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一種21號(hào)染色體數(shù)目的快速檢測(cè)方法

文檔序號(hào):562239閱讀:708來源:國(guó)知局
專利名稱:一種21號(hào)染色體數(shù)目的快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種可迅速檢測(cè)21號(hào)染色體數(shù)目的分子生物學(xué)方法。
背景技術(shù)
大多數(shù)的真核生物為二倍體,即一個(gè)正常體細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)為2的倍數(shù),即2N,如人類正常體細(xì)胞中有2*23條染色體。當(dāng)人類染色體偏離正常的數(shù)目,將導(dǎo)致相應(yīng)的染色體疾病。若個(gè)別一條或幾條染色體的數(shù)目改變,體細(xì)胞的染色體數(shù)目不是23的整倍數(shù),稱為非整倍體。人類最常見的染色體數(shù)目異常是出現(xiàn)了一條額外的21號(hào)染色體,即21號(hào)染色體三體性。這種21號(hào)染色體的數(shù)目異常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的染色體疾病——21三體,由于該病首先由英國(guó)醫(yī)生Langdon Down進(jìn)行了描述,故又稱為唐氏綜合征。唐氏綜合征的臨床特征主要為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、不同程度的智力低下和包括頭面部特征在內(nèi)的一系列異常體征,這使得該病在過去又不幸被稱為先天愚型。新生兒中21三體的發(fā)病率約為1/600-900,是新生兒中最為常見的染色體異常。95%唐氏綜合征患者的染色體基礎(chǔ)都是繼發(fā)于減數(shù)分裂時(shí)染色體不分離所致的21三體,即全身體細(xì)胞均多了一條21號(hào)染色體,這類核型稱為游離型,通常臨床癥狀典型而且顯著。通過DNA多態(tài)性分析,能夠在大部分的家庭中判定不分離發(fā)生在雙親中的哪一方以及減數(shù)分裂的哪一步。額外的21號(hào)染色體多來自母親的第一次減數(shù)分裂。大約4%的唐氏綜合征是非平衡易位的結(jié)果,這種核型為易位型,患者雖然只有46條染色體,但因一條21號(hào)易位到另一條D組或G組的染色體上,加上正常的兩條21號(hào)染色體,仍多了一條額外的21號(hào)長(zhǎng)臂,而決定本病的關(guān)鍵區(qū)帶為21號(hào)長(zhǎng)臂,故臨床上仍表現(xiàn)出21三體的癥狀。最后,不到3%的唐氏綜合征患者是嵌合體,同時(shí)具有正常的和異常的兩種細(xì)胞系,癥狀取決于異常細(xì)胞所占的比例,但一般較輕。目前,除了加強(qiáng)護(hù)理和訓(xùn)練,延長(zhǎng)患者的壽命,增強(qiáng)其生活自理能力外,人類對(duì)于唐氏綜合征并沒有有效的治療措施。此病的發(fā)生給患者家庭和社會(huì)都帶來極大的負(fù)擔(dān)。因此,提高染色體數(shù)目的檢測(cè)水平,尤其在產(chǎn)前進(jìn)行檢測(cè)的水平,減少唐氏綜合征患兒的出生,非常重要。
對(duì)胎兒細(xì)胞進(jìn)行核型分析是已有的染色體數(shù)目的檢測(cè)方法,這個(gè)過程包括胎兒細(xì)胞的體外培養(yǎng)和中期胎兒細(xì)胞的核型分析。細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要一定數(shù)量的存活細(xì)胞和相當(dāng)?shù)膶I(yè)技術(shù)知識(shí),在下列幾種情況下都可能無法實(shí)施核型分析1、細(xì)胞培養(yǎng)失敗。據(jù)統(tǒng)計(jì),細(xì)胞培養(yǎng)失敗的發(fā)生率約為1-2%。2、收集的細(xì)胞數(shù)目有限,不能得出明確的結(jié)論。為確保足夠的培養(yǎng)物用于核型分析,必須獲得大于5ml的羊水。當(dāng)一次羊水穿刺抽出的羊水量少于5ml時(shí),就不得不進(jìn)行反復(fù)的羊水穿刺,從而增加了感染和損傷的風(fēng)險(xiǎn)。3、培養(yǎng)物被污染。有文獻(xiàn)報(bào)道,即使在經(jīng)驗(yàn)豐富的試驗(yàn)室,母體細(xì)胞的污染率也可達(dá)10-14%。4、由于細(xì)胞培養(yǎng)僅限于存活細(xì)胞,因此某些特殊的樣本無法進(jìn)行核型分析,如一些妊娠產(chǎn)物以及福爾馬林固定或石蠟包埋樣本。此外,傳統(tǒng)的生物非整倍體的檢測(cè)方法最為顯著的缺點(diǎn)是細(xì)胞培養(yǎng)過程耗時(shí)太長(zhǎng),大致需要兩周左右的時(shí)間,這就易于造成處理上的延誤。因此,迅速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)非常有價(jià)值。
近年來,熒光原位雜交(fluorecent in situ hybridization,F(xiàn)ISH)和定量熒光PCR(quantitative fluorecent polymerase chain reaction,QF-PCR)已經(jīng)應(yīng)用于染色體數(shù)目的檢測(cè)。就熒光原位雜交檢測(cè)生物非整倍體的方法而言,間期細(xì)胞的熒光原位雜交可不必進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),大大縮短了診斷所需的時(shí)間;商業(yè)化探針的應(yīng)用提高了FISH的敏感性和特異性。但另一方面,這項(xiàng)診斷技術(shù)仍然具有一定的局限性1、在未培養(yǎng)的羊水中,熒光標(biāo)記的探針會(huì)與細(xì)胞骨架非特異性地結(jié)合,使背景不清晰,F(xiàn)ISH的有效性大大降低。2、必須要有完整的細(xì)胞用于分析。3、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)技能要求較高。4、母體細(xì)胞的污染會(huì)導(dǎo)致對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。5、相較QF-PCR,F(xiàn)ISH分析耗時(shí)長(zhǎng)、成本高,限制了其對(duì)樣本的高通量檢測(cè)。
定量熒光PCR方法利用了基因組中廣泛分布的短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandem repeats,以下簡(jiǎn)稱STR)。STR通常由2~6bp的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成,具有高度的多態(tài)性,易于采用復(fù)合擴(kuò)增方式進(jìn)行擴(kuò)增。而熒光復(fù)合擴(kuò)增是目前世界上應(yīng)用最普遍的復(fù)合擴(kuò)增方法,通常是在各個(gè)靶序列其中一條引物的一端標(biāo)記上熒光物質(zhì),利用自動(dòng)激光熒光遺傳分析儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。STR的擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳時(shí)按片段大小分離,根據(jù)熒光峰的數(shù)目和強(qiáng)度確定每個(gè)等位基因的拷貝數(shù),從而反映特定染色體的拷貝數(shù)。正常的雜合子個(gè)體會(huì)產(chǎn)生高度相近的兩個(gè)峰,純合子則表現(xiàn)為單獨(dú)的一個(gè)STR峰。當(dāng)染色體數(shù)目異常時(shí),所檢測(cè)的熒光峰將會(huì)觀察到數(shù)目和強(qiáng)度的異常,或者出現(xiàn)峰高相近的三個(gè)峰或者出現(xiàn)高度比值接近2∶1的兩個(gè)峰。由于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增方法和熒光檢測(cè)的應(yīng)用,這種檢測(cè)方法非常靈敏,可用于少量樣本的檢測(cè),如母體血液中收集的胎兒細(xì)胞或胎兒DNA,也可確定母體細(xì)胞的污染。尤為重要的是,這種方法非常迅速,DNA的提取和擴(kuò)增僅需5個(gè)小時(shí)左右,每個(gè)熒光產(chǎn)物的分析會(huì)在半小時(shí)內(nèi)完成。加之易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,有可能對(duì)36~96個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),因此幾十個(gè),甚至幾百個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果可在一天內(nèi)得到。對(duì)于定量熒光PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果的認(rèn)定目前還很有爭(zhēng)議,因?yàn)檫@種方法本身尚存在一些問題。首先,目前的定量熒光PCR檢測(cè)方法僅選取了每條染色體上的2-4個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。對(duì)一個(gè)特定的染色體來說,僅由2-4個(gè)STR位點(diǎn)構(gòu)成的檢測(cè)系統(tǒng)通常不能保證檢測(cè)出所有的非整倍體,尤其當(dāng)STR位點(diǎn)的雜合度不高時(shí)。在許多運(yùn)用定量熒光PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)中,總有部分樣本不能提供信息,卻一條染色體上的幾個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為一個(gè)STR峰,無法分辨是正常還是非整倍體的純合子。尤為重要的是,定量熒光PCR檢測(cè)方法在檢測(cè)到兩個(gè)峰時(shí),將峰高或峰面積的比值與事先建立的正常參考值范圍對(duì)照,作為判斷是否是非整倍體的依據(jù)之一,這使該方法的有效性大大降低。PCR是個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程,擴(kuò)增產(chǎn)物量和模板量并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,當(dāng)出現(xiàn)兩個(gè)等位基因峰時(shí),對(duì)結(jié)果的判斷在實(shí)際操作中比較復(fù)雜。若兩個(gè)峰的高度或面積的比值接近正常參考值范圍的界值,對(duì)結(jié)果的判斷就會(huì)模棱兩可;多個(gè)靶位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增,由于熒光峰的重疊,其位置和強(qiáng)度有時(shí)也難以解釋;某些位點(diǎn)存在優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增現(xiàn)象,很容易導(dǎo)致誤診,尤其是在模板量少時(shí)。當(dāng)出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增時(shí),或是由于片段小的等位基因過度擴(kuò)增而將染色體的非整倍體誤判為正常的二倍體,或是由于正常二倍體個(gè)體的一個(gè)等位基因擴(kuò)增效率低而被誤判為非整倍體。在實(shí)踐中,定量熒光PCR通常是作為一種輔助的檢測(cè)方法而與傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法聯(lián)合使用,最后的確診結(jié)果仍需通過細(xì)胞遺傳學(xué)的方法獲得。
但是,近期的研究結(jié)果表明,如果采用一種新的生物非整倍體檢測(cè)方法,對(duì)用于非整倍體檢測(cè)的STR位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)選,嚴(yán)格選擇多態(tài)性好的四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn),并增加位點(diǎn)個(gè)數(shù)至6個(gè)或6個(gè)以上,保證檢測(cè)系統(tǒng)的效能,使檢測(cè)更有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義,同時(shí),采用更嚴(yán)格的檢測(cè)判定方法,即僅僅在觀察到特定染色體上兩個(gè)以上的特異性STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰時(shí),才認(rèn)定該染色體為非整倍體,就可以使檢測(cè)結(jié)果的判定更加直觀而明確,能夠真正準(zhǔn)確、快速、高通量地進(jìn)行生物非整倍體檢測(cè)。這種方法對(duì)特定染色體上STR位點(diǎn)的數(shù)量和多態(tài)性提出了更高的要求。然而,據(jù)我們所知,在目前的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中,某些染色體上現(xiàn)有的微衛(wèi)星位點(diǎn)并不能滿足上述的要求,如21號(hào)染色體。因此,要運(yùn)用該方法對(duì)特定的染色體非整倍體進(jìn)行快速檢測(cè),面臨的首要問題將是新的微衛(wèi)星位點(diǎn)的開發(fā)。
開發(fā)新的、具有高度多態(tài)性的21號(hào)染色體特異性微衛(wèi)星位點(diǎn),將上述生物非整倍體的檢測(cè)方法應(yīng)用于21號(hào)染色體數(shù)目的檢測(cè),將對(duì)快速確診臨床上最為常見的染色體病——唐氏綜合征提供客觀的診斷依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即是提供一種可迅速、準(zhǔn)確地對(duì)21號(hào)染色體的數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)的分子生物學(xué)方法。
本發(fā)明的21號(hào)染色體數(shù)目的快速檢測(cè)方法是按以下步驟進(jìn)行a、從待檢樣本中提取樣本DNA;b、對(duì)樣本DNA中的21號(hào)染色體上由我們定義的特異性STR位點(diǎn)LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位點(diǎn)D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中序列ATTTATGAGGTAGGTTCCTTAGCCCCATTTCACAGGCTGAGAACCTGAGACTGTCAACACTAAGCTGATTTTACTGTGATTACATCTTAGTGAGTGACAGATCTAGCAATCATGGAATTGAGAAGGCCCCACCTATGTTATGTTATAA(CATAA)n(CATAG)mCATGGCAACATAACATAACACAGGGGGCCTTCTCAATTATTTATAACATAACATAGGGGAGGCCTTATAAT
被我們命名為L(zhǎng)FG20位點(diǎn),該位點(diǎn)為一五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(CATAAxCATAG),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m表示。
序列ATTGGCGAATCATGACACTAATTTTGGCCAGCATTTAC(GAATA)nGAATGGATCAGAGTAATATTAAAGAGTATCTAGATATTCATCCACATTATAAAGTTTTAGTTCAGGCCTCTTTTTCTTCTCCATCAAGTTATTCCTTGAGGCTTCCCTGAACTTTTTATTTTATGCCTTTCT,被我們命名為L(zhǎng)FG21位點(diǎn),該位點(diǎn)為一五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(GAATA),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n表示。
序列TTAAAAGTTACAGGTTCTAGGAAACATGGCTGGTGAATACAATAATAATTTATTAATTTTAATGTCAGCTTCAAATTTTTGGTTCTTTGGAAAATTGTTTAGGCCCCCAAATATATAGGTC(TATG)n(CATG)mTATG(CATG)k(TATG)p(TATC)qTATAGCTGCATTGATGCTGTAAGT,被我們命名為L(zhǎng)FG24位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(TATGxCATGxTATC),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m,k,p,q表示。
序列ACCACTTTAGAGTTGACAAACTCCATGTTGGAACAGAGTATTCTTAAACAGAACCCTTAAAACCATATTTTTCACCTCTCTGTTTT(TATC)nTATTGAGACAGGGTCTTGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTCGTGTGATCACGGTTCTCTGCAGCCTCGATCTCCTGGGCTCTAGCTATCCTCCCAACTAGCTCAGATTACA,被我們命名為L(zhǎng)FG26位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(TATC),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n表示。
序列ACTTTCTGGTTTGGAAAATTTGCTTGAGAGGTAAAAAGAAAATTT(ACTT)n(ATTT)mAGTAGAGACAGAATCTCGCTCTGTTGCTCAGGCTGGAGTGCAGTAGCACGATCCTGGCTCACTGCAAACTGACTCCTGGGTTCAGGTG,被我們命名為L(zhǎng)FG29位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(ACTTxATTT),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m表示。
序列CAGGTGTGAGCCACCATACCCAGCCTTACTGTATC(ATAG)nATG(ATAG)mAATATAGTTGCCTACAATATTCAGCACAGTAACAGCTATATAGGTCTGTAGCTTGGGAGCAATAGGC,被我們命名為L(zhǎng)FG33位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(ATAG),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m表示。
序列CTATTTGGTACACAAGGCAGAATAAAGGGATTATTGCTTGA(TAGG)n(TAGA)mAGA(TAGA)kTGAGACAAGACAAGACAGACTATGAATAAATTAATCATACTGCTG;被我們命名為L(zhǎng)FG34位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(TAGGxTAGA),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m,k表示。
c、根據(jù)對(duì)上述位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果確定樣本中21號(hào)染色體的數(shù)目。
例如,用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增后,以等位基因相應(yīng)熒光峰的數(shù)目確定樣本中21號(hào)染色體的數(shù)目。
在本發(fā)明中,上述STR位點(diǎn)D21S1435,D21S1436,D21S2052,D21S2054均為現(xiàn)有的STR位點(diǎn),它們的核心序列、參考序列等信息可以從互聯(lián)網(wǎng)上公共的人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到。
以下對(duì)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思作進(jìn)一步的說明。
在本發(fā)明的步驟a中,待檢樣本可以是羊水、絨毛膜、外周血,甚至福爾馬林固定或石蠟包埋的組織,可以采用常規(guī)的酚-氯仿法或Chelex法提取樣本DNA。
上述21號(hào)染色體特異性STR位點(diǎn)的選擇極為關(guān)鍵。特定STR位點(diǎn)的選取是基于以下考慮1、選擇多態(tài)性好的STR位點(diǎn)。所謂多態(tài)性是指同一群體中一個(gè)基因座存在兩個(gè)或兩個(gè)以上等位基因的現(xiàn)象。一個(gè)基因座的多態(tài)性程度越高,應(yīng)用該基因座進(jìn)行進(jìn)行遺傳學(xué)分析的效能就越高。多數(shù)STR位點(diǎn)都具有高度的多態(tài)性,其多態(tài)性源于核心序列重復(fù)次數(shù)的個(gè)體差異。通常認(rèn)為復(fù)制滑脫是這種差異形成的機(jī)制。多態(tài)性好的STR位點(diǎn)會(huì)在正常群體的大部分個(gè)體中產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,即對(duì)每個(gè)多態(tài)性好的位點(diǎn)來說,大部分的正常個(gè)體都會(huì)是雜合子,因此PCR產(chǎn)物的熒光定量分析會(huì)表現(xiàn)為兩個(gè)熒光峰,相應(yīng)于該位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因。在染色體的非整倍體中,額外的染色體多來自母體。位點(diǎn)多態(tài)性越好,母體具有不同等位基因的可能性就越大。同時(shí),與父體等位基因不同的可能性也大,染色體的非整倍體在該位點(diǎn)表現(xiàn)為三個(gè)熒光峰的可能性也就越大。在群體遺傳學(xué)中常用雜合度對(duì)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行定量評(píng)估。因此,在建立檢測(cè)系統(tǒng)時(shí),應(yīng)選用雜合度大于0.6的STR位點(diǎn)。2、增加所選用的STR位點(diǎn)個(gè)數(shù)。對(duì)特定染色體三體的檢測(cè)系統(tǒng)來說,其效能不僅取決于STR位點(diǎn)的多態(tài)性,也與STR位點(diǎn)的數(shù)目有關(guān)。毫無疑問,當(dāng)分析的STR位點(diǎn)數(shù)目增多時(shí),系統(tǒng)的效能就會(huì)增加,因此在兩個(gè)以上的STR位點(diǎn)觀察到染色體的非整倍體具有三個(gè)不同等位基因的可能性就會(huì)增加,對(duì)非整倍體的確定也就更有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。根據(jù)我們的研究,至少應(yīng)選用6個(gè)以上的STR位點(diǎn)。3、選擇四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn),即位點(diǎn)的核心序列由4bp或5bp核苷酸構(gòu)成。這兩類微衛(wèi)星不僅具有高度的多態(tài)性,而且擴(kuò)增更忠實(shí),分型也更準(zhǔn)確。
基于上述原則,我們選擇了所述12個(gè)21號(hào)染色體特異性STR位點(diǎn),其中有2個(gè)五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn),10個(gè)四核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn),群體調(diào)查證實(shí)這些位點(diǎn)的雜合度在中國(guó)漢族群體中均大于0.6。由于目前的公共數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏21號(hào)染色體特異性的五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn),多態(tài)性好的、四核苷酸重復(fù)的21號(hào)染色體特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)也不多,因此我們開發(fā)了7個(gè)新的21號(hào)染色體特異性微衛(wèi)星位點(diǎn),其中包括2個(gè)五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn),5個(gè)四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn),分別命名為L(zhǎng)FG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34。
通常STR基因座的結(jié)構(gòu)分為兩部分,中間為重復(fù)區(qū),由核心序列串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成,重復(fù)次數(shù)的個(gè)體差異是多態(tài)性產(chǎn)生的基礎(chǔ);兩側(cè)為非重復(fù)性的側(cè)翼序列。若在側(cè)翼序列選擇一對(duì)特異性的寡核苷酸片段作為引物,可對(duì)相應(yīng)的STR位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)遷移距離的不同,即可檢測(cè)出重復(fù)區(qū)內(nèi)核心序列重復(fù)次數(shù)的差異。
對(duì)所述12個(gè)21號(hào)染色體特異性位點(diǎn)的擴(kuò)增,本發(fā)明可以采用現(xiàn)有的復(fù)合擴(kuò)增技術(shù),如本申請(qǐng)人在中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200310104034.7號(hào)中所提及的多色熒光復(fù)合擴(kuò)增方法的原理。熒光復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)所需檢材量少,結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高,自動(dòng)化程度高、可重復(fù)性強(qiáng)。用一種顏色的熒光素可標(biāo)記一組擴(kuò)增片段大小不同的STR位點(diǎn),多種熒光素則可以標(biāo)記多組不同的STR位點(diǎn)。這樣利用熒光素的不同顏色和擴(kuò)增片段的不同長(zhǎng)度,目前已經(jīng)可以同時(shí)檢測(cè)多達(dá)20個(gè)STR位點(diǎn)?;谝陨蠋讉€(gè)原因,熒光復(fù)合擴(kuò)增已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。同樣,若本發(fā)明中采用該熒光復(fù)合擴(kuò)增技術(shù),就可大幅度地簡(jiǎn)化操作程序,節(jié)省時(shí)間,達(dá)到用少量檢材對(duì)21號(hào)染色體的數(shù)目異常進(jìn)行快速檢測(cè)的目的。
在本發(fā)明中,所檢測(cè)的21號(hào)染色體特異性STR位點(diǎn)數(shù)達(dá)到了12個(gè),保證了檢測(cè)系統(tǒng)的效能,使檢測(cè)更有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義,這樣,如果采用特定的檢測(cè)判定方法,即僅僅在觀察到特定染色體上兩個(gè)以上的特異性STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰時(shí),才認(rèn)定21號(hào)染色體數(shù)目異常,這就可以使檢測(cè)結(jié)果的判定更加直觀而明確。另外,如果采用熒光復(fù)合擴(kuò)增方法,就能夠更為快速、高通量地對(duì)21號(hào)染色體數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說明,但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本實(shí)施例對(duì)21號(hào)染色體數(shù)目異常的檢測(cè)按以下步驟進(jìn)行a、采用酚-氯仿法從待檢樣本中提取DNA。本實(shí)施例中的樣本來自羊水的胎兒細(xì)胞。
b、采用熒光復(fù)合擴(kuò)增方式對(duì)樣本DNA中的上述12個(gè)21號(hào)染色體特異性STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增,即對(duì)STR位點(diǎn)LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位點(diǎn)D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)于7個(gè)新開發(fā)的STR位點(diǎn)LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34,我們自行設(shè)計(jì)了相應(yīng)的原始引物。
位點(diǎn)LFG20的原始引物為P15’-TGAGGTAGGTTCCTTAGCCC-3’P25’-AAGGCCTCCCCTATGTTATG-3’位點(diǎn)LFG21的原始引物為P15’-TTGGCGAATCATGACACTAA-3’P25’-GGGAAGCCTCAAGGAATAAC-3’位點(diǎn)LFG24的原始引物為P15’-AGGTTCTAGGAAACATGGCTG-3’P25’-TGCAAAACTGCTCTGGACTT-3’位點(diǎn)LFG26的原始引物P15’-TTAGAGTTGACAAACTCCATGTTG-3’P25’-TCTGAGCTAGTTGGGAGGATAG-3’位點(diǎn)LFG29的原始引物為P15’-TGGAAAATTTGCTTGAGAGG-3’P25’-TGAACCCAGGAGTCAGTTTG-3’位點(diǎn)LFG33的原始引物為P15’-CACCATACCCAGCCTTACTG-3’P25’-GCTCCCAAGCTACAGACCTA-3’位點(diǎn)LFG34的原始引物為P15’-CACAAGGCAGAATAAAGGGA-3’P25’-AGCATGTGTCCTGAATCTTTG-3’另外,5個(gè)現(xiàn)有STR位點(diǎn)及其原始引物可以通過互聯(lián)網(wǎng)上公開的人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得。網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的D21S1409基因座的原始引物為P15’-GGAGGGGAATACATTTGTG-3’P25’-TTGCCTCTGAATATCCCTAT-3’D21S1435基因座的原始引物P15’-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3’P25’-GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3’D21S1436基因座的原始引物P15’-AGGAAAGAGAAAGAAAGGAAGG-3’P25’-TATATGATGAAAGTATATTGGGGG-3’D21S2052基因座的原始引物P15’-GCACCCTTTATACTTGGGTG-3’P25’-TAGTACTCTACCATCCATCTATCCC-3’D21S2054基因座的原始引物P15’-GCAGTAAATGTCTATGAAACAAGG-3’P25’-ATGATAGGTAGATGGATCAATTAGA-3’對(duì)所述12個(gè)21號(hào)染色體特異性STR基因座采用本申請(qǐng)人在中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200310104034.7號(hào)中所涉及的多色熒光復(fù)合擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)原理。將上述12個(gè)STR位點(diǎn)分別在兩次復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。
位點(diǎn)LFG21、LFG24、LFG26、D21S1409、D21S2052和D21S2054在一次復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)涉及三對(duì)不同的短序列對(duì)。在公共序列SASA(5′--TGTTCTT-3′)的5’端加上3種成分及顏色各不相同的熒光標(biāo)記物F1、F2、F3,就可以得到3個(gè)熒光標(biāo)記序列SB1(5’--F1-TGTTCTT-3’)SB2(5’--F2-TGTTCTT-3’)SB3(5’--F3-TGTTCTT-3’)這3個(gè)熒光標(biāo)記序列分別與上述公共序列SA相配合,即構(gòu)成短序列對(duì)“SA、SB1”、短序列對(duì)“SA、SB2”和短序列對(duì)“SA、SB3”。
位點(diǎn)LFG24、D21S2054為一組,標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短序列對(duì)為SA(5’--GTTCTT-3’)SB1(5’--F1-GTTCTT-3’),在SB1中,熒光物質(zhì)F1為市售的藍(lán)色熒光標(biāo)記物FAM。
在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的原始引物P1、P2的5’端分別加上這對(duì)短序列對(duì)后,即構(gòu)成位點(diǎn)LFG24、D21S2054的長(zhǎng)序列引物。
LFG24基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-AGGTTCTAGGAAACATGGCTG-3′SB1-P25′-F1-GTTCTT-TGCAAAACTGCTCTGGACT-3′,D21S2054基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-GCAGTAAATGTCTATGAAACAAGG-3′SB1-P25′-F1-GTTCTT-ATGATAGGTAGATGGATCAATTAGA-3′,位點(diǎn)LFG26、D21S1409為一組,標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短序列對(duì)為SA(5’--GTTCTT-3’)SB2(5’--F2-GTTCTT-3’),在SB2中,熒光物質(zhì)F2為市售的現(xiàn)有黃色熒光標(biāo)記物NED。
在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的原始引物P1、P2的5’端分別加上這對(duì)短序列對(duì)后,即構(gòu)成位點(diǎn)LFG26、D21S1409的長(zhǎng)序列引物。
LFG26基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-TTAGAGTTGACAAACTCCATGTTG-3′SB2-P25′-F2-GTTCTT-TCTGAGCTAGTTGGGAGGATAG-3′,D21S1409基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-GGAGGGGAATACATTTGTG-3′SB2-P25′-F2-GTTCTT-TTGCCTCTGAATATCCCTAT-3′,位點(diǎn)LFG21、D21S2052為一組,標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短序列對(duì)為SA(5’--GTTCTT-3’)
SB3(5’-F3-GTTCTT-3’),在SB3中,熒光物質(zhì)F3為市售的現(xiàn)有綠色熒光標(biāo)記物JOE。
在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的原始引物P1、P2的5’端分別加上這對(duì)短序列對(duì)后,即構(gòu)成位點(diǎn)LFG21、D21S2052的長(zhǎng)序列引物。
LFG21基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-TTGGCGAATCATGACACTAA-3′SB3-P25′-F3-GTTCTT-GGGAAGCCTCAAGGAATAAC-3′,D21S2052基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-GCACCCTTTATACTTGGGTG-3′SB3-P25′-F3-GTTCTT-TAGTACTCTACCATCCATCTATCCC-3′;復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)在PE-9600擴(kuò)增儀中進(jìn)行,反應(yīng)體系中各成分的用量如下DDH2O12.4μLdNTP 7.5μl10Xbuffer 3.75μL、6對(duì)長(zhǎng)序列引物 各0.3μlTaq酶 1μl(3u)BSA 3.75μLMgCl2 3μlDNA模板 2.5μL(約3ng)總體積37.5μL復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)采用熱啟動(dòng)技術(shù),共循環(huán)28輪,循環(huán)參數(shù)如下預(yù)變性94℃ 3分鐘變性 94℃ 50秒復(fù)性 54℃ 50秒延伸 72℃ 30秒 4個(gè)循環(huán)變性 94℃ 50秒復(fù)性 54℃ 30秒延伸 72℃ 30秒 24個(gè)循環(huán)延伸 72℃ 10分鐘位點(diǎn)LFG20、LFG29、LFG33、LFG34 D21S1435和D21S1436在另一次復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增,同樣涉及這三對(duì)不同的短序列對(duì)。
位點(diǎn)LFG20、D21S1436為一組,標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短序列對(duì)為SA(5’--GTTCTT-3’)SB1(5’--F1-GTTCTT-3’),在SB1中,熒光物質(zhì)F1為市售的藍(lán)色熒光標(biāo)記物FAM。
在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的原始引物P1、P2的5’端分別加上這對(duì)短序列對(duì)后,即構(gòu)成位點(diǎn)LFG20、D21S1436的長(zhǎng)序列引物。
LFG20基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-TGAGGTAGGTTCCTTAGCCC-3′SB1-P25′-F1-GTTCTT-AAGGCCTCCCCTATGTTATG-3′,D21S1436基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-AGGAAAGAGAAAGAAAGGAAGG-3′SB1-P25′-F1-GTTCTT-TATATGATGAAAGTATATTGGGGG-3′,位點(diǎn)LFG29、LFG33為一組,標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短序列對(duì)為SA(5’--GTTCTT 3’)SB2(5’--F2-GTTCTT-3’),在SB2中,熒光物質(zhì)F2為市售的現(xiàn)有黃色熒光標(biāo)記物NED。
在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的原始引物P1、P2的5’端分別加上這對(duì)短序列對(duì)后,即構(gòu)成位點(diǎn)LFG29、LFG33的長(zhǎng)序列引物。
LFG29基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-TGGAAAATTTGCTTGAGAGG-3′SB2-P25′-F2-GTTCTT-TGAACCCAGGAGTCAGTTTG-3′,LFG33基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-CACCATACCCAGCCTTACTG-3′SB2-P25′-F2-GTTCTT-GCTCCCAAGCTACAGACCTA-3′,位點(diǎn)LFG34、D21S1435為一組,標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短序列對(duì)為SA(5’--GTTCTT-3’)SB3(5’--F3-GTTCTT-3’),在SB3中,熒光物質(zhì)F3為市售的現(xiàn)有綠色熒光標(biāo)記物JOE。
在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的原始引物P1、P2的5’端分別加上這對(duì)短序列對(duì)后,即構(gòu)成位點(diǎn)LFG34、D21S1435的長(zhǎng)序列引物。
LFG34基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-CACAAGGCAGAATAAAGGGA-3′SB3-P25′-F3-GTTCTT-AGCATGTGTCCTGAATCTTTG-3′,D21S1435基因座的長(zhǎng)序列引物SA-P15′-GTTCTT-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3′SB3-P25′-F 3-GTTCTT-GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3′;本次復(fù)合擴(kuò)增的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件與前次相類似,故從略。
c、根據(jù)等位基因相應(yīng)熒光峰的數(shù)目確定樣本中21號(hào)染色體的數(shù)目。在本實(shí)施例中,當(dāng)觀察到兩個(gè)以上的21號(hào)染色體特異性STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰時(shí),認(rèn)定該樣本的21號(hào)染色體為三體性。具體操作時(shí),利用ABI310遺傳分析儀(PE,美國(guó))對(duì)上述復(fù)合擴(kuò)增過程所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。用PCR產(chǎn)物0.4μl與分型標(biāo)準(zhǔn)物GS500 ROX size standard 0.2μl、變性劑Hi-DiTMformamide3μl混勻編號(hào),放入自動(dòng)進(jìn)樣盤。電進(jìn)樣15000V、5s.電泳15000V,24分鐘。用Date Collection軟件收集數(shù)據(jù),Genescan3.7軟件分析數(shù)據(jù),用修改過的AmpFISTR PLUS kit Kazam macro文件在Genetype3.7軟件自動(dòng)分型。等位基因的辨認(rèn)通過與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物比較來確認(rèn),窗口范圍+/-0.5bp。
權(quán)利要求
1.一種21號(hào)染色體數(shù)目的快速檢測(cè)方法,其特征是按以下步驟進(jìn)行a、從待檢樣本中提取樣本DNA;b、對(duì)樣本DNA中的21號(hào)染色體特異性STR位點(diǎn)LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位點(diǎn)D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中序列ATTTATGAGGTAGGTTCCTTAGCCCCATTTCACAGGCTGAGAACCTGAGACTGTCAACACTAAGCTGATTTTACTGTGATTACATCTTAGTGAGTGACAGATCTAGCAATCATGGAATTGAGAAGGCCCCACCTATGTTATGTTATAA(CATAA)n(CATAG)mCATGGCAACATAACATAACACAGGGGGCCTTCTCAATTATTTATAACATAACATAGGGGAGGCCTTATAAT為L(zhǎng)FG20位點(diǎn),該位點(diǎn)為一五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(CATAAxCATAG),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m表示;序列ATTGGCGAATCATGACACTAATTTTGGCCAGCATTTAC(GAATA)nGAATGGATCAGAGTAATATTAAAGAGTATCTAGATATTCATCCACATTATAAAGTTTTAGTTCAGGCCTCTTTTTCTTCTCCATCAAGTTATTCCTTGAGGCTTCCCTGAACTTTTTATTTTATGCCTTTCT,為L(zhǎng)FG21位點(diǎn),該位點(diǎn)為一五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(GAATA),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n表示;序列TTAAAAGTTACAGGTTCTAGGAAACATGGCTGGTGAATACAATAATAATTTATTAATTTTAATGTCAGCTTCAAATTTTTGGTTCTTTGGAAAATTGTTTAGGCCCCCAAATATATAGGTC(TATG)n(CATG)mTATG(CATG)k(TATG)p(TATC)qTATAGCTGCATTGATGCTGTAAGT,為L(zhǎng)FG24位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(TATGxCATGxTATC),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m,k,p,q表示;序列ACCACTTTAGAGTTGACAAACTCCATGTTGGAACAGAGTATTCTTAAACAGAACCCTTAAAACCATATTTTTCACCTCTCTGTTTT(TATC)nTATTGAGACAGGGTCTTGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTCGTGTGATCACGGTTCTCTGCAGCCTCGATCTCCTGGGCTCTAGCTATCCTCCCAACTAGCTCAGATTACA,為L(zhǎng)FG26位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(TATC),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n表示;序列ACTTTCTGGTTTGGAAAATTTGCTTGAGAGGTAAAAAGAAAATTT(ACTT)n(ATTT)mAGTAGAGACAGAATCTCGCTCTGTTGCTCAGGCTGGAGTGCAGTAGCACGATCCTGGCTCACTGCAAACTGACTCCTGGGTTCAGGTG,為L(zhǎng)FG29位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(ACTTxATTT),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m表示;序列CAGGTGTGAGCCACCATACCCAGCCTTACTGTATC(ATAG)nATG(ATAG)mAATATAGTTGCCTACAATATTCAGCACAGTAACAGCTATATAGGTCTGTAGCTTGGGAGCAATAGGC,為L(zhǎng)FG33位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(ATAG),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m表示;序列CTATTTGGTACACAAGGCAGAATAAAGGGATTATTGCTTGA(TAGG)n(TAGA)mAGA(TAGA)kTGAGACAAGACAAGACAGACTATGAATAAATTAATCATACTGCTG;為L(zhǎng)FG34位點(diǎn),該位點(diǎn)為一四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星,核心序列為(TAGGxTAGA),核心序列的不同重復(fù)次數(shù)以n,m,k表示;c、根據(jù)對(duì)上述位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果確定樣本中21號(hào)染色體的數(shù)目。
全文摘要
一種21號(hào)染色體數(shù)目的快速檢測(cè)方法,其特征是按以下步驟進(jìn)行a.從待檢樣本中提取樣本DNA;b.對(duì)樣本DNA中的21號(hào)染色體上特異性STR位點(diǎn)LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位點(diǎn)D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054進(jìn)行PCR擴(kuò)增;c.根據(jù)對(duì)上述位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果確定樣本中21號(hào)染色體的數(shù)目。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1560278SQ20041002182
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月16日
發(fā)明者侯一平, 張, 顏靜, 吳謹(jǐn), 石美森, 鄧建強(qiáng) 申請(qǐng)人:四川大學(xué)
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