專利名稱：一種耐大觀霉素淋球菌的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及實(shí)時熒光PCR檢測。
背景技術(shù)：
淋病的病原體是淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae，簡稱為淋球菌或NG)，它對人的感染力強(qiáng)，既無有效疫苗，治愈后又無持久的免疫力，該病除了可引起泌尿生殖系統(tǒng)化膿性感染外，還會引起淋菌性眼炎、咽喉炎、直腸炎、盆腔炎等合并性或播散性感染。根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年淋病發(fā)病數(shù)約為2500萬；我國淋病的發(fā)病率較長期居性病發(fā)病率的前兩位，2003年淋病報(bào)病數(shù)為59776例，居需傳報(bào)傳染病發(fā)病率第四位。
正確和規(guī)范使用抗生素，能快速治愈淋病，避免淋病慢性化及遷延化，是淋病防治的主要手段。但是，由于抗生素的大量不規(guī)范運(yùn)用，以及NG基因突變(如質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥、染色體突變耐藥)，致使臨床經(jīng)常發(fā)現(xiàn)淋病對多種抗生素產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致了淋病在人群中的長期存在和流行。美國CDC認(rèn)為當(dāng)一種抗生素對細(xì)菌的耐藥率大于5％，該藥就不應(yīng)作為治療該病的第一線用藥，以按此為標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)我國僅剩兩個臨床一線用藥(大觀霉素和頭孢三嗪)，上述藥物在我國的耐藥率分別為0.36％，0.46％，耐大觀霉素淋球菌在世界范圍內(nèi)目前仍然少見。我國已加入了全球淋病耐藥監(jiān)測網(wǎng)，以密切監(jiān)測淋病對常見藥物耐藥性的動態(tài)變化，指導(dǎo)臨床用藥，具有重要意義。
常用藥敏試驗(yàn)有紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、測β—內(nèi)酰胺酶、耐藥基因檢測探針等，其中瓊脂稀釋法是WHO的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法測定各種抗生素對淋球菌的最小抑菌濃度(MIC)，前兩種方法先通過培養(yǎng)患者的樣本鑒定為淋球菌后，再用純菌來培養(yǎng)檢測，該方法培養(yǎng)周期長，試驗(yàn)過程繁瑣；紙片擴(kuò)散法受人為因素影響大，重現(xiàn)性和定量性不足；測β—內(nèi)酰胺酶能檢測耐藥性的一個指標(biāo)；耐藥基因檢測探針特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，是一個好的檢測耐藥性的方法。尤其是近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)可彌補(bǔ)上述不足。熒光定量PCR靈敏度高，特異性好，速度快，已在基因表達(dá)水平分析、病原體的定性檢測和定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用，是當(dāng)前病原體核酸檢測和序列分析的主要方法。國內(nèi)目前也已有合格的乙肝、艾滋病、結(jié)核檢測的PCR試劑盒。
對于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來說，選擇待擴(kuò)增的靶DNA的堿基序列是最為重要的。16S rRNA是原核生物中高度保守基因序列，大小為1500堿基對左右，具有(1)保守性高，在生物進(jìn)化中比其他基因演變得慢，有“分子化石”之稱；(2)保守性是相對的，不同科、屬、種間都有不同程度的差異；(3)不能側(cè)向轉(zhuǎn)移；(4)大小適度，能滿足進(jìn)行比較、擴(kuò)增的要求。所以，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增檢測淋球菌，16SrRNA基因具有一定優(yōu)勢。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的引物，可以對淋球菌高效擴(kuò)增。
據(jù)最近的報(bào)道，導(dǎo)致淋球菌產(chǎn)生大觀霉素耐藥性的突變也發(fā)生在16SrRNA基因，突變區(qū)域與擴(kuò)增區(qū)域的一致使得定量檢測和突變鑒定同時進(jìn)行成為可能，但是目前尚未有報(bào)道確定可用于檢測耐大觀霉素淋球菌的特異性遺傳標(biāo)記物序列，也沒有見到相應(yīng)的方法或試劑盒能夠同時完成對淋球菌的檢測和耐大觀霉素突變區(qū)的鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種既能夠有效檢測淋球菌又可有效鑒定耐大觀霉素突變株的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及試劑盒。
技術(shù)方案本發(fā)明從淋球菌基因組中有目的的選出了一段約1500個堿基對的16S核糖體RNA基因(16S ribosomal RNA gene)(ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY，May.2000，p.1365-1366)，適合作為特異性PCR檢測的擴(kuò)增靶序列。
如本文所用，術(shù)語“16S ribosomal RNA gene”或“16S核糖體RNA基因”指編碼淋球菌16S核糖體RNA的核苷酸序列，其GenBank登錄號X07714，具體序列示于SEQ ID NO1。
本發(fā)明還提供一種同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，反應(yīng)的步驟依次為
(1)抽提樣品的DNA；(2)將抽提的DNA作為模板，用一對正反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物以確定樣品中是否存在淋球菌株；(4)鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在突變以檢測大觀霉素耐藥性；其中，正引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，反引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補(bǔ)，長度范圍均為15-35個核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的優(yōu)選方案，即正反引物設(shè)計(jì)于SEQ ID NO2的兩端。
本發(fā)明提供上述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的一種優(yōu)選方案為，所說引物中的一個為5’CATTAGTTGC CATCATTCG3’，另一個為5’CCCTCTGTAC CGACCATT 3’。
本發(fā)明還提供上述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法另一種優(yōu)選方案，即所述反應(yīng)還含有兩個長度為15-30個核苷酸的探針，其中一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，另一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補(bǔ)。
上述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的進(jìn)一步優(yōu)選方案為，所述的兩個DNA探針序列分別為5’ACGTCAAGTC CTCATGGC3’和5’CGTGTGAAGC CCTGGTCAT 3’。
本發(fā)明還提供所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的優(yōu)選方案，其反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為70-160個核苷酸對。
本發(fā)明的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的進(jìn)一步優(yōu)選方案為，所述的步驟(3)是通過檢測熒光信號的強(qiáng)弱來定量檢測樣品中的淋球菌。
本發(fā)明的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的進(jìn)一步優(yōu)選方案為，所述的步驟(4)是通過檢測另一種熒光信號并與步驟(3)的熒光信號進(jìn)行比對來定性檢測樣品中淋球菌的突變情況。
基于SEQ ID NO1和2，本發(fā)明不僅提供了一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增16S核糖體RNA基因檢測耐大觀霉素淋球菌的方法，還提供一種快速定量檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光定量PCR試劑盒。
本發(fā)明提供的含有上述的檢測淋球菌的遺傳標(biāo)記物的試劑盒，試劑組成包括DNA裂解液、熒光定量反應(yīng)液、定量校準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品、突變對照品，其中，定量校準(zhǔn)品是含有所述的SEQ ID NO2的136個核苷酸序列的質(zhì)粒。
本發(fā)明的關(guān)鍵是使用了特異性擴(kuò)增耐大觀霉素淋球菌遺傳標(biāo)記物的引物對，所述的引物長度為15-35個核苷酸，且一個引物的序列SEQ ID NO3與SEQID NO1所示的部分序列相同，且另一個引物的序列SEQ ID NO4與SEQ ID NO1所示的部分序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為136bp。SEQ ID NO3和4分別對應(yīng)于SEQ ID NO1的1120和1238bp位置。
本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增耐大觀霉素淋球菌的引物以及檢測用探針，可根據(jù)遺傳標(biāo)記物的序列SEQ ID NO1或2進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過常規(guī)的DNA合成方法獲得，例如可以用商業(yè)化的DNA自動合成儀合成。
本發(fā)明的這些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
為了減少假陽性，并完成耐大觀霉素突變區(qū)的檢測，還需對擴(kuò)增產(chǎn)物用淋球菌特異性探針和耐大觀霉素突變特異探針同時進(jìn)行雜交。一種優(yōu)選的探針是Taqman探針(見下文說明)，它可在PCR反應(yīng)中直接實(shí)時地通過熒光信號反映擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否以及產(chǎn)物拷貝數(shù)量的高低。
本發(fā)明的探針TaqMan是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)探針與靶序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此Taqman探針檢測的是積累熒光。
本發(fā)明提及的探針序列5’端用報(bào)告熒光基團(tuán)如FAM(Carboxyfluorescein，6-羧基熒光素)或TET(Tetrachloro fluorescein，四氯-6-羧基熒光素)標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)如TAMRA(Tetramethylrhodamine，6-羧基四甲基若丹明)或Dabcyl(4-(4’-惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸)標(biāo)記后即可用于對耐大觀霉素淋球菌檢測的PCR反應(yīng)。
雖然引物和探針與模板序列的完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5’端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。利用這些有錯配堿基的相似引物、或者含有這些引物的試劑盒、以及使用這些引物的檢測方法都在本發(fā)明技術(shù)方案范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物包含有本發(fā)明的淋球菌16S核糖體RNA基因或其片段。
雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為7O-1000bp，較佳地為90-500bp，更佳地為100-300bp。
在一個優(yōu)選例中，本說明書提供一種快速定量檢測耐大觀霉素的熒光PCR試劑盒，該試劑盒的組成包括a)DNA裂解液，b)熒光定量反應(yīng)液，c)定量校準(zhǔn)品，d)陽性對照品，e)陰性對照品，f)突變對照品，具體為1)熒光定量反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液，特異性擴(kuò)增淋球菌16S核糖體RNA基因遺傳標(biāo)記物的引物和熒光探針(例如引物序列為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，熒光探針序列為SEQ ID NO5，SEQ ID NO6)；SEQ ID NO5熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是TET，SEQ ID NO6熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6熒光探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA；2)定量校準(zhǔn)品是含有SEQ ID NO2中136個核苷酸片段構(gòu)成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌中增殖。陽性對照品是淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC83785(英國倫敦國家標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心)培養(yǎng)物。突變對照品是臨床耐藥株培養(yǎng)物，從性病門診有癥狀淋病患者中分離。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，熒光定量反應(yīng)液包含50mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，熒光探針各0.5pmol，0.2mM dNTPs、無菌雙蒸水和1.5個單位的Taq酶(ROCHE公司，瑞士)。其中引物為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，熒光探針為SEQ ID NO5，SEQ ID NO6所示的核苷酸序列，兩個熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)分別是FAM、TET，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)都是TAMRA。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，定量校準(zhǔn)品是含有SEQ ID NO2共136個核苷酸片段構(gòu)成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌中增殖。貯存濃度為4×109拷貝/μL，使用前10倍梯度稀釋。含有目的片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌增殖后，用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測A260定量并稀釋至4×109拷貝/μL，-20℃保存。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。
在本發(fā)明提供的檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光定量PCR試劑盒中，有兩條兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)的特異性探針，在探針完整時，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離靠近，5’端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光應(yīng)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3’端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中檢測不到熒光。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性對熒光探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán)之間的FRET，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量PCR儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈正比例關(guān)系。這種探針的設(shè)計(jì)即被稱為Taqman探針。
對淋球菌的定量可以通過與定量校準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量底循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多；相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用梯度定量校準(zhǔn)品的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。
本發(fā)明提供的檢測耐大觀霉素的熒光定量PCR試劑盒，經(jīng)過對各組分，如引物濃度、熒光探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，將FQ-PCR技術(shù)和實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)(icycler，Rotorgene)相結(jié)合。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，試劑盒完全可以滿足快速特異檢測耐大觀霉素淋球菌的實(shí)際需求。
本發(fā)明還進(jìn)一步具體提供一種利用本發(fā)明試劑盒檢測耐大觀霉素淋球菌的方法，該方法包括如下檢測步驟a)用DNA裂解液從陽性對照品和待測樣本中提取DNA；b)分別取上步提取的DNA、梯度定量校準(zhǔn)品加入熒光反應(yīng)液中用實(shí)時熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，同時在510nm和550nm條件下分別檢測；c)通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品510nm下的循環(huán)閾值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
d)通過比較待測樣品550nm下的循環(huán)閾值和510nm下的循環(huán)閾值而對待測樣品的突變情況進(jìn)行定性。
有益效果本發(fā)明從淋球菌基因組中發(fā)現(xiàn)一段約1500個堿基對的16S核糖體RNA基因，該基因?yàn)榱芮蚓旧硖赜械幕蛐蛄?，編碼16S核糖體RNA。從臨床得到的耐大觀霉素淋球菌株均在16S核糖體RNA基因上發(fā)現(xiàn)了突變。其他物種，如大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌的大觀霉素耐藥性的原因也被確認(rèn)是由各自的16S核糖體RNA基因發(fā)生突變導(dǎo)致的。因此，選擇這一特定的核酸序列作為引物，具有很好的特征性。
根據(jù)本發(fā)明所述的16S核糖體RNA基因設(shè)計(jì)的引物可在淋球菌的標(biāo)準(zhǔn)株及臨床標(biāo)本中擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段。而且，該引物未在其他相關(guān)病原體上擴(kuò)增出相應(yīng)片段，說明以16S核糖體RNA基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)系統(tǒng)具有良好特異性。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的兩條淋球菌專一性核酸引物具有嚴(yán)格的種特異性。用本發(fā)明引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，結(jié)果能從含有淋球菌的材料的DNA提取物中擴(kuò)增出大小為136bp特異性PCR產(chǎn)物。因此，以本發(fā)明引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，并通過判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無可以準(zhǔn)確、快速地檢測淋球菌，而且所需的樣品量很少。
就敏感性而言，16S核糖體RNA基因在基因組中多拷貝存在。當(dāng)以此序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物并對淋病患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，比單拷貝基因序列更能滿足臨床對檢出靈敏度的需要。
根據(jù)對臨床耐大觀霉素淋球菌株的基因序列分析，SEQ ID NO2所示的核苷酸序列包含了臨床發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，是一種特別優(yōu)選的適合作為耐大觀霉素淋球菌特異性遺傳標(biāo)志的序列。
將本發(fā)明的引物與Taqman探針技術(shù)結(jié)合，便得到了本發(fā)明的同時對耐大觀霉素淋球菌進(jìn)行定性檢測和定量計(jì)數(shù)分析方法。本發(fā)明第一次揭示了擴(kuò)增16S核糖體RNA基因檢測耐大觀霉素淋球菌的可能，同時提供了一種在此基礎(chǔ)上快速特異檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光定量PCR試劑盒。該試劑盒對耐大觀霉素淋球菌的檢測操作簡單，僅需2～3小時。整個操作過程只需一人，一次可檢測32～96(實(shí)時熒光PCR儀型號決定)個樣品，減少了人力資源的浪費(fèi)。同時，這種分析方法不僅克服了常規(guī)定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
另外，本發(fā)明與現(xiàn)常用的培養(yǎng)法相比具有以下主要優(yōu)點(diǎn)和效果a)檢測速度快，加上DNA的提取，2～3小時完成；b)熒光探針的存在，保證了檢測的特異性和靈敏度。
c)操作簡單，檢測淋球菌存在的同時完成突變鑒定；d)定量準(zhǔn)確；
e)可同時進(jìn)行高通量的樣品檢測。
本發(fā)明成功設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于導(dǎo)致淋球菌產(chǎn)生大觀霉素耐藥性的突變發(fā)生在相對保守的16S rRNA基因，突變區(qū)域與擴(kuò)增區(qū)域的一致使得定量檢測和突變鑒定同時進(jìn)行成為可能，故本發(fā)明的方法和試劑盒能夠同時完成對淋球菌的檢測和耐大觀霉素突變區(qū)的鑒定。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等著，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1分離用于PCR分析的淋球菌DNA為了從待測樣本中分離用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測的淋球菌DNA，必須使用不影響聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡單方法。首先，用滅菌生理鹽水漂洗臨床樣本(生殖泌尿道拭子)，將漂洗液15,000rpm離心15分鐘后棄上清，從而漂洗液中可能含有的淋球菌被收集起來。沉淀中加入DNA裂解液后，振蕩混勻，100℃沸水浴15分鐘，裂解淋球菌釋放DNA。最后15,000rpm離心15分鐘，DNA溶解至上清液中，取上清液作為用于PCR分析的淋球菌DNA。
實(shí)施例2檢測試劑盒的制備用常規(guī)方法制備一種快速定量檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光PCR試劑盒，該試劑盒包括a)DNA裂解液，b)熒光定量反應(yīng)液，c)定量校準(zhǔn)品，d)陽性對照品，e)陰性對照品，f)突變對照品。其中1)熒光定量反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液，特異性擴(kuò)增16S核糖體RNA基因遺傳標(biāo)記物的引物序列為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，熒光探針序列為SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO5熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是TET，SEQ ID NO6熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6熒光探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)都是TAMRA。(擴(kuò)增產(chǎn)物大小為136bp)
具體地，熒光定量反應(yīng)液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，熒光探針各0.5pmol，0.2mM dNTPs、無菌雙蒸水和1.5個單位的Taq酶(ROCHE公司，瑞士)。
2)定量校準(zhǔn)品是含有SEQ ID NO2共136個核苷酸的pGEM-T載體(該載體購自Promega公司，SEQ ID NO2插入β-內(nèi)酰胺酶編碼區(qū))，且該載體可在大腸桿菌中增殖。陽性對照品是淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC 83785(英國倫敦國家標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心)培養(yǎng)物。突變對照品是臨床耐藥株培養(yǎng)物，從性病門診有癥狀淋病患者中分離。
具體地，定量校準(zhǔn)品的貯存濃度為4×109拷貝/μL，使用前10倍梯度稀釋。含有目的片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌增殖后，用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測A260定量并稀釋至4×109拷貝/μL，-20℃保存。
3)DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。
實(shí)施例3用淋球菌進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別取實(shí)施例2中的熒光反應(yīng)液各26μL加入到不同的PCR反應(yīng)管中，將實(shí)施例1所得的DNA和定量校準(zhǔn)品向熒光定量反應(yīng)液中加入4μL，總體積30μL。在實(shí)時熒光定量PCR儀(澳大利亞Corbett，Rotor-Gene2000)上開始擴(kuò)增檢測。擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為變性溫度94℃10秒，退火延伸溫度63℃30秒的循環(huán)下，進(jìn)行40個循環(huán)的PCR擴(kuò)增。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的退火步驟結(jié)束時，檢測波長為510nm和550nm。
循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器配套軟件，510nm讀取待檢樣本拷貝數(shù)。結(jié)果為定量校準(zhǔn)品4×106拷貝數(shù)/μL、4×105拷貝數(shù)/μL、4×104拷貝數(shù)/μL的Ct值分別為23.28、27.21、31.27；待測樣本的Ct值范圍為17～37，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算定量范圍為1.81×108拷貝數(shù)/μL～1.2×103拷貝數(shù)/μL。具體結(jié)果如下表


這表明，本發(fā)明試劑盒中可在1.81×108拷貝數(shù)/μL～1.2×103拷貝數(shù)/μL的廣大范圍內(nèi)擴(kuò)增出耐大觀霉素淋球菌。
運(yùn)用儀器配套軟件，550nm讀取待檢樣本拷貝數(shù)。結(jié)果為定量校準(zhǔn)品4×106拷貝數(shù)/μL、4×105拷貝數(shù)/μL、4×104拷貝數(shù)/μL的Ct值分別為24.22、27.93、31.03；待測樣本中的550nm下Ct值與510nm下Ct值差異野生型淋球菌≤3，突變型淋球菌＞3。具體結(jié)果如下表

這表明，本發(fā)明試劑盒可有效鑒別淋球菌耐大觀霉素的突變情況。
實(shí)施例4用各種病原體進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用實(shí)施例1-3相同的方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測，不同點(diǎn)在于本實(shí)施例的反應(yīng)模板選取其他可能出現(xiàn)在相近解剖位置的病原體的DNA，如沙眼衣原體、解脲支原體、人形支原體、金黃色葡萄球菌、人白細(xì)胞DNA。
檢測結(jié)果如下表

如上所述，本實(shí)施例對其他相近的病原體基因無交叉反應(yīng)，可特異地?cái)U(kuò)增出淋球菌。
實(shí)施例5用各種病原體進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重復(fù)實(shí)施例1-4的相同方法，不同點(diǎn)僅在于用SEQ ID NO7和8所示的引物替換SEQ ID NO3和4所示的引物。
檢測結(jié)果表明，該引物對同樣可以特異地?cái)U(kuò)增出耐大觀霉素淋球菌產(chǎn)物長度305堿基對。同時可以有效地鑒別淋球菌耐大觀霉素的突變情況。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司<120>一種耐大觀霉素淋球菌的檢測方法及試劑盒<130>040291<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1544<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>1tgaacataag agtttgatcc tggctcagat tgaacgctgg cggcatgctt tacacatgca60agtcggacgg cagcacaggg aagcttgctt ctcgggtggc gagtggcgaa cgggtgagta120acatatcgga acgtaccggg tagcggggga taactgatcg aaagatcagc taataccgca180tacgtcttga gagggaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatccgag cggccgatat240ctgattagct ggttggcggg gtaaaggccc accaaggcga cgatcagtag cgggtctgag300aggatgatcc gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg360gggaattttg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgtct gaagaaggcc420ttcgggttgt aaaggacttt tgtcagggaa gaaaaggctg ttgccaatat cggcggccga480tgacggtacc tgaagaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta540gggtgcgagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcggg cgcagacggt tacttaagca600ggatgtgaaa tccccgggct caacccggga actgcgttct gaactgggtg actcgagtgt660gtcagaggga ggtggaattc cacgtgtagc agtgaaatgc gtagagatgt ggaggaatac720cgatggcgaa ggcagcctcc tgggataaca ctgacgttca tgtccgaaag cgtgggtagc780aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccctaaacga tgtcaattag ctgttgggca840acttgattgc ttggtagcgt agctaacgcg tgaaattgac cgcctgggga gtacggtcgc900aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cggtggatga tgtggattaa960ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggt tttgacatgt gcggaatcct ccggagacgg1020aggagtgcct tcgggagccg taacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg1080agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc attagttgcc atcattcggt1140tgggcactct aatgagactg ccggtgacaa gccggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc1200ctcatggccc ttatgaccag ggcttcacac gtcatacaat ggtcggtaca gagggtagcc1260aagccgcgag gcggagccaa tctcacaaaa ccgatcgtag tccggattgc actctgcaac1320tcgagtgcat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcaggtca gcatactgcg gtgaatacgt1380tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggggatacc agaagtaggt1440agggtaaccg caaggagtcc gcttaccacg gtatgcttca tgactggggt gaagtcgtaa1500caaggtagcc gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct ttct1544<210>2<211>136<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>2cattagttgc catcattcgg ttgggcactc taatgagact gccggtgaca agccggagga60aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgacca gggcttcaca cgtcatacaa120tggtcggtac agaggg136<210>3<211>19<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>3cattagttgc catcattcg19<210>4<211>18<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae
<400>4ccctctgtac cgaccatt18<210>5<211>18<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>5acgtcaagtc ctcatggc18<210>6<211>19<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>6cgtgtgaagccctggtcat19<210>7<211>21<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>7gtcgtgagatgttgggttaa g21<210>8<211>16
<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>8cgtattcacc gcagta1權(quán)利要求
1.一種同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述反應(yīng)的步驟依次為(1)抽提樣品的DNA；(2)將抽提的DNA作為模板，用一對正反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物以確定樣品中是否存在淋球菌株；(4)鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在突變以檢測大觀霉素耐藥性；其中，正引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，反引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補(bǔ)，長度范圍均為15-35個核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于正反引物設(shè)計(jì)于SEQ ID NO2的兩端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述引物中的一個為5’CATTAGTTGC CATCATTCG3’，另一個為5’CCCTCTGTAC CGACCATT 3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述反應(yīng)還含有兩個長度為15-30個核苷酸的探針，其中一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，另一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補(bǔ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述的兩個探針序列分別為5’ACGTCAAGTCCTCATGGC 3’和5’CGTGTGAAGC CCTGGTCAT 3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為70-160個核苷酸對。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述的步驟(3)是通過檢測熒光信號的強(qiáng)弱來定量檢測樣品中的淋球菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述的步驟(4)是通過檢測另一種熒光信號并與步驟(3)的熒光信號進(jìn)行比對來定性檢測樣品中淋球菌的突變情況。
9.含有權(quán)利要求1所述的檢測淋球菌的遺傳標(biāo)記物的試劑盒，試劑組成包括DNA裂解液、熒光定量反應(yīng)液、定量校準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品、突變對照品，其特征在于定量校準(zhǔn)品是含有所述的SEQ ID NO2的136個核苷酸序列的質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用遺傳標(biāo)記物來同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及試劑盒，特別是選取淋球菌16S rRNA的核苷酸序列，設(shè)計(jì)出了特異性檢測的寡核苷酸引物和探針。本發(fā)明可方便、快速、準(zhǔn)確地定性檢測和定量計(jì)數(shù)淋球菌，同時鑒別是否發(fā)生了淋球菌大觀霉素的突變。
文檔編號C12Q1/04GK1789430SQ20041009305
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日
發(fā)明者張繼倫, 李超, 周煜, 夏懿 申請人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司