專(zhuān)利名稱(chēng)：幽門(mén)螺桿菌抗原群的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及幽門(mén)螺桿菌新型抗原，或其抗原性片段，這些抗原或其片段在檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌中的應(yīng)用及包含這些抗原或其片段的試劑盒，含有這些抗原或其片段的疫苗，以及分離這些抗原的方法。
腸道感染在哺乳動(dòng)物，尤其在人體內(nèi)，通過(guò)活化共同粘膜免疫系統(tǒng)，激發(fā)了粘膜分泌物(如唾液)中的免疫應(yīng)答。盡管該應(yīng)答通常以IgA抗體的出現(xiàn)為特征，但常常伴隨引起了血清中的抗體應(yīng)答。但分泌物(包括唾液)中的免疫應(yīng)答在抗原(如細(xì)菌或病毒)從體內(nèi)排除后迅速減弱。因此，粘膜分泌物中抗體的存在反映了當(dāng)前感染，即同期感染。例如，就微生物感染而言，粘膜分泌物中的抗體，即后文所指的分泌型抗體，反映了微生物的當(dāng)前定居狀態(tài)，如定居在腸道內(nèi)，因而可用于監(jiān)控同期感染。另一方面，當(dāng)微生物從體內(nèi)排除后，血清抗體還將持續(xù)一段時(shí)間。故血清抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性既反映抗原的過(guò)往存在又反映抗原的當(dāng)前存在，對(duì)臨床意義不大。而分泌型抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性則指示當(dāng)前或同期有微生物感染。
診斷幽門(mén)螺桿菌的感染可經(jīng)顯微鏡檢查，胃粘膜活檢標(biāo)本的微生物學(xué)培養(yǎng)或尿素酶檢測(cè)，尿素呼吸檢驗(yàn)(urea breath test)或用ELISA法檢測(cè)血清中特異性抗體的存在。預(yù)計(jì)幽門(mén)螺桿菌在胃粘膜部位的感染會(huì)刺激胃分泌物中的IgA抗體應(yīng)答。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)粘膜分泌物中的幽門(mén)螺桿菌特異性抗體是IgG類(lèi)而非預(yù)期的IgA類(lèi)。如果有的話(huà)，也只是檢測(cè)到極少量的IgA抗體。因而AU-A-9067676涉及粘膜分泌液中特異于幽門(mén)螺桿菌抗原的IgG的檢測(cè)，并提供了監(jiān)控哺乳動(dòng)物體內(nèi)由該微生物所致的當(dāng)前(即同期)感染的方法。相關(guān)學(xué)術(shù)出版物為Witt等，粘膜免疫學(xué)前沿，卷1，693-696頁(yè)(1991)。
在美國(guó)胃腸道學(xué)協(xié)會(huì)年會(huì)的會(huì)議錄中，幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性病人唾液中IgG抗體的存在已引起了一些注意。Czinn等在1989年的會(huì)議錄中公布了這種抗體的存在，此后，Larsen等人于1991年五月的會(huì)議錄中總結(jié)道唾液中的IgG水平是抗生素治療過(guò)程中評(píng)估治療反應(yīng)的一種實(shí)用性的非侵入性標(biāo)志。在1992年4月的會(huì)議錄中，Landes等證實(shí)了前人的觀察結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)，對(duì)于幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性病人、尤其是其它檢驗(yàn)方法不太實(shí)用的大范圍群體或幼兒群體來(lái)說(shuō)，測(cè)量針對(duì)幽門(mén)螺桿菌的唾液IgG是一種簡(jiǎn)單的非侵入性檢驗(yàn)。
WO-A-9322682公開(kāi)了一種方便可信的體外幽門(mén)螺桿菌檢驗(yàn)法。該檢驗(yàn)利用了抗原制劑與受檢哺乳動(dòng)物粘膜分泌液中的IgG抗體進(jìn)行反應(yīng)。
WO-A-9625430揭示了幽門(mén)螺桿菌的一種新型抗原，可用于診斷性檢驗(yàn)以鑒定幽門(mén)螺桿菌的感染。
對(duì)于鑒定、分離并因此提供能用于診斷性檢驗(yàn)的幽門(mén)螺桿菌新型抗原的需求從未間斷。這些抗原應(yīng)該是特異性的，確信可純化的，并以在這種檢驗(yàn)中的良好專(zhuān)一性和無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果為其特征。此外，它們也許能作為可有效用于治療或預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染之疫苗的基礎(chǔ)。
故，第一方面，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，它是幽門(mén)螺桿菌抗原，在變性和還原條件下測(cè)得其分子量在約43kDa至約53kDa之間。
在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原性蛋白質(zhì)的分子量為約43kDa，并在其氨基末端有以下氨基酸序列M D L ？ V L G I N T AMet-Asp-Leu- ？-Val-Leu-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala.
在第二個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原性蛋白質(zhì)的分子量約為43kDa，并在其氨基末端有以下氨基酸序列M R V P K(S) K G F A I L S K在本發(fā)明此方面的第三個(gè)較優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗原性蛋白質(zhì)的分子量約為53kDa，并在其氨基末端有以下氨基酸序列？ ？ G K A P D F K P A？- ？-Gly-Lys-Ala-Pro-Asp-Phe-Lys-Pro-Ala本發(fā)明的第二方面提供一種蛋白質(zhì)，它是幽門(mén)螺桿菌的抗原，并具有以下特征i)在變性及還原條件下測(cè)得的分子量約為54kDa，并有以下N-末端氨基酸序列M L K (V) I (E) K (V或S) L E (S) I；ii)在天然(非變性)條件下測(cè)得的分子量約為370kDa，并有以下N-末端氨基酸序列M (K) L T I - L E V (E)；iii)在天然(非變性)條件下測(cè)得的分子量約為140kDa，并有以下N-末端氨基酸序列M Y I P Y V I E；iv)在天然(非變性)條件下測(cè)得的分子量約為90kDa，并有以下N-末端氨基酸序列M N L D C (S) L Q V；v)在變性及還原條件下測(cè)得的分子量約為15.9-16.9kDa，并有以下N-末端氨基酸序列G K I G I F F G T D S G N A E A I A E K；vi)在天然(非變性)條件下測(cè)得的分子量約為344kDa，并有以下N-末端氨基酸序列M L V T K L A P D F L A P ？V；或vii)有以下N-末端氨基酸序列的一種超氧化物歧化酶M F T L R E L P F A K D S N G D F L S P上述序列中，括號(hào)內(nèi)的氨基酸可替代括號(hào)前氨基酸。
本文所述的所有蛋白質(zhì)中任一種的部分或片段本身也可能有抗原性，因此，第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明中蛋白質(zhì)的抗原性片段。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了有以下序列的抗原性片段M D L ？ V L G I N T AMet-Asp-Leu- ？-Val-Leu-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala；？ ？ G K A P D F K P A？- ？-Gly-Lys-Ala-Pro-Asp-Phe-Lys-Pro-Ala.
M L K(V) I(E) K(V或S) L E(S) I；M R V P K(S) K G F A I L S K；M(K) L T I - L E V(E)；M Y I P Y V I E；M N L D C(S) L Q V；G K I G I F F G T D S G N A E A I A E K；M L V T K L A P D F L A P ？V；或M F T L R E L P F A K D S N G D F L S P其中，上述序列中，括號(hào)內(nèi)的字母表示可替代括號(hào)前氨基酸的一些氨基酸。
由于分子量測(cè)定操作的局限性，本文所述抗原的分子量必需表示為近似數(shù)。分子量專(zhuān)指在天然(非變性)條件或變性條件下所測(cè)得的值。本領(lǐng)域的技術(shù)人員均知不同的人或甚至同一人在不同情況下操作所得結(jié)果可能會(huì)有輕微差異，故本說(shuō)明書(shū)所引用的近似分子量數(shù)值在讀取時(shí)應(yīng)考慮有±5％、甚至±10％的波動(dòng)。
技術(shù)人員應(yīng)能理解片段的序列可能會(huì)有一些變動(dòng)，但仍保持抗原性不變?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一些方法檢驗(yàn)諸片段和/或其變體的抗原性。這些變體亦構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)或其片段可以純化的或分離的制劑形式單獨(dú)提供，或作為與其它幽門(mén)螺桿菌抗原性蛋白質(zhì)的混合物的參與部分來(lái)提供。
故第四方面，本發(fā)明提供一種抗原組合物，內(nèi)含一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或一種或多種其抗原性片段。這樣的組合物可用于檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物含有一種或多種其他幽門(mén)螺桿菌抗原或其片段。
第五方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌的方法，包括(a)使待檢樣品與本發(fā)明的一種抗原性蛋白質(zhì)、或其抗原性片段或一種抗原組合物接觸；并(b)檢測(cè)有無(wú)幽門(mén)螺桿菌抗體。
具體地說(shuō)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物可用于檢測(cè)IgG抗體。較適宜地，待檢樣品可以是生物學(xué)樣品，如血樣或唾液標(biāo)本。在WO-A-9322682中描述了用粘膜分泌物樣品檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌的一種合適方法的一個(gè)例子。
本發(fā)明的第六方面提供了本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物在檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌中的用途。較優(yōu)選地，該檢測(cè)和/或診斷于體外進(jìn)行。
本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物可作為用于體外檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌的試劑盒中一部分。因此，第七方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌的一種試劑盒，該試劑盒內(nèi)含有本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物。
此外，本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段可用于誘導(dǎo)針對(duì)幽門(mén)螺桿菌的免疫應(yīng)答。故第八方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原、其片段或本發(fā)明的抗原組合物用于醫(yī)藥中的用途。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了可刺激受試者免疫應(yīng)答的一種組合物，內(nèi)含本發(fā)明的一種或多種蛋白質(zhì)和/或其一種或多種抗原性片段。較適宜地，該組合物可以是一種疫苗組合物，其中任選地含有一種或其他適當(dāng)?shù)淖魟?。這種疫苗組合物可以是預(yù)防性疫苗組合物或治療性疫苗組合物。
本發(fā)明的疫苗組合物可包括一種或多種佐劑。本領(lǐng)域熟知的佐劑實(shí)例包括無(wú)機(jī)凝膠(如氫氧化鋁)或油包水乳劑(如不完全福氏佐劑)。其他有用佐劑為技術(shù)人員所熟知。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了(a)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或一種或多種其抗原性片段在制備免疫原性組合物、較優(yōu)選是疫苗中的用途；(b)這種免疫原性組合物在誘導(dǎo)受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答中的用途；以及(c)在受試者體內(nèi)治療或預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì)、至少一種其抗原性片段，或抗原組合物，較優(yōu)選作為疫苗施用。
本發(fā)明各方面的較優(yōu)選特點(diǎn)是各方面已在細(xì)節(jié)上作了必要修正時(shí)的情形。
本發(fā)明按照以下實(shí)施例進(jìn)行描述，但無(wú)論如何不能將這些實(shí)施例理解成限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例涉及一些附圖，其中

圖1顯示無(wú)細(xì)胞超聲處理物在mono Q HR5/5陰離子交換柱中的洗脫曲線(xiàn)。含有尿素酶的級(jí)分以陰影區(qū)表示。圖中還指明了0至1.0M的NaCl梯度；圖2顯示Superose 6洗脫曲線(xiàn)，表明了幽門(mén)螺桿菌的陽(yáng)性病人和未感染的受試者在ELISA中的血清反應(yīng)性；圖3顯示所研究的2株幽門(mén)螺桿菌的Superose 6反應(yīng)活性級(jí)分經(jīng)8-25％梯度膠的非變性PAGE電泳結(jié)果；圖4顯示Superose 6反應(yīng)活性級(jí)分經(jīng)8-25％梯度膠的非變性PAGE電泳后的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖5顯示Superose 6反應(yīng)活性級(jí)分的(a)8-25％梯度膠SDS-PAGE電泳結(jié)果和(b)(a)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果；圖6顯示有幽門(mén)螺桿菌感染的病人在不同ELISA反應(yīng)性的發(fā)生率。
實(shí)施例I(i)細(xì)菌的培養(yǎng)所用兩株幽門(mén)螺桿菌，一為NCTC 11637，一為1989年分離自一位胃潰瘍病人的名為“traub”的野生型菌株(澳大利亞粘膜免疫學(xué)研究所)。
從兩支菌株中均分離出同樣的蛋白質(zhì)。對(duì)每支菌株進(jìn)行培養(yǎng)，再用相同的方法提取蛋白質(zhì)。
在37℃水浴箱，由10％CO2、6％O2、84％N2組成的微嗜氣性環(huán)境中，于巧克力瓊脂(Oxiod公司No.2Block Agar Base含5％去纖維的馬血液的CM271)上培養(yǎng)細(xì)菌。
細(xì)菌培養(yǎng)96小時(shí)后，從培養(yǎng)平板上刮下菌落，收集在含PBS的試管(Trace MulticelTM編號(hào)50-201-PA)中。離心(10,000g，5分鐘，RT)洗滌細(xì)胞，再重新懸浮于新鮮緩沖液中。重復(fù)洗滌一次，最終將細(xì)胞重新懸浮于0.1M Tris-HCl pH8.2中，再經(jīng)超聲處理破碎細(xì)胞。在置于冰浴內(nèi)的冷卻超聲處理管內(nèi)，利用9.5mm的探頭，在6μ(MSESoniprep 150 Ultrasonic Disintegrator)處進(jìn)行超聲處理。每1ml樣品超聲處理5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為超聲處理處理30秒再靜置60秒，故總的超聲處理時(shí)間為7.5分鐘。超聲處理后，細(xì)胞碎片經(jīng)離心(12,000g，10分鐘，RT)除去，將上清液先通過(guò)0.45μm的濾膜過(guò)濾，再通過(guò)0.2μm的濾膜過(guò)濾，從而得到不合細(xì)胞的蛋白質(zhì)懸液。
(iii)蛋白質(zhì)測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度用BioRad公司的考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒來(lái)測(cè)定。
(iv)層析(a)離子交換層析通過(guò)將于500μl Tris-HCl緩沖液中的10-15mg蛋白質(zhì)樣品上樣于聯(lián)有FPLC系統(tǒng)的Mono Q柱(Pharmacia Biotech公司，HR5/5)內(nèi)，對(duì)該無(wú)細(xì)胞懸浮進(jìn)行分級(jí)分離。用0.1M Tris-HCl緩沖液中所含的0-1M NaCl梯度進(jìn)行洗脫。
于280nm波長(zhǎng)下監(jiān)控蛋白質(zhì)的洗脫過(guò)程，所有洗脫下來(lái)的物質(zhì)收集至0.5ml級(jí)分中。于洗脫的全過(guò)程中監(jiān)測(cè)緩沖液的導(dǎo)電率，以確保梯度的準(zhǔn)確性。
檢驗(yàn)每個(gè)級(jí)分的尿素酶活性，方法是測(cè)量它們利用尿素作底物的能力。簡(jiǎn)而言之，用一塊微滴板，各排孔中分別加入兩種不同溶液，90μl/孔，一種是由3mM磷酸氫二鈉加1.5％(w/v)尿素及4μg/100ml酚紅組成的溶液(底物溶液)，一種為不含尿素的類(lèi)似溶液(空白緩沖液)。然后將每級(jí)分的10μl樣品成對(duì)加到孔中，一份樣品加入底物溶液中，一份樣品加入空白緩沖液中，迅速密封微滴定板。2.5分鐘后，于540nm測(cè)量每孔的光吸收值。對(duì)于每對(duì)孔，均從檢驗(yàn)值(底物溶液)中減去對(duì)照值(空白緩沖液)，將所得值對(duì)收集管序號(hào)作圖。
(b)凝膠過(guò)濾層析將那些顯示有尿素酶活性的Mono Q級(jí)分匯集成三大份樣品。檢驗(yàn)每份匯集物的抗原活性。第一份匯集物顯示含有抗原，對(duì)其進(jìn)行濃縮，得到總蛋白質(zhì)含量約為30-50mg/ml。將1號(hào)匯集物的等份樣品(200μl)上樣于Superose 6柱(Pharmacia)進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。以Tris-HCl，0.1M，pH7.2溶液作為洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。收集各級(jí)分(0.5ml)。洗脫過(guò)程中，于280nm測(cè)定洗脫液的光密度，隨后測(cè)定尿素酶活性和蛋白質(zhì)含量，從而監(jiān)控洗脫。
(c)選擇有反應(yīng)活性的級(jí)分通過(guò)用含有1M NaCl的Tris緩沖鹽溶液按1∶10稀釋樣品，并用稀釋后的樣品包被ELISA微滴定板各孔(Nunc Maxisorb)，每孔100μl，從而檢測(cè)各級(jí)分中的抗原。使各孔靜置3小時(shí)，再用含0.15M NaCl的100mM磷酸鹽緩沖液洗滌。然后，用來(lái)自確認(rèn)有幽門(mén)螺桿菌感染的病人的一組血清樣品對(duì)包被好的板進(jìn)行篩選。將血清樣品用磷酸緩沖鹽溶液作1∶200稀釋后，加入已包被好的孔內(nèi)溫育1小時(shí)，然后洗滌各孔并吸干。利用山羊抗人IgG過(guò)氧化物酶，溫育30分鐘，然后洗板，再加強(qiáng)化TMB底物(Cambridge Life Sciences)，從而檢測(cè)特異性抗體的結(jié)合。15分鐘后，用1M H2SO4終止反應(yīng)，并于450nm測(cè)量光吸收值。
對(duì)所有級(jí)分均進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot)，以證實(shí)它們?cè)诘鞍踪|(zhì)組成方面的差別。
(v)PAGE利用Pharmacia Multiphor II system進(jìn)行非變性凝膠電泳。為此，特制備濃度為5％的凝膠。向50μl樣品中加入0.25％溴酚蘭10μl，混勻后取20μl加入到凝膠中進(jìn)行電泳(600w電泳30分鐘)。
制備在SDS樣品緩沖液(0.5M HCl，pH6.8[1.0ml]；甘油
；10％(w/v)SDS[1.6ml]；0.8M DTT
；1％溴酚蘭
；水
)中的1mg/ml各級(jí)分等分樣品40μl。在預(yù)先制好的10％凝膠(BioRad)中，用BioRad Mini Protean II system對(duì)樣品進(jìn)行電泳。電泳緩沖液為含SDS的tris-甘氨酸pH8.3(15g Tris，72g甘氨酸，5g SDS，溶于5L蒸餾水中)。電泳完畢后，凝膠用考馬斯亮蘭R-250(0.1％)的甲醇/醋酸/水(40/10/50％)溶液染色，再用甲醇/醋酸/水(40/10/50％)脫色。所用的分子量標(biāo)志為BioRad公司的大范圍SDS預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品，包括肌球蛋白211,000；β-半乳糖苷酶117,000；牛血清白蛋白81,000；卵白蛋白49,100；碳酸酐酶31,400；大豆胰酶抑制物26,100；溶菌酶18,900。
(vi)蛋白質(zhì)印跡利用蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)測(cè)定哪些肽只與幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性病人的血清反應(yīng)。對(duì)每份血清樣品分開(kāi)進(jìn)行凝膠電泳和印跡。SDS-PAGE凝膠電泳如上述進(jìn)行，利用Mini Proean II Trans Blot cell(BioRad)，遵照生產(chǎn)商的指示，采用不含SDS的Towbin緩沖液，將電泳分離物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。對(duì)于非變性凝膠，用Pharmarcia Multiphor II的半干印跡程序(REF)在不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移后，硝酸纖維素膜用20mM Tris-HCl加500mM NaCl，pH7.5(TBS)洗10分鐘，再用含1％BSA(牛血清白蛋白)的TBS封閉1小時(shí)。然后，用含0.05％吐溫20的TBS(TTBS)洗膜，并用按1∶60稀釋于含1％BSA的TTBS中的血清樣品探查諸膜。室溫溫育過(guò)夜。然后用TTBS洗硝酸纖維素膜，再加抗人IgG過(guò)氧化物酶。溫育3小時(shí)后，用TBS洗，再加入底物溶液(4-氯萘酚)。底物應(yīng)于用前新鮮配制將溶于20ml甲醇中的60mg 4-氯萘酚與在混合前剛剛加入60μl冰冷30％H2O2的100ml TBS混合。使溫育過(guò)程一直持續(xù)到當(dāng)用新鮮底物溶液取代原底物溶液時(shí)，原底物溶液顏色加深為止。所用的最長(zhǎng)溫育時(shí)間為30分鐘。將膜轉(zhuǎn)至蒸餾水中以終止反應(yīng)，并經(jīng)多次更換蒸餾水進(jìn)行洗滌。
試驗(yàn)中所用的血清樣品已經(jīng)知道是尿呼吸檢驗(yàn)(UBT)陽(yáng)性或陰性，血清狀態(tài)由ELISA證實(shí)。
(vii)氨基酸測(cè)序用固相分析法測(cè)定了感興趣的5條獨(dú)特蛋白質(zhì)條帶的N-末端區(qū)域14個(gè)氨基酸。按照如上就Western分析述及的方法進(jìn)行SDS-PAGE和印跡，不同之處在于此處蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)移至PDVF膜上而非硝酸纖維素膜上。對(duì)轉(zhuǎn)移PDVF膜不染色。然后用相測(cè)序儀(Applied Biosystems)從固相上進(jìn)行分析。
(viii)檢驗(yàn)病人血清樣品和唾液樣品從胃腸學(xué)診所收集了22例檢查胃不適癥狀的病人(平均年齡58.9歲，12例男性，10例女性)。組織學(xué)檢查顯示11例為幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性。對(duì)檢查時(shí)收集到的22份血清和13份唾液通過(guò)ELISA進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)所有22例病人的唾液均進(jìn)行斑點(diǎn)印跡分析。
(ix)ELISA檢驗(yàn)(a)用純化抗原包被ELISA微滴定板將來(lái)自Superose 6柱的各選定的、含抗原的純化級(jí)分匯集在一起，用18.5mM Tris-HCl加1M NaCl的溶液將提取物稀釋至1-2μg蛋白質(zhì)/ml。用后者的等分樣品(100μl)包被(室溫下溫育16小時(shí))ELISA微滴定板(Nunc Maxisorb)各孔。包被后，用含0.15M NaCl和0.01％(w/v)硫柳汞(thiomersal)的5mM磷酸鹽緩沖液pH7.2，以每孔350μl重復(fù)洗孔3次，然后用1％(w/v)的Byco A蒸餾水溶液封閉(室溫下，蒸餾水中90分鐘)各孔(350μl/孔)。連續(xù)洗滌兩次(洗滌液同前)后，這些板既可立即投入使用，亦可干燥(37℃ 16小時(shí))后封存。
(b)檢驗(yàn)血清樣品將待檢血清用含有0.07％(u/v)吐溫80，0.16％(w/v)溴酚蘭，0.25％(w/v)明膠，0.14M NaCl，0.01％(w/v)N-methylisothiazolon/HCl及0.1％(w/v)Oxyprion的50mM磷酸鹽緩沖液pH7.2按1∶200稀釋。將等分樣品100μl加入至經(jīng)抗原包被過(guò)的微滴定板的適當(dāng)孔中(見(jiàn)上述(a))，室溫溫育45分鐘，然后用含0.15M NaCl，0.05％(u/v)吐溫80，0.001％(w/v)N-methylisothiazolon/HCl和0.01％(w/v)Oxyprion的10mM Tris-HCl pH7.8洗孔5次(350μl/孔)。用適當(dāng)稀釋(稀釋液為20mM磷酸鹽，150mM NaCl，0.01％(w/v)硫柳汞，0.1％(w/v)BSA組分V及0.05％(w/v)8-苯胺基-1-萘磺酸，pH7.2)的兔抗人IgG過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(100μl/孔)室溫溫育15分鐘，對(duì)特異性抗體的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。洗板5次(方法同前)后，用TMB底物(100μl/孔)室溫顯色15分鐘，再每孔中加入25％(u/v)磷酸50μl終止反應(yīng)，于450nm記錄每一試驗(yàn)孔的光吸收值。
(c)檢驗(yàn)唾液樣品待檢唾液用1份Omnisal YG緩沖液(pH7.2，基于磷酸的緩沖液)稀釋?zhuān)瑢⒌确謽悠?100μl)加入經(jīng)抗原包被過(guò)的微滴定板(見(jiàn)上文(a))的適當(dāng)孔中。室溫溫育30分鐘后，各孔洗滌5次(用與血清樣品檢驗(yàn)時(shí)所用的相同緩沖液)，再用生物素-抗生物素蛋白偶聯(lián)試驗(yàn)在室溫檢測(cè)特異性抗體的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，向每孔中加入兔抗人IgG生物素(適當(dāng)稀釋于5mM磷酸，0.15M NaCl，0.05％(u/v)吐溫80，2.5％(w/v)Anoronthy，1％(u/v)熱滅活的正常兔血清，0.01％(w/v)硫柳汞及2.5％(w/v)明膠，pH7.5)100μl，溫育30分鐘。連續(xù)洗滌5次(同前)后，按100μl/孔向適當(dāng)孔中加入抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(適當(dāng)稀釋于5mM磷酸，0.15N NaCl，2％(u/v)熱滅活的正常兔血清，0.01％(w/v)硫柳汞和0.05％(w/v)8-氨基-萘-1-磺酸，pH7.2)，溫育15分鐘，再如前所述洗滌各孔5次。用TMB底物(100μl/孔)顯色15分鐘后，每孔加入25％(u/v)磷酸50μl終止反應(yīng)，并在450nm記錄每一檢測(cè)的光吸收值。
(x)斑點(diǎn)印跡檢驗(yàn)為檢驗(yàn)各級(jí)分和匯集級(jí)分對(duì)單一血清樣本的反應(yīng)性，將待檢材料點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜片上，再按上述蛋白質(zhì)印跡程序進(jìn)行分析。將各級(jí)分或級(jí)分匯集物制成1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。用鉛筆和尺子將一張硝酸纖維素膜(BioRad 8.4×7cm目錄號(hào)162-0145)標(biāo)記成24個(gè)小方格，小心不要使硝酸纖維素膜沾上任何蛋白質(zhì)。
將每一級(jí)分或匯集物含2μg蛋白質(zhì)的等分樣品(2μl)小心地點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上的每個(gè)標(biāo)記方格內(nèi)(每份樣品重復(fù)點(diǎn)3次)。各樣品點(diǎn)室溫風(fēng)干后，將每張膜浸于封閉液(含1％w/v BSA的20mM Tris-HCl，500mM NaCl pH7.5)中室溫置1小時(shí)。傾去封閉液，在吐溫-Tris緩沖鹽溶液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，0.05％v/v吐溫20，pH7.5)中洗膜三次，再將膜與三種人血清型中的一種(用含1％BSA的吐溫-Tris緩沖鹽溶液作1∶60v/v稀釋)于室溫共同溫育過(guò)夜，所述三種人血清型已經(jīng)過(guò)HELISAL ELISA(Cortecs)鑒定，并經(jīng)臨床檢測(cè)確認(rèn)為幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性、臨界型或陰性。溫育過(guò)夜后，用吐溫-Tris緩沖鹽溶液洗膜2次，再將膜浸入偶聯(lián)溶液(兔抗人IgG-辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)物(Dako目錄號(hào)P-406)用含1％BSA的吐溫-Tris緩沖鹽溶液稀釋的1∶500v/v稀釋液)中室溫溫育3小時(shí)。然后在吐溫-Tris緩沖鹽溶液中洗膜2次，在Tris緩沖鹽溶液(20mM Tris，500mMNaCl，pH7.5)中洗膜1次，再在4-氯-1-萘酚溶液(60mg溶于20ml甲醇，100ml Tris緩沖鹽溶液及60μl 30％H2O2中)中顯色2至30分鐘。用水洗滌而終止顯色。
在另一項(xiàng)研究中，將經(jīng)組織病理學(xué)測(cè)定有幽門(mén)螺桿菌感染的病人的發(fā)生率對(duì)ELISA反應(yīng)性作圖，確定ELISA臨界值。
結(jié)果無(wú)細(xì)胞超聲處理樣品在Mono Q HR 5/5柱中的洗脫曲線(xiàn)示于圖1。含有尿素酶活性的級(jí)分位于12ml至18ml的洗脫體積之間。
Mono Q HR 5/5柱匯集物在Superose 6柱中的洗脫曲線(xiàn)顯示含尿素酶的級(jí)分位于10至19ml的洗脫體積之間。
由Superose 6洗脫物的ELISAgram和Western印跡分析確定抗原反應(yīng)性級(jí)分。已知有幽門(mén)螺桿菌感染的病人血清表現(xiàn)出不同于未感染受試者的ELISAgram圖。Superose 6洗脫物的ELISA反應(yīng)性的典型曲線(xiàn)示于圖2。選擇出一種在感染和未感染受試者之間產(chǎn)生最大差異的抗原制劑用于后續(xù)的診斷試驗(yàn)開(kāi)發(fā)中。該抗原級(jí)分是在尿素酶主峰右側(cè)選擇的，盡管此處還可測(cè)出一些尿素酶活性的存在。
對(duì)反應(yīng)性級(jí)分進(jìn)行的非變性PAGE電泳證實(shí)以所研究的兩株菌中分離出了16條可檢測(cè)的蛋白質(zhì)帶，分子量范圍在700-40kDa之間(表1，圖3)。
表1Superose 6柱層析收集到的反應(yīng)性級(jí)分的非變性PAGE電泳。測(cè)得各蛋白質(zhì)條帶的分子量。<
>1發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)帶的電泳膠序號(hào)(共10塊膠)數(shù)值均表示為平均值±SEM免疫印跡分析證實(shí)這些蛋白質(zhì)帶中9個(gè)條帶有免疫反應(yīng)性(表2，圖4)。
表2由Superose 6柱得到的反應(yīng)性級(jí)分經(jīng)非變性PAGE電泳后，由蛋白印跡分析所檢測(cè)到的蛋白質(zhì)條帶的分子量
1發(fā)現(xiàn)有該條帶的印跡分析膜序號(hào)(共26張膜)2該條帶證實(shí)有尿素酶活性3該濃染區(qū)常以單一的難區(qū)分區(qū)(分子量范圍240-330千道爾頓)出現(xiàn)數(shù)值均表示為平均值±SEM用SDS-PAGE分析非變性PAGE電泳中所見(jiàn)的5個(gè)主要區(qū)帶，結(jié)果測(cè)得每個(gè)區(qū)帶有7至9個(gè)亞成分(表3)。
表3非變性PAGE中所發(fā)現(xiàn)的5個(gè)主區(qū)帶的亞單位分析
1發(fā)現(xiàn)有條帶的電泳膠序號(hào)*尿素酶陽(yáng)性++強(qiáng)印跡數(shù)值均表示為平均數(shù)±SEM反應(yīng)性級(jí)分的SDS-PAGE分析證實(shí)有32種可檢測(cè)到的亞單位組分，其中18種與陽(yáng)性血清有免疫反應(yīng)性(表4，圖5)
表4由Superose 6柱層析所得的反應(yīng)性級(jí)分經(jīng)SDS-PAGE，再經(jīng)蛋白印跡測(cè)得的各亞單位組分的分子量。
數(shù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差n1指29張免疫印跡膜上可測(cè)出該條帶的膜序號(hào)仔細(xì)檢查凝膠分析的結(jié)果，鑒定出10個(gè)特有的亞單位組分。其中6個(gè)為主區(qū)帶(表5)。對(duì)其中5種蛋白質(zhì)進(jìn)行N末端氨基酸測(cè)序顯示，其中一種蛋白質(zhì)相當(dāng)于WO-A-9625430所公開(kāi)的抗原，另2種為新蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)有相應(yīng)序列的描述)。剩下2種顯示與已知N末端序列完全一致(表6)。
表5反應(yīng)性級(jí)分經(jīng)凝膠分析鑒別出的特有亞單位組分
表6反應(yīng)性抗原級(jí)分中鑒別出的5種蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列
<p>對(duì)包含新型抗原的反應(yīng)性級(jí)分在診斷性ELISA中的應(yīng)用進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)得唾液樣品的臨界值為0.7個(gè)ELISA單位，血清樣品的臨界值為2.5個(gè)ELISA單位(圖6)。
表7顯示血清和唾液ELISA及斑點(diǎn)印跡分析與經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌感染相比的性能。結(jié)果顯示血清和唾液均高度靈敏，并有很好的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)價(jià)值。唾液斑點(diǎn)印跡分析效果盡管不如唾液或血清的ELISA效果好，但也可接受。
表7經(jīng)ELISA或斑點(diǎn)印跡所測(cè)得的唾液和血清抗體與經(jīng)組織學(xué)(竇活檢標(biāo)本)測(cè)得的結(jié)果比較
實(shí)施例2(a)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌，將細(xì)胞收獲于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。然后多次離心以去除細(xì)胞碎片及瓊脂等其他雜質(zhì)，加3次新鮮PBS，得到洗好的細(xì)胞沉淀；(b)將洗凈的細(xì)胞重新懸浮于0.1M Tris-HCl緩沖液pH7.2中，準(zhǔn)備用于離子交換層析。然后對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行足夠強(qiáng)度和足夠時(shí)間的超聲處理(對(duì)于含有來(lái)自100塊瓊脂平板的細(xì)胞的10ml樣品，6μ處理30秒，休息60秒，重復(fù)25次)以確保細(xì)胞完全破碎；(c)再離心懸浮液以去除細(xì)胞碎片，獲得含可溶性細(xì)胞蛋白質(zhì)的上清；(d)再通過(guò)離子交換層析對(duì)(c)步驟所得溶液進(jìn)行分級(jí)分離，其中使用強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂，如Mono Q或Q-Sepharose(Pharmacia)，并采用洗脫緩沖液中NaCl濃度以預(yù)定方式由0升至1.0M的梯度進(jìn)行洗脫。再檢測(cè)各級(jí)分中有無(wú)尿素酶的存在。
(e)然后匯集含有尿素酶的級(jí)分并進(jìn)行凝膠滲透層析，所使用樹(shù)脂對(duì)于球狀蛋白質(zhì)的截留范圍為5×103-5×106Da；(f)選擇相應(yīng)峰的方法是(i)對(duì)所有級(jí)分進(jìn)行尿素酶試驗(yàn)，鑒別出有尿素酶活性的蛋白質(zhì)峰；(ii)分析所有顯示尿素酶陽(yáng)性的級(jí)分及緊鄰尿素酶峰但分子量(明顯)較小的其它蛋白質(zhì)峰，方法是用匯集幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性個(gè)體的人血清制成的IgG，對(duì)天然蛋白質(zhì)及經(jīng)變性(SDS)處理產(chǎn)生的其蛋白質(zhì)片段進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析；和(iii)選擇出經(jīng)上述方法電泳分離后顯示能與陽(yáng)性血清匯集物的人IgG反應(yīng)但不與由幽門(mén)螺桿菌陰性血清制得的類(lèi)似血清匯集物反應(yīng)的那些蛋白質(zhì)條帶。
對(duì)所鑒別出的每條帶進(jìn)行N末端氨基酸分析，將序列與可從計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的已知蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，它是幽門(mén)螺桿菌抗原，在變性及還原條件下測(cè)得其分子量在約43kDa至約53kDa之間。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其分子量約為43kDa，并在其氨基末端有以下氨基酸序列M D L ？V L G I N T A
3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其分子量約為43kDa，并在其氨基末端有以下氨基酸序列M R V P K (S) K G F A I L S K
4.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其分子量約為53kDa，并在其氨基末端有以下氨基酸序列？？G K A P D F K P A
5.一種蛋白質(zhì)，它是幽門(mén)螺桿菌抗原，并具有以下特征(i)在變性及還原條件下測(cè)得其分子量約為54kDa，并有以下N末端氨基酸序列M L K(V) I(E) K(V or S) L E(S) I；(ii)在天然(非變性)條件下測(cè)得其分子量約為370kDa，并有以下N-末端氨基酸序列M(K) L T I - L E V(E)；(iii)在天然(非變性)條件下測(cè)得其分子量約為140kDa，并有以下N末端氨基酸序列M Y I P Y V I E；(iv)在天然(非變性)條件下測(cè)得其分子量約為90kDa，并有以下N末端氨基酸序列M N L D C(S) L Q V(v)在變性和還原條件下測(cè)得其分子量約為15.9-16.9kDa，并有以下N末端氨基酸序列G K I G I F F G T D S G N A E A I A E K；(vi)在天然(非變性)條件下測(cè)得其分子量約為344kDa，并有以下N末端氨基酸序列M L V T K L A P D F L A P ？V；或(vii)具有以下N末端氨基酸序列的一種超氧化物歧化酶M F T L R E L P F A K D S N G D F L S P其中上述序列中括號(hào)內(nèi)字母表示括號(hào)前氨基酸的可替代氨基酸。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)的抗原性片段。
7.權(quán)利要求6的抗原性片段，其具有以下序列M D L ？V L G I N T A；？？G K A P D F K P A；M L K(V) I(E) K(V或S) L E(S) I；M R V P K(S) K G F A I L S K；M(K) L T I - L E V(E)；M Y I P Y V I E；M N L D C(S) L Q V；或G K I G I F F G T D S G N A E A I A E K；M L V T K L A P D F L A P ？V；或M F T L R E L P F A K D S N G D F L S P
8.含有至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或至少一種如權(quán)利要求6或7的抗原性片段的抗原組合物。
9.權(quán)利要求8的抗原組合物，其中進(jìn)一步含有一種或多種其他幽門(mén)螺桿菌抗原和/或它們的片段。
10.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求6或7所限定的抗原性片段或者權(quán)利要求8或9所限定的抗原組合物，其特征在于可用于檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌。
11.檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌的一種方法，包括(a)使待檢樣品與至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的抗原性蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求6或7所限定的抗原性片段或者權(quán)利要求8或9所限定的一種抗原組合物接觸；及(b)檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌抗體的存在情況。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述樣品為唾液樣品。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述樣品為血液樣品。
14.至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求6或7所限定的抗原性片段或者權(quán)利要求8或9所限定的抗原組合物在檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌中的用途。
15.權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法或權(quán)利要求14的用途，其中檢測(cè)和/或診斷是在體外進(jìn)行的。
16.用于檢測(cè)和/或診斷幽門(mén)螺桿菌的試劑盒，其中含至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)，至少一種如權(quán)利要求6或7所限定的抗原性片段或者權(quán)利要求8或9所限定的抗原組合物。
17.能在受試者體內(nèi)刺激免疫應(yīng)答的組合物，內(nèi)含至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)，至少一種如權(quán)利要求6或7所限定的抗原性片段或者權(quán)利要求8或9所限定的抗原組合物。
18.權(quán)利要求17的組合物，它是疫苗組合物，其中還可任意含有一種或多種佐劑。
19.至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求6或7所限定的抗原性片段或者權(quán)利要求8或9的抗原組合物在制備免疫原性組合物、優(yōu)選疫苗中的用途。
20.權(quán)利要求17或18所限定的免疫原性組合物在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的用途。
21.治療或預(yù)防受試者感染幽門(mén)螺桿菌的一種方法，包括對(duì)受試者施用有效量的至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求6或7所限定的抗原性片段或者權(quán)利要求8或9所限定的抗原組合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述至少一種蛋白質(zhì)、至少一種抗原性片段或抗原組合物是以疫苗的形式施用的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組幽門(mén)螺桿菌新型抗原,并公開(kāi)了這些抗原在診斷幽門(mén)螺桿菌感染中的用途,包括上述診斷的具體方法及可用于這種方法中的試劑盒。此外,還提供了這些抗原的新型抗原性片段,以及含有至少一種抗原或者含一種或多種抗原性片段的疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1244871SQ98802028
公開(kāi)日2000年2月16日 申請(qǐng)日期1998年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月24日
發(fā)明者A·W·克里普斯, R·L·克蘭西, L·麥克沙尼, C·J·史密斯, D·R·泰里曼, B·霍 申請(qǐng)人:科特克斯(英國(guó))有限公司