例的試劑盒中的試劑分別與DNA模板(樣本DNA、陽性對照液或陰性對照液） 配制PCR反應體系，具體組分如表2所示。
[0037] 表2 PCR反應體系組分表 然后在PCR儀(ABI Veriti 96 well)上進行PCR反應程序，最優(yōu)反應程序如表3所示。
[0038] 表3 PCR反應程序表 3、毛細管電泳片段分析。
[0039] 在96孔樣品板的每個孔中加入38.5yL的甲酰胺（Sample Loading Solution，AB sciex公司，貨號：608082)和0.5yL 的內標（DNA Size Standard Kit -400 Base Pairs，AB sciex公司，貨號:608098)，再將以1^的？0?產物加入其中，滴入一滴礦物質油，防止電泳過程 中由于高溫導致PCR產物揮發(fā)。
[0040] 在另一個96孔緩沖液板的每個孔中加入約250yL的GenomeLab分離緩沖液。
[0041]根據(jù)毛細管電泳分析儀的操作手冊，將樣品板和緩沖液板放入機器，運行Frag-3 分離程序。執(zhí)行默認的分析方法，最后保存數(shù)據(jù)。
[0042]針對各個基因的PCR產物片段大小不同，得到的毛細管電泳峰圖，其中橫坐標表示 片段長度，縱坐標表示熒光強度。
[0043] 4.結果分析 毛細管電泳分析儀自動進行數(shù)據(jù)分析。
[0044]三、試劑盒的檢測結果判定 1.試劑盒有效性判定 同時滿足下列條件，才可進行結果判定： 1)陰性對照:在138nt~327nt之間未檢測到熒光信號。
[0045] 2)陽性對照：在各擴增片段長度處各檢測到一個熒光信號，且熒光信號值高于 2000 〇
[0046] 2.樣本有效性判定： 在138nt~327nt之間： 1)若檢測樣本的熒光信號值至少有一個高于200000，則樣本加入過量，建議對PCR產 物進行適當稀釋后再進行毛細管電泳檢測。
[0047] 2)若檢測樣本的熒光信號值均低于2000,則樣本加入量較低，可適當增加 PCR產 物加入量或增加 PCR反應循環(huán)數(shù);若仍然不符合要求，需重新制備樣本。
[0048] 3.結果判定標準 1)菌株鑒定 16S rRNA基因的目的片段區(qū)域出現(xiàn)了相應的峰且熒光信號值均高于2000,并且16S rRNA和ureC基因對應的特異性峰面積/fi-globin對應的特異性峰面積的比值大于0.1，可以 判斷感染了幽門螺桿菌。
[0049] 2)毒力鑒定 cagA、vacA-s 1、vacA-s2、vacA-ml、vacA_m2、i ceAl、i ceA2、dupA、〇 ipA、luxS基因的目的 片段區(qū)域出現(xiàn)了相應的峰，熒光信號值均高于2000,并且各毒力基因對應的特異性峰面積/ β-globin對應的特異性峰面積的比值大于0.1，說明患者感染的幽門螺桿菌中含有該毒力 基因表達。
[0050] 3)耐藥鑒定 (1)克拉霉素耐藥性 當180nt處出現(xiàn)峰面積/175nt處出現(xiàn)峰面積的比值小于0.25時，說明23S rRNA基因 2143位點為純合野生型，當23S rRNA基因2143位點為純合野生型，對克拉霉素無耐藥性。當 180nt處出現(xiàn)峰面積/175nt處出現(xiàn)峰面積的比值為0.25~0.7時，定為弱陽性，當23S rRNA 基因2143位點為弱陽性時，對克拉霉素有少量耐藥性。當180nt處出現(xiàn)峰面積/175nt處出現(xiàn) 峰面積的比值為0.7~4時，說明23S rRNA基因2143位點為雜合突變型，當180nt處出現(xiàn)峰面 積/175nt處出現(xiàn)峰面積的比值大于4時，說明23S rRNA基因2143位點為純合突變型，當23S rRNA基因2143位點為純合突變型或雜合突變型，對克拉霉素有耐藥性。
[0051 ] (2)甲硝唑耐藥性 當257.6nt處出現(xiàn)峰面積/252.6nt處出現(xiàn)峰面積的比值小于0.25時，說明rdxA基因148 位點為純合野生型，當rdxA基因148位點為純合野生型，對甲硝唑無耐藥性。當257.6nt處出 現(xiàn)峰面積/252.6nt處出現(xiàn)峰面積的比值為0.25~0.7時，定為弱陽性，當rdxA基因148位點 為弱陽性時，對甲硝唑有少量耐藥性。當257.6nt處出現(xiàn)峰面積/252.6nt處出現(xiàn)峰面積的比 值為0.7~4時，說明rdxA基因148位點為雜合突變型，當257.6nt處出現(xiàn)峰面積/252.6nt處 出現(xiàn)峰面積的比值大于4時，說明rdxA基因148位點為純合突變型，當rdxA基因148位點為純 合突變型或雜合突變型，對克拉霉素有耐藥性。
[0052] (3)阿莫西林耐藥性 當158.9nt處出現(xiàn)峰面積/153.8nt處出現(xiàn)峰面積的比值小于0.25時，說明pbplA基因 1777位點為純合野生型，當pbplA基因1777位點為純合野生型，對阿莫西林無耐藥性。當 158.9nt處出現(xiàn)峰面積/153.8nt處出現(xiàn)峰面積的比值為0.25~0.7時，定為弱陽性。當pbplA 基因1777位點為弱陽性時，對阿莫西林有少量耐藥性。當158.9nt處出現(xiàn)峰面積/153.8nt處 出現(xiàn)峰面積的比值為0.7~4時，說明pbplA基因1777位點為雜合突變型，當158.9nt處出現(xiàn) 峰面積/153.8nt處出現(xiàn)峰面積的比值大于4時，說明pbplA基因1777位點為純合突變型，當 pbplA基因1777位點為純合突變型或雜合突變型，對阿莫西林有耐藥性。
[0053] (4)左氧氟沙星耐藥性 當311]11:處出現(xiàn)峰面積/306111:處出現(xiàn)峰面積的比值小于0.25時，說明8714基因261位點 為純合野生型，當gyrA基因261位點為純合野生型，對左氧氟沙星無耐藥性。311nt處出現(xiàn)峰 面積/306nt處出現(xiàn)峰面積的比值為0.25~0.7時，定為弱陽性。當gyrA基因261位點為弱陽 性時，對左氧氟沙星有少量耐藥性。31 lnt處出現(xiàn)峰面積/306nt處出現(xiàn)峰面積的比值為0.7 ~4時，說明gyrA基因261位點為雜合突變型，31 lnt處出現(xiàn)峰面積/306nt處出現(xiàn)峰面積的比 值大于4時，說明gyrA基因261位點為純合突變型，當gyrA基因261位點為純合突變型或雜合 突變型，對左氧氟沙星有耐藥性。
[0054] 4)定量分析 當ureC對應的特異性片段（138nt)處出現(xiàn)的峰面積/fi-globin對應的特異性片段 (199nt)處出現(xiàn)峰面積的比值大于0.1，說明患者感染了幽門螺桿菌，比值與幽門螺桿菌的 拷貝數(shù)成正比，比值越大，說明幽門螺桿菌感染越嚴重。當ureC對應的特異性片段（138nt) 處出現(xiàn)的峰面積/fi-globin對應的特異性片段（199nt)處出現(xiàn)峰面積的比值小于0.02,判為 感染陰性。當ureC對應的特異性片段(138nt)處出現(xiàn)的峰面積/fi-globin對應的特異性片段 (199nt)處出現(xiàn)峰面積的比值為0.02~0.1時，需重新實驗。
[0055] 4.結果判斷實例 采用本實施例的試劑盒對陽性對照進行PCR反應后采用毛細管電泳分析后的圖譜如圖 1 所不。16S rRNA、ureC、fi-globin、cagA、vacA_sl、vacA_ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、dupA、 oipA、luxS、vacA_s2、23S rRNA、rdxA、pbplA和gyrA基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應的 峰。該結果非常直觀，1個菌種鑒定基因、2個定量基因、10個毒力相關基因、4個耐藥性基因 均擴增良好。說明各引物之間沒有干擾，能同時有效擴增所有目的基因。
[0056] 采用本實施例的試劑盒對陰性對照進行PCR反應后采用毛細管電泳分析后的圖譜 如圖2所示，沒有出現(xiàn)任何目的基因峰，只在小于100nt處有非特異性背景熒光信號。
[0057] 采用本實施例的試劑盒對樣本1進行PCR反應后采用毛細管電泳分析后的圖譜如 圖 3所不。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-ml、iceAl、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、 pbplA和gyrA基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應的峰。根據(jù)結果判定標準，說明該患者感染 了幽門螺桿菌，且表達相應毒力因子，對克拉霉素、左氧氟沙星有耐藥性，對甲硝唑、阿莫西 林沒有耐藥性。檢測結果非常直觀。
[0058] 采用本實施例的試劑盒對樣本2進行PCR反應后利用采用毛細管電泳分析后的圖 譜如圖4所不。16S rRNA、ureC、cagA、vacA_sl、vacA_m2、iceA2、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、 pbplA和gyrA基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應的峰。根據(jù)結果判定標準，說明該患者感染 了幽門螺桿菌，且表達相應毒力因子，對克拉霉素、甲硝唑有耐藥性，對阿莫西林、左氧氟沙 星沒有耐藥性。檢測結果非常直觀。
[0059] 采用本實施例的試劑盒對樣本3進行PCR反應后采用毛細管電泳分析后的圖譜如 圖 5所不。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA_m2、oipA、luxS、23S gyrA基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應的峰。根據(jù)結果判定標準，說明該患者感染了幽門 螺桿菌，且表達相應毒力因子，對阿莫西林有耐藥性，對克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星沒有 耐藥性。檢測結果非常直觀。
[0060] 采用本實施例的試劑盒對樣本4進行PCR反應后利用采用毛細管電泳分析后的圖 譜如圖6所不。16S rRNA、ureC、