水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述的6號染色體上與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記位于RM439與RM103之間，用分子標(biāo)記RM439引物或者用分子標(biāo)記RM103引物擴(kuò)增水稻稻飛虱耐害性鑒定材料，若分別能夠擴(kuò)增出248bp和340bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在稻飛虱耐害性位點(diǎn)Qsbph6b。采用本發(fā)明的分子標(biāo)記及其引物來檢測水稻育種材料的稻飛虱耐害性水平，能極大地提高水稻的稻飛虱耐害性檢測速度，提高水稻的產(chǎn)量和育種效率。
【專利說明】
水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻(Oryzasativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，產(chǎn)量與播種面積均居世界首位。水稻是世界上約一半人口的主糧，世界上約有7.5億貧民以稻米為生，而且每年還會增加大約5000萬人口的稻米消費(fèi)者。不僅如此，在亞洲，稻作、稻米還是生活方式、文化傳統(tǒng)、風(fēng)俗習(xí)慣、精神信仰等方面一種不可或缺的存在。所以，水稻生產(chǎn)的安全世界矚目，水稻病蟲害是制約水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素，而稻飛虱則是幾十年來水稻生產(chǎn)中日益嚴(yán)重的巨大威脅。
[0003]稻飛虱(Rice planthopper)屬同翅目飛虱科，俗名火蠓蟲、白蚊、稻虱、稻浮塵子、火蜢子、厭蟲、蚰蟲、秧猛猛等，是亞洲各國水稻生產(chǎn)上最重要的害蟲之一，給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損害。目前，為害水稻的飛虱主要有褐飛虱(Nilaparvata lugens)、灰飛虱(Laodelphax striatellus)和白背飛虱(Sogatella furcifera)三種。稻飛虱廣泛分布于南亞、東南亞、太平洋島嶼及日本、朝鮮和澳大利亞等地區(qū)，在中國各稻區(qū)均有分布。稻飛虱有遠(yuǎn)距離迀飛習(xí)性，在我國，稻飛虱為害經(jīng)歷了從局部稻區(qū)到整個(gè)稻區(qū)的演變過程。為害較重的是褐飛虱和白背飛虱，早稻前期以白背飛虱為主，后期以褐飛虱為主；中晚稻以褐飛虱為主;灰飛虱很少直接成災(zāi)，但能傳播稻、麥、玉米等作物的病毒。由于稻飛虱體型小、迀飛繁殖力強(qiáng)、棲息蔭蔽等特性，如遇田間適宜生境，易造成突發(fā)和爆發(fā)，猖獗發(fā)生時(shí)，每叢水稻上的蟲口達(dá)3000余頭，是目前影響我國水稻穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要蟲害之一。
[0004]稻飛虱長翅型成蟲均能長距離迀飛，趨光性強(qiáng)，且喜趨嫩綠。但灰飛虱的趨光性稍弱，成蟲和若蟲均群集在稻叢下部莖桿上刺吸汁液，遇驚擾即跳落水面或逃離。卵多產(chǎn)在稻叢下部葉鞘內(nèi)，抽穗后或產(chǎn)卵于穗頸部內(nèi)。褐飛虱取食時(shí)，口針伸至葉鞘韌皮部，先由唾腺分泌物沿口針凝成“ 口針鞘”抽吸汁液。植株嫩綠、蔭蔽且積水的稻田蟲口密度大。一般是先在田中央密集為害，后逐漸擴(kuò)大蔓延。水稻孕穗至開花期的植株中水溶性蛋白含量增高，有利短翅型的發(fā)生。此型雌蟲產(chǎn)卵量大，雌性比高，壽命長，常使褐飛虱蟲口激增。在乳熟期后，長翅型比例上升，易引起迀飛。稻飛虱對水稻的為害，除直接刺吸汁液，使生長受阻，嚴(yán)重時(shí)稻叢成團(tuán)枯萎，甚至全田死桿倒伏外，產(chǎn)卵也會刺傷植株，破壞輸導(dǎo)組織，妨礙營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸并傳播病毒病。
[0005]目前防治稻飛虱主要措施是農(nóng)業(yè)防治，以使用化學(xué)藥劑為主，導(dǎo)致稻飛虱對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，從而使這種單一的防治措施面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，此外，稻飛虱的迀飛特性及其傳毒的瞬時(shí)性和持久性，致使防蟲治病的效果不佳。生產(chǎn)上通常采用加大化學(xué)藥劑的施用量來防蟲治蟲，導(dǎo)致稻飛虱天敵殺傷嚴(yán)重，嚴(yán)重傷害了田間生態(tài)平衡，從而使這種單一的防治措施面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。利用品種自身的抗性一直被認(rèn)為是防控稻飛虱危害最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。目前生產(chǎn)上推廣種植的粳稻品種大多感蟲，因此，挖掘抗稻稻飛虱種質(zhì)資源，選育高抗稻飛虱新品種，既能有效防止稻飛虱直接取食為害，也可以控制目前大爆發(fā)的條紋葉枯病、黑條矮縮病等病害，具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對常規(guī)水稻育種中稻飛虱耐害性鑒定穩(wěn)定性、重復(fù)性較差及費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，提供了水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，該分子標(biāo)記及其引物可以預(yù)測水稻植株對耐害性的耐害性，簡化了選擇方法，進(jìn)而加快了水稻稻飛虱耐害性品種的育種進(jìn)程。
[0007]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于:用分子標(biāo)記RM439引物或者用分子標(biāo)記RM103引物擴(kuò)增水稻稻飛虱耐害性鑒定材料，如果用分子標(biāo)記RM439引物能夠擴(kuò)增出248bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM103引物能夠擴(kuò)增出340bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在稻飛虱耐害性位點(diǎn)Qsbph6b。
[0008]所述的與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記的定位方法包含以下步驟:
(1)以水稻灰飛虱高感品種武育粳3號為母本，灰飛虱高耐害性品種冷水紅為父本，配制雜種Fl，構(gòu)建了包含214個(gè)單株的F2分離群體，通過F2單株自交獲得214個(gè)F2:3家系；
(2)對F2:3家系采用水稻灰飛虱耐害性鑒定，獲得各家系的耐害性測驗(yàn)值；
(3)采用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA;
(4 )用實(shí)驗(yàn)室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的821對SSR引物(含128對自行合成引物)，對親本、Fl及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增尋找兩兩之間同時(shí)具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，用篩選到的204對多態(tài)性分子標(biāo)記檢測F2:3家系；
(5)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/Exp3.0軟件進(jìn)行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM);
(6)米用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測水稻灰飛虱的耐害性QTL，LOD值的閾值定為2.5，在5%的總體顯著水平下檢測QTL，檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置；
(7)獲得水稻灰飛虱高耐害性品種冷水紅耐害性位點(diǎn)Qsbph6b，位于第6號染色體分子標(biāo)記RM439引物與分子標(biāo)記RM103引物之間，通過檢測第6號染色體上該兩個(gè)引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測該植株對稻飛虱的耐害性，大大提高稻飛虱耐害性水稻的選擇效率。
[0009]所述的水稻灰飛虱耐害性鑒定的具體方案為:利用苗期集團(tuán)篩選法對F2:3家系的214個(gè)株系進(jìn)行了灰飛虱抗性鑒定，為確保各家系(品種)生長一致，所有供試材料分別浸種催芽;每個(gè)家系(品種)分別播種于一個(gè)直徑8.0 cm、高9.0 cm、盛滿營養(yǎng)土的圓形塑料缽中(缽底部有一小孔，便于滲透吸水)，每28缽置于65 cmX44 cmX14 cm的塑料箱內(nèi)(箱內(nèi)保持水層2 cm左右)，外加親本和感蟲對照各兩缽;每缽播種25粒發(fā)芽種子，接蟲前4天鑒苗，淘汰病弱苗，每缽保留15棵苗用于接蟲;每個(gè)材料兩缽，環(huán)境溫度保持在26±2°C，自然光照，通風(fēng);待苗長到1.5-2.0葉時(shí)，按15頭/苗的比例接入2-3齡灰飛虱若蟲；當(dāng)感蟲親本武育粳3號死苗率達(dá)70%時(shí)，調(diào)查親本和各家系的單株死亡率，以存活率作為抗蟲指標(biāo)。
[0010]所述的用CTAB微量法提取親本、Fl及F2: 3定位群體單株的DNA的具體流程為:取
0.3-0.5g新鮮的水稻葉片，于液氮中研成粉;將凍粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即加入500yLDNA提取緩沖液，置65°C溫浴20min ；加入700yL氯仿/異丙醇，輕緩顛倒離心管混勻，12000r/min離心1min;轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入600yL異丙醇，12000r/min離心5min;棄上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min離心5min;棄70%乙醇，風(fēng)干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存。
[0011 ]所述的對親本、Fl及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為:總體積為1yL，1mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ 引物，0.5U Taq 酶和20ng DNA模板;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min;94°C變性lmin，55°C退火復(fù)性lmin，72°C延伸1.5min，共35個(gè)循環(huán);最后72°C保溫1min;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測。
[0012]所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體方法為:100ml8%凝膠工作液配方為:ddH2070ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 10ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是將108g Tris堿和55g硼酸先溶解于蒸饋水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddifeO定容到100ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是將38g丙烯酰胺和2g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，過濾后4°C保存。
[0013]所述的擴(kuò)增稻飛虱耐害性位點(diǎn)Qsbph6b的分子標(biāo)記引物選自分子標(biāo)記RM439引物和分子標(biāo)記RMl 03引物。
[0014]所述的分子標(biāo)記引物在水稻育種快速篩選稻飛虱耐害性水稻品種或品系中的應(yīng)用。
[0015]所述的RM439引物的上游引物序列為:5 ’ -TCATAACAGTCCACTCCCCC-3 ’，下游引物序列為:5 ’-TGGTACTCCATCATCCCATG-3 ’ ；所述的RM103引物的上游引物序列為:5 ’-CTTCCAATTCAGGCCGGCTGGC-3，，下游引物序列為:5 ’-CGCCACAGCTGACCATGCATGC-3 ’。
[0016]本發(fā)明所提供的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，具有稻飛虱耐害性位點(diǎn)位置明確、鑒定方便等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明通過檢測6號染色體上與水稻稻飛虱耐害性QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測水稻植株的稻飛虱耐害性水平，大大提高了稻飛虱耐害性水稻的選擇效率，加快了育種進(jìn)程。
【附圖說明】
[0017]圖1所示Qsbph6b在染色體上的位置。
[0018]圖2應(yīng)用Qsbph6b緊密連鎖的SSR標(biāo)記預(yù)測水稻植株稻飛虱耐害性的電泳圖譜。M:Mark; 1:武育粳3號；2:冷水紅;3:Fl; 4_13:感稻飛虱水稻單株；14-23:稻飛虱耐害性水稻單株。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施案例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而非限制本發(fā)明，實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)技術(shù)方法。
[0020]一、耐害性水稻的篩選與武育粳3號/冷水紅F2群體構(gòu)建:
多年的大田育種材料鑒定觀察水稻品種冷水紅對稻飛虱有較好的耐害性。冷水紅，原產(chǎn)于河北省豐南縣，是一種極為珍貴的優(yōu)質(zhì)米，被專家認(rèn)定為是康熙皇帝“御田胭脂米”，當(dāng)?shù)厝朔Q它為“三伸腰”，又叫“黑谷子”。為準(zhǔn)確鑒定冷水紅對稻飛虱的耐害性水平，2012年正季于灰飛虱爆發(fā)時(shí)期從大田采集灰飛虱進(jìn)行耐害性實(shí)驗(yàn)。耐害性實(shí)驗(yàn)方法如下:利用苗期集團(tuán)篩選法對F2:3家系的214個(gè)株系進(jìn)行了灰飛虱抗性鑒定，為確保各家系(品種)生長一致，所有供試材料分別浸種催芽;每個(gè)家系(品種)分別播種于一個(gè)直徑8.0 cm、高9.0 cm、盛滿營養(yǎng)土的圓形塑料缽中(缽底部有一小孔，便于滲透吸水)，每28缽置于65 cmX44 cmX 14 cm的塑料箱內(nèi)(箱內(nèi)保持水層2 cm左右)，外加親本和感蟲對照各兩缽;每缽播種25粒發(fā)芽種子，接蟲前4天鑒苗，淘汰病弱苗，每缽保留15棵苗用于接蟲;每個(gè)材料兩缽，環(huán)境溫度保持在26± 2°C，自然光照，通風(fēng);待苗長到1.5-2.0葉時(shí)，按15頭/苗的比例接入2_3齡灰飛虱若蟲；當(dāng)感蟲親本武育粳3號死苗率達(dá)70%時(shí)，調(diào)查親本和各家系的單株死亡率，以存活率作為抗蟲指標(biāo)。冷水紅和感蟲水稻品種武育粳3號的耐害性測驗(yàn)值均值分別為72.6%與28.2%，表明冷水紅對灰飛虱具有極佳的耐害性。2012年以水稻灰飛虱高感品種武育粳3號為母本，灰飛虱高耐害性品種冷水紅為父本，配制雜種Fl，構(gòu)建了包含214個(gè)單株的F2分離群體，2013年秋季通過F2單株自交獲得214個(gè)F2:3家系。
[0021]二、對F2:3家系采用水稻灰飛虱耐害性鑒定，獲得各家系的耐害性測驗(yàn)值；
2014年，采用同步驟一的耐害性方法檢測F2:3家系對灰飛虱的耐害性，獲得各家系的耐害性測驗(yàn)值。
[0022]三、SSR標(biāo)記分析:
(I)采用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA;
(2 )用實(shí)驗(yàn)室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的821對SSR引物(含128對自行合成引物)，對親本、Fl及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增尋找兩兩之間同時(shí)具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，用篩選到的204對多態(tài)性分子標(biāo)記檢測F2:3家系；
(3)CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA的具體流程為:取0.3-0.5g新鮮的水稻葉片，于液氮中研成粉;將凍粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即加入500yL DNA提取緩沖液，置65°C溫浴20min;加入700yL氯仿/異丙醇，輕緩顛倒離心管混勻，12000r/min離心1min；轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入600yL異丙醇，12000r/min離心5min；棄上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min離心5min ；棄70%乙醇，風(fēng)干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存；
(4)對親本、FI及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為:總體積為10μL，1mMTris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μΜ dNTPs，0.2μΜ引物，0.5U Taq 酶和 20ngDNA模板;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5min ； 94 °C變性Imin，55 V退火復(fù)性Imin，72 °C延伸1.5min，共35個(gè)循環(huán);最后72°C保溫1min;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測；
(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體方法為:10ml8%凝膠工作液配方為:ddH20 70ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19:1 )20ml，TEMED 10ul ,10% AP 100ul;其中，10*TBE是將 108gTris堿和55g硼酸先溶解于蒸餾水，加40ml 0.5mol/L EDTA(PH為8.0)，再加ddH20定容到1000ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是將38g丙烯酰胺和2g N，，N亞甲雙丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，過濾后4°C保存。
[0023]四、水稻灰飛虱耐害性QTL定位:
(I)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/Exp3.0軟件進(jìn)行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM);
(2)米用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測水稻灰飛虱的耐害性QTL，LOD值的閾值定為2.5，在5%的總體顯著水平下檢測QTL，檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置；
(3)在6號染色體上檢測到I個(gè)水稻灰飛虱耐害性QTL，L0D值為3.75，貢獻(xiàn)率為32.1%，命名為Qsbph6b，位于第6號染色體分子標(biāo)記RM439弓I物與分子標(biāo)記RMl 03引物之間。
[0024]五、Qsbph6b進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)對白背飛虱和褐飛虱亦具有耐害性:
2015年，將武育粳3號/冷水紅F2:3家系分別進(jìn)行白背飛虱和褐飛虱耐害性檢驗(yàn)，白背飛虱和褐飛虱耐害性檢驗(yàn)方法采用苗期集團(tuán)篩選法，發(fā)現(xiàn)Qsbph6b同時(shí)對白背飛虱和褐飛虱具有耐害性，Qsbph6b對白背飛虱耐害性檢測LOD值為3.02，貢獻(xiàn)率為22.3%，對褐飛虱耐害性檢測LOD值為2.77，貢獻(xiàn)率為18.3%。
[0025]六、通過檢測第6號染色體上該兩個(gè)引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，預(yù)測植株對稻飛虱耐害性水平:
用分子標(biāo)記RM439引物或者用分子標(biāo)記RM103引物擴(kuò)增水稻稻飛虱抗性鑒定材料，如果用分子標(biāo)記RM439引物能夠擴(kuò)增出248bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM103引物能夠擴(kuò)增出340bp的擴(kuò)增片段(如圖2)，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在稻飛虱耐害性位點(diǎn)Qsbph6b，通過檢測Qsbph6b的存在可以預(yù)測該植株對水稻稻飛虱的耐害性水平，大大提高稻飛虱耐害性水稻的選擇效率。
[0026]上述實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于:用分子標(biāo)記RM439引物或者用分子標(biāo)記RM103引物擴(kuò)增水稻稻飛虱耐害性鑒定材料，如果用分子標(biāo)記RM439引物能夠擴(kuò)增出248bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM103引物能夠擴(kuò)增出340bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在稻飛虱耐害性位點(diǎn)Qsbph6b。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記的定位方法包含以下步驟: (1)以水稻灰飛虱高感品種武育粳3號為母本，灰飛虱高耐害性品種冷水紅為父本，配制雜種Fl，構(gòu)建了包含214個(gè)單株的F2分離群體，通過F2單株自交獲得214個(gè)F2:3家系； (2)對F2:3家系采用水稻灰飛虱耐害性鑒定，獲得各家系的耐害性測驗(yàn)值； (3)采用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA; (4)用實(shí)驗(yàn)室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的821對SSR引物(含128對自行合成引物)，對親本、Fl及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增尋找兩兩之間同時(shí)具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，用篩選到的204對多態(tài)性分子標(biāo)記檢測F2:3家系； (5)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/Exp3.0軟件進(jìn)行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM); (6)米用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測水稻灰飛虱的耐害性QTL，LOD值的閾值定為2.5，在5%的總體顯著水平下檢測QTL，檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置； (7)獲得水稻灰飛虱高耐害性品種冷水紅耐害性位點(diǎn)Qsbph6b，位于第6號染色體分子標(biāo)記RM439引物與分子標(biāo)記RM103引物之間，通過檢測第6號染色體上該兩個(gè)引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測該植株對稻飛虱的耐害性，大大提高稻飛虱耐害性水稻的選擇效率。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的水稻灰飛虱耐害性鑒定的具體方案為:利用苗期集團(tuán)篩選法對F2:3家系的214個(gè)株系進(jìn)行了灰飛虱抗性鑒定，為確保各家系(品種)生長一致，所有供試材料分別浸種催芽;每個(gè)家系(品種)分別播種于一個(gè)直徑8.0 cm、高9.0 cm、盛滿營養(yǎng)土的圓形塑料缽中(缽底部有一小孔，便于滲透吸水)，每28缽置于65 cm X 44 cm X 14 cm的塑料箱內(nèi)(箱內(nèi)保持水層2 cm左右)，外加親本和感蟲對照各兩缽;每缽播種25粒發(fā)芽種子，接蟲前4天鑒苗，淘汰病弱苗，每缽保留15棵苗用于接蟲;每個(gè)材料兩缽，環(huán)境溫度保持在26 ± 2°C，自然光照，通風(fēng);待苗長到1.5-2.0葉時(shí)，按15頭/苗的比例接入2-3齡灰飛虱若蟲；當(dāng)感蟲親本武育粳3號死苗率達(dá)70%時(shí)，調(diào)查親本和各家系的單株死亡率，以存活率作為抗蟲指標(biāo)。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA的具體流程為:取0.3-0.5g新鮮的水稻葉片，于液氮中研成粉;將凍粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即加入500yL DNA提取緩沖液，置65°C溫浴20min;加入700yL氯仿/異丙醇，輕緩顛倒離心管混勻，12000r/min離心10min；轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入600yL異丙醇，12000r/min離心5min ；棄上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min離心5min；棄上清液，加入600ul的70%乙醇，12000r/min離心5min；棄70%乙醇，風(fēng)干；加0.2mLTE，溶解后4 °C保存。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的對親本、Fl及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為:總體積為 10yL，10mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ引物，0.5UTaq酶和20ng DNA模板；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min; 94°C變性Imin，55 °C退火復(fù)性lmin，72°C延伸1.5min，共35個(gè)循環(huán);最后72°C保溫1min;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體方法為:100ml 8%凝膠工作液配方為:CldH2O 70ml，10*TBE 1ml，40% 丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 100ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是將108g Tris堿和55g硼酸先溶解于蒸餾水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddH20定容到1000ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是將38g丙烯酰胺和2g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至10ml，過濾后4°C保存。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的擴(kuò)增稻飛虱耐害性位點(diǎn)Qsbph6b的分子標(biāo)記引物選自分子標(biāo)記RM439引物和分子標(biāo)記RMl 03引物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的分子標(biāo)記引物在水稻育種快速篩選稻飛虱耐害性水稻品種或品系中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求1、2和7所述的水稻6號染色體上一個(gè)與稻飛虱耐害性相關(guān)的分子標(biāo)記及其引物，其特征在于所述的RM439引物的上游引物序列為:5 ’ -TCATAACAGTCCACTCCCCC-.3 ’，下游引物序列為:5 ’-TGGTACTCCATCATCCCATG-3 ’ ；所述的RM103引物的上游引物序列為:.5 ’-CTTCCAATTCAGGCCGGCTGGC-3，，下游引物序列為:5 ’-CGCCACAGCTGACCATGCATGC-3 ’。
【文檔編號】C12N15/11GK105861723SQ201610385069
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】陳丁龍