài)、染色性、生理活性等較典型、對外界環(huán)境因素的作用也較為敏感。多數(shù)細菌約在培養(yǎng)18?24h左右。
[0011]注:其速率取決于培養(yǎng)基組分和環(huán)境因子。
[0012]減速生長期(c?d)——倍增速率隨時間的延長而減少，平均世代時間也延長。
[0013]注:由于一種或多種底物的濃度成為限制因子，使倍增速率隨之降低。
[0014](3)、穩(wěn)定期:穩(wěn)定期(d?e)-生長速率與死亡速率相等,倍增速率為零,活菌數(shù)目保持垣定。
[0015]穩(wěn)定期:對數(shù)期之后，細菌繁殖速度趨于下降，細菌死亡數(shù)則逐步上升，此期細菌繁殖數(shù)與死亡數(shù)幾乎相等。是由于培養(yǎng)基上營養(yǎng)物質消耗，供不應求、毒性產物逐漸積聚，培養(yǎng)基PH下降等。細菌的代謝產物如抗生素、外毒素等，多在此期產生。芽孢也多在此期形成。
[0016]注:由于營養(yǎng)耗盡和有害代謝產物積累,細菌停止增殖,但菌體仍然存活,利用細胞內的能量儲存物質維持生存。其些G+和許多真核微生物，在減速期后進入產孢期，其生存與產孢所需的能量也是由于對數(shù)期積累的能量物質所提供。
[0017](4)、死亡期:
衰亡期:隨著穩(wěn)定期繼續(xù)發(fā)展，細菌繁殖速度越來越慢、死亡越來多，活菌數(shù)急劇下降，死菌數(shù)明顯超過活菌數(shù)，但細菌總數(shù)(包括活菌與死菌)并不減少。有些菌死亡后發(fā)生自溶，則細菌總數(shù)也可下降。
[0018]加速死亡期(e?f)——死亡速率超過生長速率，并越來越大，活菌數(shù)目迅速減少。
[0019]對數(shù)死亡期(f?g)——死亡速率超達到最大值,并保持恒定。
[0020]殘留期(h?)——死亡速率降低，從理論上講，只要培養(yǎng)基不干涸，少數(shù)細菌仍可活較長時間。
[0021]細菌的生長曲線 在研究工作和生產實踐中都有指導意義。但必須指出，上述生長曲線僅在體外人工培養(yǎng)的條件時能出現(xiàn)，并受培養(yǎng)基成分、PH值、培養(yǎng)溫度等因素的影響。而細菌在人體或動物體內生長繁殖，并不存在這樣典型的生長曲線。
[0022]細菌在培養(yǎng)基上有一個適應時間，即延滯期((O?a)，一般需要2h，進入對數(shù)生長期后一般需要20min繁殖一代，同時個別弱小菌體存在生長不良的問題。為保證幽門螺桿菌檢測，縮短幽門螺桿菌生長的世代時間，提高檢測陽性率，制備優(yōu)質幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基，有必要在培養(yǎng)基中加入幽門螺桿菌快速生長添加劑。
[0023]
【發(fā)明內容】

本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種幽門螺桿菌快速生長添加劑，該添加劑能夠縮短幽門螺桿菌生長的世代時間，提高檢測陽性率，本發(fā)明還提供了該幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備方法。
[0024]為解決以上技術問題，本發(fā)明研究了一種幽門螺桿菌快速生長添加劑，該快速生長添加劑以豬胃、牛肉為原材料，加純凈水煮沸，濾液中添加氯化鈉、不溶性淀粉和尿素制備得到，制備用各組份以質量份表示如下:
豬胃500份；
牛肉500份；
氯化鈉7份；
不溶性淀粉 I份；
尿素I份；
純凈水適量；
碳酸氫鈉適量，調節(jié)pH值7.4?7.6。
[0025]進一步地，所述豬胃、牛肉采用新鮮所得或使用前貯存在4?8°C環(huán)境中< 8h。[0026]進一步地，所述純凈水pH值5.0-7.0，電導率≤5.0 μ s/cm。
[0027]進一步地，所述不溶性淀粉為干燥玉米去皮，研磨成細顆粒，再用100目細篩過篩后所得。
[0028]前述幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟:
(1)、將作為原材料的豬胃和牛肉進行預處理，并切成小塊；
(2)、將步驟(1)切成小塊的原材料與質量為原材料兩倍量的純凈水混合，加熱煮沸Ih后過濾,收集濾液A ;
(3)、將步驟(2)所得濾渣與質量為原材料一倍量的純凈水混合，加熱煮沸Ih后過濾，收集濾液B ；
(4)、將步驟(2)與步驟(3)所得的濾液A和濾液B混合，并置于4°C環(huán)境中過夜，然后刮掉油脂，過濾，得新的濾液C ;
(5)、將步驟(4)所得的濾液C加熱煮沸使其質量濃縮至原材料量；
(6)、將步驟(5)煮沸的濾液C冷卻至50-60°C，過濾，收集濾液D，并加純凈水補充至每毫升濾液中含有豬胃和牛肉各0.5克；
(7)、加入氯化鈉、不溶性淀粉和尿素，攪拌溶解；
(8)、用碳酸氫鈉調節(jié)pH值7.4-7.6 ;
(9 )、滅菌處理，冷卻，得幽門螺桿菌快速生長添加劑。
[0029]進一步地，步驟(I)所述預處理包括依次對豬胃、牛肉原材料用自來水漂洗干凈、去筋、去膜、去油脂，再依次用自來水浸泡、漂洗干凈，然后濾掉水份，晾干。
[0030]進一步地,步驟(2)和步驟(3)采用紗布過濾；步驟(4)和步驟(6)采用棉花過濾。
[0031]進一步地，步驟(9)所述滅菌處理為將步驟(8)所得的液體分裝，然后置于壓力蒸汽滅菌器內，121°C條件下滅菌20min。
[0032]進一步地，所得幽門螺桿菌快速生長添加劑置于O-4°C環(huán)境中貯存。
[0033]本發(fā)明的快速生長添加劑能夠促使指示菌縮短體外培養(yǎng)時的延滯期時間，可以從2h縮短到lh，有效縮短指示菌在培養(yǎng)基上生長繁殖的時代時間，使世代時間小于20min，提高檢測陽性率，促使弱小菌體生長良好，供制備出優(yōu)質的幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基。該快速生長添加劑可采用本發(fā)明所披露的制備方法制備得到。
【具體實施方式】
[0034]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
[0035]本發(fā)明的實施例1:
一、幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備:
(1)、取500g豬胃、500g牛肉作為原材料，用自來水漂洗干凈、去筋、去膜、去油脂，再依次用自來水浸泡、漂洗干凈，然后濾掉水份，晾干，并切成I cm3大小的小塊，其中原材料要求色澤鮮艷、新鮮、無異味、無油脂，采用新鮮所得，如果未能及時使用，則可以貯存于4?8°C環(huán)境中不超過8小時以實現(xiàn)保鮮，一般為4-8小時；
(2)、將步驟(1)切成小塊的原材料置于大桶內，加入質量為原材料兩倍量的純凈水混合，加熱煮沸Ih后用紗布過濾，收集濾液A ；
(3)、將步驟(2)所得濾渣置于大桶內，加入質量為原材料一倍量的純凈水混合，加熱煮沸Ih后用紗布過濾，收集濾液B ；
(4)、將步驟(2)與步驟(3)所得的濾液A和濾液B混合，并置于4°C環(huán)境中過夜，然后刮掉油脂，立即用棉花過濾，得新的濾液C ；
(5)、將步驟(4)所得的濾液C置于大桶內，加熱煮沸使其質量濃縮至原材料量；
(6)、將步驟(5)煮沸的濾液C冷卻至50-60°C，用棉花過濾，收集濾液D，并加純凈水補充至每毫升濾液中含有豬胃和牛肉各0.5克；
(7)、加入7g氯化鈉、Ig不溶性淀粉(由干燥玉米去皮，研磨成細顆粒，再用100目細篩過篩后所得。)和Ig尿素，用玻璃棒攪拌溶解；
(8)、用1%(質量)的碳酸氫鈉調節(jié)pH值7.4?7.6 ;
(9)、分裝步驟(8)所得液體，IOOml/瓶，然后置于壓力蒸汽滅菌器內，121°C條件下滅菌處理20min，冷卻后取出，得幽門螺桿菌快速生長添加劑，置于O?4°C環(huán)境中貯存，備用。
[0036]拿起裝有所述幽門螺桿菌快速生長添加劑的瓶子，對著光線，輕輕搖動，用肉眼觀察外觀，要求外觀呈淡黃色粘液狀液體，無顆粒雜質。用酸度計測定PH值為7.4?7.6。
[0037]以上制備過程所用的純凈水的酸堿度pH值5.0?7.0，電導率≤5.0 μ s/cm。
[0038]二、促生長試驗:
1、材料
(I)、指示菌:金黃色葡萄球菌ATCC 25923。說明:ATCC為美國菌種保藏中心，即美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection)的簡寫,ATCC所給的菌株編號為25923，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)以及中國典型微生物保藏中心(CCTCC)等我國保藏單位均有售。
[0039](2)、培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(米用市售)；
營養(yǎng)瓊脂(采用市售)。
[0040](3)、試劑:0.85% (質量)鹽水(經滅菌處理)；
(4)、器材:15mmX 150mm試管若干(經滅菌處理)；
Iml和IOml的移液管若干(經滅菌處理)；
平皿(經滅菌處理)。
[0041](5)、試驗培養(yǎng)基制備:取90毫升營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,置于100毫升三角燒瓶內，加入10毫升本發(fā)明制備的快速生長添加劑，充分混勻，分裝于試管，每支9毫升，121°C滅菌20mino
[0042](6)、對照培養(yǎng)基制備:100毫升營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，分裝于試管，每支9毫升，121°C滅菌20min。
[0043]2、方法:
(I)、菌懸液制備計數(shù):
A、用接種環(huán)，挑取金黃色葡萄球菌菌種，接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，作分離。
[0044]B、平板置于36°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18小時。
[0045]C、用接種環(huán)挑取二只直徑為1.5毫米的金黃色葡萄球菌菌落，置于2毫升的滅菌
0.85% (質量)鹽水中，用接種環(huán)研磨成菌懸液。[0046]D、取滅菌試管6支，每支試管中加入滅菌0.85% (質量)鹽水9毫升。
[0047]E、用滅菌I毫升移液管，吸取菌懸液I毫升，加入第I支試管中，稀釋度為10'
[0048]F、另取I支滅菌I毫升移液管，吹打第I支試管中的液體，使其充分混勻，吸取I毫升混和的菌懸液，置于第2支試管中，稀釋度為10_2。
[0049]G、另取I支滅菌I毫升移液管，吹打第2支試管中的液體，使其充分混勻，吸取I毫升混和的菌懸液，置于第3支試管中，稀釋度為10_3。
[0050]H、依上述過程類推，用同樣的方法，直至將菌懸液稀釋為10_6。
[0051]1、另取I支滅菌I毫升移液管，吸取I毫升稀釋度為10_6的混和菌懸液，置于滅菌平皿中，共4只滅菌平皿。
[0052]J、每只滅菌平皿中，傾注入已熔化、并冷卻到42?45°C的營養(yǎng)瓊脂18?20ml，充分混勻。凝固后，置于36°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18小時。
[0053]K、取出，計數(shù)。
[0054]結果:85、83、82、82。
[0055]得到平均為83cfu/皿,其中，cfu為菌落形成單位(Colony-Forming Units)。
[0056]菌懸液菌量為8.3 X 107cfu/ml。
[0057](2)、促生長試驗
A、取試驗培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基各6支試管,每支試管中放9ml試驗培養(yǎng)基或對照培養(yǎng)基，再分別加入按前述菌懸液制備計數(shù)中所述稀釋方法得到的稀釋度為10_5菌懸液各I毫升，得到稀釋度為10_6菌懸液。
[0058]B、將試管置于36°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2小時。
[0059]C、用滅菌I毫升移液管,從各試管中吸取培養(yǎng)2小時的菌懸液I毫升,各置于一個滅菌平皿中，每只平皿中分別傾注入已熔化、并冷卻到42?45°C的營養(yǎng)瓊脂18?20ml，充分混勻。凝固后，置于36°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18小時。
[0060]D、取出，計數(shù)。
[0061]結果:
試驗培養(yǎng)基菌落數(shù):106、102、110、109、105、108。平均為:106.67cfu/ 皿。
[0062]對照培養(yǎng)基菌落數(shù):69、66、64、63、70、68。平均為:66.67 cfu/皿。
[0063]E、將試管繼續(xù)在36°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6小時。
[0064]F、取出，按菌懸液制備計數(shù)中步驟D?K的方法進行計數(shù)。
[0065]G、稀釋度為10_6的計數(shù)結果:
試驗培養(yǎng)基:29、30、28、27、31、28。平均為:28.83。
[0066]對照培養(yǎng)基:16、18、17、16、15、18。平均為:16.67。
[0067](3)統(tǒng)計分析(根據衛(wèi)生統(tǒng)計學中兩個樣本均數(shù)比較的方差分析，從分析的結果可以看到總變異、組內變異、組間變異等三種變異，分析兩個樣本的差異。):
A、培養(yǎng)2小時結果分析。
[0068]表1:培養(yǎng)基菌落形成單位數(shù)
【權利要求】
1.一種幽門螺桿菌快速生長添加劑，其特征在于該快速生長添加劑以豬胃、牛肉為原材料，加純凈水煮沸，濾液中添加氯化鈉、不溶性淀粉和尿素制備得到，制備用各組份以質量份表示如下: 豬胃500份； 牛肉500份； 氯化鈉7份； 不溶性淀粉 I份； 尿素I份； 純凈水適量； 碳酸氫鈉適量，調節(jié)pH值7.4?7.6。
2.根據權利要求1 所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑，其特征在于:所述豬胃、牛肉采用新鮮所得或使用前貯存在4?8°C環(huán)境中< 8h。
3.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑，其特征在于:所述純凈水pH值5.0 ?7.0,電導率< 5.0 μ s/cm。
4.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑，其特征在于:所述不溶性淀粉為干燥玉米去皮，研磨成細顆粒，再用100目細篩過篩后所得。
5.根據權利要求1至4任意一項權利要求所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟: (1)、將作為原材料的豬胃和牛肉進行預處理，并切成小塊； (2)、將步驟(I)切成小塊的原材料與質量為原材料兩倍量的純凈水混合，加熱煮沸I?1.5h后過濾,收集濾液A ； (3)、將步驟(2)所得濾渣與質量為原材料一倍量的純凈水混合，加熱煮沸I?1.5h后過濾，收集濾液B ； (4)、將步驟(2)與步驟(3)所得的濾液A和濾液B混合，并置于4°C環(huán)境中過夜，然后刮掉油脂，過濾，得新的濾液C ； (5)、將步驟(4)所得的濾液C加熱煮沸，使其質量濃縮至原材料量； (6)、將步驟(5)經濃縮的濾液C冷卻至50-60°C，過濾，收集濾液D，并加純凈水補充至每毫升濾液中含有豬胃和牛肉各0.5克； (7)、加入氯化鈉、不溶性淀粉和尿素，攪拌溶解； (8)、用碳酸氫鈉調節(jié)pH值7.4?7.6 ; (9 )、滅菌處理，冷卻，得幽門螺桿菌快速生長添加劑。
6.根據權利要求5所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備方法，其特征在于:步驟(1)所述預處理包括依次對豬胃、牛肉原材料用自來水漂洗干凈、去筋、去膜、去油脂，再依次用自來水浸泡、漂洗干凈，然后濾掉水份，晾干。
7.根據權利要求5所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備方法，其特征在于:步驟(2)和步驟(3)采用紗布過濾；步驟(4)和步驟(6)采用棉花過濾。
8.根據權利要求5所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備方法，其特征在于:步驟(9)所述滅菌處理為將步驟(8)所得的液體分裝，然后置于壓力蒸汽滅菌器內，121°C條件下滅菌20min。
9.根據權利要求5所述的幽門螺桿菌快速生長添加劑的制備方法，其特征在于:所得幽門螺 桿菌快速生長添加劑置于O?4°C環(huán)境中貯存。
【文檔編號】C12N1/20GK103436468SQ201310346279
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月11日 優(yōu)先權日:2013年8月11日
【發(fā)明者】楊寧敏, 屠苗穎 申請人:杭州致遠醫(yī)學檢驗所有限公司