一種用于抑郁癥診斷的circRNA標(biāo)志物、試劑盒及基因芯片的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于抑郁癥診斷和療效評(píng)估的circRNA標(biāo)志物及試劑盒。本發(fā)明提供了一種用于抑郁癥診斷的circRNA標(biāo)志物，包括hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953四種circRNA的組合，上述四種circRNA的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示；還提供了用于上述四種circRNA的探針，探針序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示。本發(fā)明還提供了于一種評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的circRNA標(biāo)志物。本發(fā)明的有益效果在于首次提供了抑郁癥生物標(biāo)記物和評(píng)估抗精神病藥物療效的circRNA生物標(biāo)記物。經(jīng)臨床驗(yàn)證之后，具有較高的特異性和敏感值，有較高的診斷參考價(jià)值，circRNA作為抑郁癥特異性生物標(biāo)記物將帶來(lái)抑郁癥診斷及治療的革命性改變。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種用于抑郁癥診斷的C i rcRNA標(biāo)志物、試劑盒及基因巧片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種用于抑郁癥診斷的CircRNA標(biāo)志物、試劑盒及 基因忍片。
【背景技術(shù)】
[0002] 抑郁癥的核屯、癥狀是情緒低落、興趣減退、精力缺失，在全球范圍內(nèi)有超過(guò)3.5億 人患有抑郁癥。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年，抑郁癥將占據(jù)世界疾病負(fù)擔(dān)的第二位。重癥 抑郁障礙是一種常見(jiàn)的精神疾病，其終生患病率約為2%~14%。重癥抑郁障礙者自殺占所 有自殺的1/3-1/2,其共病屯、血管疾病、屯、肌梗塞的機(jī)會(huì)明顯高于正常人，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的 屯、身健康。不僅嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，還會(huì)對(duì)其社會(huì)、職業(yè)功能造成明顯影響，使社會(huì)背 負(fù)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至可成為社會(huì)不安定因素。其原因有發(fā)病率高、發(fā)病年輕化、呈慢性 發(fā)展、損害社會(huì)功能和認(rèn)知能力。因此，研究抑郁癥發(fā)病機(jī)理及可W體現(xiàn)其嚴(yán)重程度的生物 標(biāo)志物，并及時(shí)針對(duì)病因進(jìn)行干預(yù)與治療是治療疾病、減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵因素。
[0003] 關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及治療原理目前尚不明確，既往認(rèn)為遺傳因素、生物學(xué)因 素、屯、理社會(huì)因素對(duì)抑郁癥的發(fā)生有一定的影響，后來(lái)學(xué)術(shù)界開(kāi)展了神經(jīng)生化、神經(jīng)內(nèi)分 泌、神經(jīng)可塑性、神經(jīng)電生理W及神經(jīng)影像學(xué)等多方面研究，提出了多種病因假說(shuō)、可能有 關(guān)的內(nèi)分泌軸、腦結(jié)構(gòu)及功能的異常、神經(jīng)環(huán)路W及信號(hào)通路的變化等;抑郁癥可能是由突 觸可塑性受損致使大腦不能恰當(dāng)?shù)剡m應(yīng)環(huán)境導(dǎo)致，有證據(jù)顯示抑郁癥與學(xué)習(xí)和記憶功能受 損相關(guān)，運(yùn)些研究提示抑郁癥存在大腦功能和神經(jīng)元突觸可塑性改變的證據(jù)，但導(dǎo)致抑郁 癥的確切分子和細(xì)胞機(jī)制尚不清楚。但目前仍然無(wú)單一的理論即可完全解釋抑郁癥的發(fā)病 原因?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)認(rèn)為很多社會(huì)環(huán)境或自身經(jīng)歷等因素可引起基因表達(dá)的變化，可導(dǎo) 致某些特定的基因發(fā)生表觀(guān)遺傳改變，運(yùn)些變化可引起神經(jīng)元的可塑性和功能異常，而運(yùn) 些異常表現(xiàn)可W被遺傳下來(lái)，即表觀(guān)遺傳機(jī)制，基于基因水平的MDD發(fā)病機(jī)理及生物標(biāo)志物 的研究逐步引起學(xué)者們的關(guān)注。
[0004] 環(huán)狀RNA(CircRNA)是區(qū)別于傳統(tǒng)線(xiàn)性RNA的一類(lèi)新型RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大 量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。大部分的環(huán)狀RNA是由外顯子序列構(gòu)成，在不同的物種中具有保守 性，同時(shí)存在組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性。由于環(huán)狀RNA對(duì)核酸酶不敏感，所W比線(xiàn) 性RNA更為穩(wěn)定，運(yùn)使得環(huán)狀RNA在作為新型臨床診斷標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢(shì)。 此外，近期研究顯示，環(huán)狀RNA在不同物種中起到miRNA海綿的作用，稱(chēng)之為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA (ceRNA)，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而調(diào)控祀基因的表達(dá)，例如有研究發(fā)現(xiàn)的一個(gè)環(huán)狀RNA-CDRlas(也稱(chēng)為ciRS-7)，在其序列上有超過(guò)60個(gè)保守的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，因此，起到有效的 miR-7海綿作用，能夠影響miR-7祀標(biāo)基因活性。在斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)中，該環(huán)狀RNA的表達(dá)能夠損 害中腦發(fā)育，與敲除miR-7效果一致。此外，S巧也被證實(shí)起到miR-138的海綿作用。通過(guò)高通 量測(cè)序和生物信息學(xué)分析手段，研究者們?cè)诓溉閯?dòng)物轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了數(shù)W千計(jì)的環(huán)狀RNA， 說(shuō)明環(huán)狀RNA很有可能就是一類(lèi)新的調(diào)控型內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA(ceRNA)。運(yùn)說(shuō)明，環(huán)狀RNA可能 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合疾病相關(guān)的miRNA在疾病調(diào)控中發(fā)揮著非常重要的作用。雖然很多CircRNA 是由蛋白編碼基因產(chǎn)生，但是還沒(méi)有結(jié)果顯示CircRNA在細(xì)胞中編碼蛋白，環(huán)狀RNA也因此 被定義為一類(lèi)新型非編碼RNA。其主要通過(guò)"1個(gè)W上的外顯子反向剪接成環(huán)"形成，是非線(xiàn) 性的、自我環(huán)化的非編碼RNA分子，常定位于細(xì)胞質(zhì)中。circRNA分位于細(xì)胞質(zhì)中富含miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，能結(jié)合并抑制miRNA，進(jìn)而解除miRNA對(duì)其祀基因的抑制作用，升高祀基因的表達(dá) 水平。常規(guī)存在于線(xiàn)性RNA分子中的3'和5'端在環(huán)狀RNA中被連接形成了閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。而 經(jīng)典的RNA檢測(cè)方法只能分離具有化IyA"尾己"結(jié)構(gòu)的RNA分子，所W環(huán)轉(zhuǎn)RNA在W往的研究 中通常被忽略了。大部分環(huán)狀RNA在細(xì)胞漿中富集，其豐度有時(shí)甚至比相應(yīng)的線(xiàn)性mRNA高10 余倍，運(yùn)可能是由于環(huán)狀RNA比線(xiàn)性RNA更穩(wěn)定造成的。核酸酶往往通過(guò)識(shí)別線(xiàn)性RNA分子末 端發(fā)揮作用，環(huán)狀RNA是一個(gè)閉合結(jié)構(gòu)，因此對(duì)核酸酶具有高耐受性。環(huán)狀RNA在細(xì)胞質(zhì)中富 集，同時(shí)與對(duì)應(yīng)的線(xiàn)性RNA具有相同的轉(zhuǎn)錄序列，說(shuō)明環(huán)狀RNA很有可能是通過(guò)影響miRNA的 結(jié)合來(lái)行使功能。更為重要的是，由于環(huán)狀RNA的高表達(dá)和穩(wěn)定特性，它在與其它的線(xiàn)性?xún)?nèi) 源競(jìng)爭(zhēng)性RNA共同作用過(guò)程中能夠顯示異常突出的ceRNA活性。除了 ceRNA活性，環(huán)狀RNA也 有可能與RNA結(jié)合蛋白R(shí)BPs結(jié)合，或與其它RNA堿基互補(bǔ)結(jié)合甚至結(jié)合RNA的翻譯蛋白，從而 影響基因的正常功能。
[0005] 近來(lái)研究開(kāi)始關(guān)注于CircRNA可能在疾病病理方面起到的作用。例如，環(huán)狀A(yù)NRIL (cANRIL)是長(zhǎng)鏈非編碼RNA ANRIL的環(huán)狀拼接形式，其在人類(lèi)細(xì)胞中的表達(dá)與該位點(diǎn)上幾 個(gè)可能影響ANRIL拼接的SNP有關(guān)，能調(diào)節(jié)INK4/ARF的水平并增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。運(yùn) 項(xiàng)研究充分證明CircRNA與疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，并能很好地作為疾病新型生物標(biāo)記。而與 疾病關(guān)聯(lián)miRNA的相互作用則說(shuō)明環(huán)狀RNA能夠參與疾病調(diào)節(jié)，例如，環(huán)狀RNAciRS-7在人腦 組織中豐富表達(dá)，與腦特異性microRNA miR-7相互作用;而ciRS-7含有多個(gè)串聯(lián)的miR-7結(jié) 合位點(diǎn)，因此可W作為內(nèi)源性的miRNA海綿，抑制miR-7活性。考慮到miR-7是各種不同癌癥 相關(guān)通路的重要調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也因能直接調(diào)節(jié)a-突觸核蛋白和泛素蛋白連接酶A(U邸2A) 的表達(dá)而可能與帕金森和阿茲海默疾病的發(fā)生相關(guān)，所WciRS-7有可能作為神經(jīng)性系統(tǒng)疾 病和癌癥發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子。
[0006] 更多的證據(jù)顯示，CirRNA在miRNA水平的微調(diào)上起著非常重要的作用，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合miRNA來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，而已有的研究證實(shí)，miRNA在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起到重要的 調(diào)節(jié)作用，因此，CirRNA可能進(jìn)一步參與抑郁癥的病理調(diào)控過(guò)程;而且缺乏特異性的生物標(biāo) 記物，造成臨床診斷缺乏客觀(guān)指標(biāo)，增加了診斷誤診率，因此，探討抑郁癥診斷和療效觀(guān)察 的特異性生物標(biāo)記物CirRNA,對(duì)于抑郁癥的診斷、治療、預(yù)防等均具有重要的意義和價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種用于抑郁癥診斷的CircRNA標(biāo)志物。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種用于抑郁癥診斷的 circRNA標(biāo)志物，所述標(biāo)記物包括hsa_ci;rcRNA_002143、hsa_ci;rcRNA_l03636、hsa_ circRNA_100679 和 hsa_circRNA_104953 四種 circRNA 的組合。所述 hsa_circRNA_002143、 hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679 和 hsa_circRNA_104953 為相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中的 RNA 代號(hào)，可W在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到。
[0009] 優(yōu)選的，所述用于抑郁癥診斷的circRNA標(biāo)志物為hsa_circRNA_103636。
[0010] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抑郁癥診斷試劑盒，其能夠測(cè)定血液中的hsa_ circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679 和 hsa_circRNA_104953運(yùn)四 種circRNA的含量。
[0011] 優(yōu)選的，所述抑郁癥診斷試劑盒能夠測(cè)定血液中的hsa_circRNA_103636的含量。 [0012]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了 hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、 hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953四種circRNA在制備抑郁癥診斷試劑盒中的應(yīng) 用。
[OOU] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了 hsa_circRNA_103636在制備抑郁癥診斷試劑盒 中的應(yīng)用。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述試劑盒含有hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_ 103636、hsa_circRNA_l 00679 和 hsa_circRNA_l 04953 的引物和探針。
[001引優(yōu)選的，所述試劑盒含有hsa_circRNA_10363的引物和探針。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述hsa_circRNA_002143的正向引物如沈Q ID N0.1 所示，hsa_circRNA_002143的反向引物如沈Q ID ^.2所示;113曰_(3山。1?酷_103636的正向引 物如569 10^.3所示，113日_。1'。1?論_103636的反向引物如569 10^.4所示；113日_ 。山。1?酷_100679的正向引物如沈9 10^.5所示113曰_(3山。1?酷_100679的反向引物如沈9 10 NO.6所示;hsa_circRNA_104953的正向引物如沈Q ID NO.7所示，hsa_circRNA_104953的反 向引物如沈Q ID NO.8所示。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述hsa_circRNA_002143的探針序列如沈Q ID N0.9 所示;hsa_circRNA_103636的探針序列如沈Q ID ^.10所示;113曰_(3^。1?酷_100679的探針 序列如沈9 10^.11所示;1133_(3山。1?酷_104953的探針序列如沈9 10^.12所示。
[0018] 在本發(fā)明的第=方面，提供了一種抑郁癥診斷基因忍片，包括探針和固相支持物 組成，所述探針序列如SEQ ID NO.9~12所示，所述固相支持物包括玻璃片、娃片、聚丙締 膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙締膜。
[0019] 優(yōu)選的，抑郁癥診斷基因忍片，包括探針和固相支持物組成，所述探針序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0020] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的circRNA標(biāo)志物， 所述標(biāo)記物為 hsa_ci;rcRNA_103636。
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了 hsa_circRNA_103636在制備評(píng)估抗抑郁癥藥物 療效試劑盒中的應(yīng)用。
[0022] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的試劑盒，其能夠測(cè)定 血液中的hsa_circRNA_103636的含量。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述試劑盒含有hsa_circRNA_103636的引物及探針。
[0024] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述hsa_circRNA_100364的正向引物如沈Q ID N0.3 所示;113曰_(3；[1^1?酷_100364的反向引物如沈010^.4所示。
[00巧]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述hsa_circRNA_100364的探針序列如沈Q ID N0.10 所示。
[0026]所述診斷試劑盒和評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的試劑盒中還可W包括PCR反應(yīng)常用試 劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs ,MgCl 2和DEPC水等;還可W含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌罚?在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，選用了 e-Actin作為內(nèi)參。
[0027] 上述人類(lèi)抑郁癥診斷試劑盒中優(yōu)選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑 是定量PCR擴(kuò)增試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑，運(yùn)些試劑的特性W及它們的配制方法均是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的；所述的試劑例如(但不限于）：陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品；還可W 包括巧光定量PCR反應(yīng)板、PCR反應(yīng)板封口膜等。
[0028] 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種技術(shù)(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印跡分 析，溶液雜交檢測(cè)等)測(cè)定相關(guān)CircRNA在抑郁癥患者和健康人群中的水平;在本發(fā)明的具 體實(shí)施方案中，使用了定量PCR的方法。
[0029] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的基因忍片，包括探針 和固相支持物，所述探針序列如SEQ ID NO. 10所示，所述固相支持物包括玻璃片、娃片、聚 丙締膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙締膜。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于:CircRNA具有高度穩(wěn)定性、特異性和敏感性，本發(fā)明提供 了抑郁癥生物標(biāo)記物和預(yù)測(cè)抗抑郁藥物療效的CircRNA標(biāo)記物。經(jīng)臨床驗(yàn)證之后，具有較高 的特異性和敏感值，有較高的診斷參考價(jià)值，CircRNA作為抑郁癥特異性生物標(biāo)記物將帶來(lái) 抑郁癥診斷及治療的革命性改變。
[0031] 1、抑郁癥的診斷將不依靠主觀(guān)經(jīng)驗(yàn)判斷，而是可W通過(guò)CircRNA表達(dá)水平運(yùn)種客 觀(guān)指標(biāo)檢查，進(jìn)行確診，提高診斷準(zhǔn)確率，簡(jiǎn)化診斷過(guò)程；
[0032] 2、有望通過(guò)CircRNA模擬物和括抗物(修飾寡核巧酸)改變特定CircRNA表達(dá)水平 能夠使異常的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路正?；M(jìn)而治療抑郁癥；
[0033] 3、有望通過(guò)檢測(cè)特定CircRNA表達(dá)水平對(duì)抗焦慮藥物的療效進(jìn)行預(yù)測(cè)；
[0034] 4、有望通過(guò)檢測(cè)特定CircRNA表達(dá)水平對(duì)抑郁癥患者轉(zhuǎn)歸及預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測(cè)；
[0035] 5、有望通過(guò)CircRNA模擬物和括抗物對(duì)特定抑郁癥某種特定癥狀進(jìn)行針對(duì)性治 療。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1基因忍片篩查差異表達(dá)IncRNA火山圖（說(shuō)明:X軸是差異倍數(shù)W2為底取對(duì)數(shù)的 值，Y軸是p-value值WlO為底取負(fù)對(duì)數(shù)的值?；疑c(diǎn):Fold change絕對(duì)值<2，P值>0.05的 基因。黑色點(diǎn):化Id change絕對(duì)值> 2，P值< 0.05的基因，運(yùn)些為顯著性差異基因）。
[0037] 圖2為抑郁癥患者與對(duì)照者存在差異性表達(dá)的CircRNA的RT-PCR分析圖。
[003引圖 3 為hsa_circRNA_103636 的 ROC 曲線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 病例組(MDD)為2014年4月到2015年1月，在解放軍102醫(yī)院和常州婦幼保健院的患 者，共入組100例。入組患者均滿(mǎn)足美國(guó)精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版(DSM-IV-TR)中M孤 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。診斷是由2名精神科醫(yī)師根據(jù)the Chinese version of the modified Structured Clinical Interview for DSM-IV,patient version(SCID-I/P)(First et al. ,1995)上的診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者分別進(jìn)行測(cè)評(píng)，運(yùn)兩名精神科醫(yī)師間的可信度是0.87,最后 使用HAMD量表中的24條目來(lái)評(píng)估焦慮癥患者的嚴(yán)重程度。入組標(biāo)準(zhǔn)：1.入組前=個(gè)月內(nèi)未 使用抗抑郁藥物;2.漢族，年齡18歲到60歲；3.無(wú)嚴(yán)重器質(zhì)性疾病史(例如屯、臟病，糖尿病， 帕金森綜合癥），入組前6個(gè)月未發(fā)生過(guò)嚴(yán)重的生活創(chuàng)傷事件;4.沒(méi)有其它的精神疾病(精神 分裂癥，人格障礙）。
[0040] 健康對(duì)照組(NC)為同期臨近機(jī)構(gòu)的103名健康體檢人員，漢族，無(wú)嚴(yán)重器質(zhì)性疾病 史(例如屯、臟病，糖尿病，老年癡呆），入組前1個(gè)月未發(fā)生過(guò)嚴(yán)重的生活創(chuàng)傷事件。正常對(duì)照 組經(jīng)過(guò)HAMD和structured clinical interview for DSM-IV,nonpatient edition (SCID--I/P)檢查確認(rèn)沒(méi)有患MDD或其它精神疾病。在男女比例及年齡配比上與病例組一 致。
[0041] 本研究獲得中國(guó)人民解放軍第102醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)和常州婦幼保健院批準(zhǔn)， 所有受試者或受試家屬(監(jiān)護(hù)人)均簽署知情同意書(shū)。
[0042] 在開(kāi)展研究前，首先對(duì)參加本課題的精神專(zhuān)科醫(yī)師和研究生進(jìn)行培訓(xùn)。采用漢密 頓抑郁量表化AMD)、大體評(píng)定量表(GAS)、臨床療效總評(píng)量表(CGI)在病例入組前、藥物治療 4周后、藥物治療8周后分別進(jìn)行評(píng)估。由兩位精神科主治醫(yī)師根據(jù)DSM-IV-TR對(duì)患者進(jìn)行診 斷，如果出現(xiàn)不一致情況，則請(qǐng)一位精神科主任醫(yī)師共同討論后確定診斷。
[0043] 入組時(shí)記錄一般情況(姓名、性別、年齡、民族、文化程度、職業(yè)、收入水平、婚姻狀 況、藥物成癒史及精神疾病家族史等）。同樣，記錄正常對(duì)照組一般情況。
[0044] 二、研究方法
[0045] ①評(píng)估工具
[0046] 漢密爾頓抑郁量表化AMA):由屯、理學(xué)家Hamilton于1960年編制，是目前臨床評(píng)定 抑郁狀態(tài)時(shí)應(yīng)用最為普遍的量表。本研究采用24項(xiàng)中國(guó)版本，分為7個(gè)因子，分別是焦慮/軀 體化，體重，認(rèn)知癥狀，日夜變化，阻滯，睡眠障礙和無(wú)助，其信度和效度已經(jīng)得到驗(yàn)證。本研 究中使用HAMA量表的中文版本進(jìn)行評(píng)估，該版本經(jīng)信效度檢驗(yàn)分析，達(dá)到屯、理測(cè)量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
[0047] 大體評(píng)定量表(GAS):大體評(píng)定量表是評(píng)價(jià)各類(lèi)精神疾病癥狀的量表，在同類(lèi)量表 中是應(yīng)用最廣泛的一種。本研究使用的是美國(guó)屯、理衛(wèi)生研究所(NIMH) 1976年的Spitzer版 本，共有10級(jí)評(píng)定分（1~10分），根據(jù)患者臨床癥狀進(jìn)行評(píng)定。總分越高，說(shuō)明病情越輕。本 研究中使用GAS量表的中文版本進(jìn)行評(píng)估，該版本經(jīng)信效度檢驗(yàn)分析，達(dá)到屯、理測(cè)量學(xué)標(biāo) 準(zhǔn)。
[0048] 臨床療效總評(píng)量表(CGI):臨床療效總評(píng)量表由WHO設(shè)計(jì)，用于國(guó)際精神疾病試點(diǎn) 調(diào)查（IPSS)的研究，現(xiàn)用W評(píng)定臨床療效，適用于任何精神科治療和研究對(duì)象。量表分為病 情嚴(yán)重程度（severity of illness,SI),療效總評(píng)(global improvement,GI)和療效指數(shù) (efficacy index，EI )S個(gè)分量表。本研究中使用CGI量表的中文版本進(jìn)行評(píng)估，該版本經(jīng) 信效度檢驗(yàn)分析，達(dá)到屯、理測(cè)量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。本研究中使用疾病嚴(yán)重程度分（severity Of illness ,SI)和療效總評(píng)分（global improvement，GI)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0049] ②資料收集
[0050] 入組時(shí)記錄一般情況(姓名、性別、年齡、民族、文化程度、職業(yè)、收入水平、婚姻狀 況、藥物成癒史及精神疾病家族史等）。由3名精神科主治醫(yī)師或醫(yī)師使用漢密爾頓抑郁量 表化AMA)和臨床療效總評(píng)量表(CGI)于用藥前及用藥8周W上對(duì)病例組被試進(jìn)行評(píng)定。評(píng)定 前，所有參與研究人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，統(tǒng)一方法學(xué)等，保證施測(cè)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化。其中HAMA使用 總分和因子分統(tǒng)計(jì)，CGI使用療效總評(píng)分(g 1 oba 1 improvement, GI)統(tǒng)計(jì)。
[0051 ]③藥物干預(yù)
[0052]在GAD組中，對(duì)入組患者采用每日口服舍曲林(起始劑量50mg，平均劑量IOOmg，劑 量范圍50~15〇111旨）、米氮平(起始劑量7.5111旨，平均劑量15111旨，濟(jì)|量范圍7.5~22.5111旨）、西獻(xiàn) 普蘭(起始劑量20mg，平均劑量30mg，劑量范圍20~40mg)、氣伏沙明（起始劑量50mg，平均劑 量lOOmg，劑量范圍50~150mg)治療，并分別在初診（治療前，GAD0)、第4周（6wk)和第8周 (Swk)采血和HAMD評(píng)定。根據(jù)復(fù)診情況，連續(xù)選擇自研究起始治療前、第8周均有記錄的病例 共30例。
[0化3] ④主要試劑和耗材
[0054] LowI 叩 Ut Quick-Amp Labeling Kit, one-colo;r(24*)(Agilent，貨號(hào)：5190-2305)；Gene Expression Wash Pack(Agi Ient，5188-5327);Gene Expression Hybridization Kit(5188-4242);RNA Sp 化 e In Kit, one-color(5188-5327);巧光定量 PCR引物：Custom Plus TQMN RNA Assays(美國(guó)ABI公司）；巧光定量PCR試劑：TaqMan通用混 合試劑盒n(美國(guó)ABI公司，貨號(hào)：4440047);反轉(zhuǎn)錄試劑盒：QuantiTect Rev.Transcription Kit(QIAGEN，貨號(hào)：205311 )。
[0化日]⑤主要儀器
[0056] 掃描儀（儀器來(lái)源：Af fymetrix，型號(hào)：Scanner 3000 );雜交爐（儀器來(lái)源： Affymetrix，型號(hào)：Hybridization Oven 640);洗涂工作站（儀器來(lái)源:Affymetrix，型號(hào)： Fluidics Station 450);2100(儀器來(lái)源:Agilent,型號(hào)：G2939A);2100振蕩器(儀器來(lái)源： Agilent,型號(hào)：9600);化noD;rop(The;rmo,2000) ;PCR儀（ABI ,9700);離屯、機(jī)（e卵endo;rf， 5418);濃縮儀（e郵endow，5301);離屯、機(jī)（其林貝爾，LX-200);離屯、機(jī)-1 (其林貝爾，LX-300);振蕩器-U其林貝爾，Gk88B);磁力攬拌器(其林貝爾，Gk3250B);金屬浴-2(博日， 皿-100);金屬浴-3(博日，C皿-100);電熱恒溫培養(yǎng)箱(精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備，XMTD-8222);冰箱(榮 事達(dá)，BCD-265F);ABI9700型PCR儀(美國(guó)ABI公司）；天美CT14RD型臺(tái)式高速冷凍離屯、機(jī)(上 海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）；化no化OPiooo超微量紫外分光光度計(jì)（附電腦1套） (美國(guó)Iliermo公司）；ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(附電腦 1套）（美國(guó)ABI公 司）;WH-2微型縱滿(mǎn)混合儀(上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司）；JS-400A恒溫金屬浴(上海培清 科技有限公司）；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)）；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工 作臺(tái)（蘇凈凈化設(shè)備有限公司）；-8 rc超低溫冰箱（日本=洋公司）。
[0化7] ⑥RNA提取和CircRNA忍片篩查
[005引所有被試者使用抓TA抗凝管采肘靜脈血5ml，在3000 Xg的轉(zhuǎn)速下分別離屯、10分 鐘。用重力梯度離屯、機(jī)將外周血單核淋己細(xì)胞分離出來(lái)后，將其置于凍存管中，-8(TC保存 備用。在抗抑郁癥治療后3周及6周時(shí)W同樣的方法重復(fù)收集30名MDD患者的外周血單核淋 己細(xì)胞。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,HiIden,Germany)從單核淋己細(xì)胞中提取總RNA，具 體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。并用化noDrop ND-1000 (HiermC) Scientif ic ,Delaware, ME,USA)進(jìn)行擴(kuò)增。血樣取自5名MDD患者(23歲，31歲，33歲的男性各一名；45歲，52歲的女性 各一名）和5名健康體檢人員（20歲，33歲，35歲的男性各一名;63歲，43歲的女性各一名），用 來(lái)進(jìn)行A;rrays1:ar Human circRNA Array analysisoRNA質(zhì)檢合格后，樣本的標(biāo)記、忍片的 雜交W及洗脫參照忍片標(biāo)準(zhǔn)流程。首先，總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成用 切anine-3-CTP(切3)標(biāo)記的cRNA。標(biāo)記好的cRNA和忍片Arraystar Human circRNA Array (8xl5K, Ar raystar,USA)雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。
[0059] ⑦逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0060] 對(duì)忍片篩查結(jié)果中的10種差異表達(dá)明顯的CircRNA進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR驗(yàn)證。并用 100名MDD患者和103名健康對(duì)照組的血液樣本驗(yàn)證運(yùn)10種差異性表達(dá)的circRNA。按照RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqMan RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)ABI公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，C ircRNA 巧光擴(kuò)增探針是由Invitrogen Company(USA)合成的。實(shí)時(shí)巧光定量PCR按照化qMan試劑盒 (化qMan通用混合試劑盒II，美國(guó)ABI公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0061 ]⑧藥物干預(yù)
[0062] 根據(jù)C ircRNA忍片普和RT-PCR的結(jié)果，選出4個(gè)差異表達(dá)明顯的C ir cRNA和30名M孤 患者來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的抗抑郁癥的研究。其中10例服用米氮平（起始劑量7.5mg，劑量范圍 7.5-22.5mg，平均劑量15mg)同時(shí)服用西膚普蘭(起始劑量20mg，劑量范圍20-40mg，平均劑 量30mg)，8例服用舍曲林(起始劑量50mg，劑量范圍50-150mg，平均劑量IOOmg)輔W米氮平， 12例服用氣伏沙明（起始劑量50mg，劑量范圍50-150mg，平均劑量IOOmg)輔W米氮平。由3名 精神科醫(yī)師使用HAMD對(duì)病例組被試的疾病嚴(yán)重程度和療效進(jìn)行評(píng)定，在治療前，藥物干預(yù) 治療后4周，8周時(shí)使用HAMD對(duì)患者分別進(jìn)行評(píng)定并且利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)此時(shí)30患者血樣 中CircRNA的表達(dá)水平。同樣，記錄正常對(duì)照組一般情況。評(píng)定前，3名醫(yī)師進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，熟 練掌握標(biāo)準(zhǔn)化施測(cè)程序。
[0063] ⑨統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0064] 使用X2檢驗(yàn)分析MDD組和NC組的性別差異;使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析MDD組與NC 組間年齡的差異?；鹕綀D用來(lái)分析兩組間差異表達(dá)的circRNA(標(biāo)準(zhǔn)為P值含0.05并且化Id change值> 2.0，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。采用Mann-WMtn巧秩和檢驗(yàn)病例組（SZ)和對(duì)照組(NC)之 間circRNA的相對(duì)表達(dá)量。Univariate repeated measures analysis of variance用來(lái)檢 測(cè)S次（用藥前，用藥4周及8周后）之間circRNA的表達(dá)差異分析。作受試者工作特征曲線(xiàn) (R0C曲線(xiàn))分析;并作多變量觀(guān)察值的ROC曲線(xiàn)，分析對(duì)應(yīng)的靈敏度(敏感度)和特異度。全部 數(shù)據(jù)用DataAssist v3.0Sl:atistical Package for Social Sciences for Windows 20.0 (SPSS Inc. Chicago，IL，USA)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[00化]S、研究結(jié)果
[0066] 1、基因忍片分析發(fā)現(xiàn)，15種CircRNAs在抑郁癥病例組與對(duì)照組之間存在顯著差 異，其中4種上調(diào)，11種下調(diào)，見(jiàn)圖1和表1。
[0067] 表1抑郁癥病例組與對(duì)照組10種差異表達(dá)的CircRNA
[n0ARl
[
[0070] 2、MDD與NC的各circRNA表達(dá)水平比較，hsa_circRNA_002143表達(dá)上調(diào)，hsa_ circRNA_103636，hsa_circRNA_100679，hsa_circRNA_104953表達(dá)下調(diào)（P<0.05或口< 0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。
[0071] 表2MDD病例組與對(duì)照組A CT比較片±句
[0072]
[0073] 3、30例MDD患者各CircRNA在抗抑郁藥治療前、治療4周、治療8周的比較中，只有 hsa_circRNA_103636 顯著上調(diào)，見(jiàn)表 3。
[0074] 表3抗抑郁藥物治療前后CircRNAs的A CT差異比較(完=ts)
[0075]
[0076] 4、對(duì)hsa_circRNA_103636抑郁癥診斷價(jià)值的接受者操作特征曲線(xiàn)（ROC)分析發(fā) 現(xiàn)，hsa_circRNA_103636的AUC為0.632(95 %CI: 0.533-0.688)，敏感度和特異度分別為 0.73、0.65,見(jiàn)圖3。四、用于抑郁癥診斷的基因忍片的制備
[0077] 采用序列如SEQ ID NO.9~12所示的四種探針，該部分的核巧酸的平均長(zhǎng)度為29 個(gè)堿基，它的3'端與共有序列1的5'端相接，在它的5'端接上15個(gè)堿基組成的無(wú)義鏈寡核巧 酸rCCGGCCTATTATGGCCGG")，使得每一條核巧酸探針的總長(zhǎng)度約為50個(gè)堿基。將每條探針 的3'端進(jìn)行氨基修飾，使之能夠和玻璃板上的聚合娃發(fā)生共價(jià)反應(yīng)從而固定到忍片表面。 然后將運(yùn)些探針?lè)謩e在用于制備忍片的玻璃板上平行點(diǎn)樣=次。
[0078] 忍片的制備采用涂有有機(jī)娃的Corning GAPS-2玻璃板（目錄號(hào)：#40003,供應(yīng)商： Corning Inc.，美國(guó)）為支持材料，并用Sma;rtA;rray點(diǎn)樣機(jī)（型號(hào)SmartArray-AS,供應(yīng)商： 化p;UalBio Co巧，中國(guó)）點(diǎn)樣，每個(gè)探針點(diǎn)的直徑為150凹1，相鄰探針點(diǎn)中屯、間的距離為240 WH，點(diǎn)完探針樣品后讓玻璃片在室溫下干燥24小時(shí)，然后按下述方法清洗掉未共價(jià)結(jié)合的 DNA和點(diǎn)樣緩沖液:把玻璃片放在一個(gè)燒杯中并在燒杯中放一個(gè)攬拌子，在25 °C用0.2 %的 SDS洗涂?jī)纱危看?分鐘，然后在50°C用蒸饋水洗兩次，每次5分鐘，再在25°C用0.1 M四氨棚 二鋼溶液洗涂5分鐘，用0.2 % SDS洗涂=次，每次1分鐘，用蒸饋水洗2次，每次1分鐘。將玻璃 片室溫下于空氣中徹底驚干后用于雜交檢測(cè)。
[0079] 本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引 用作為參考那樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于抑郁癥診斷的circRNA標(biāo)志物，其特征在于所述標(biāo)記物包括hsa_circRNA_ 002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679 和 hsa_circRNA_104953 四種 circRNA 的 組合。2. -種抑郁癥診斷試劑盒，其特征在于能夠測(cè)定血液中的1183_〇;[1'〇1?祖_002143、1183_ circRNA_103636、hsa_circRNA_100679 和 hsa_circRNA_104953 四種 circRNA 的含量。3. 如權(quán)利要求2所述的抑郁癥診斷試劑盒，其特征在于上述試劑盒含有hsa_circRNA_ 002143、hsa_circRNA_l 03636、hsa_circRNA_l 00679 和 hsa_circRNA_l 04953 的引物及探針。4. 如權(quán)利要求3所述的抑郁癥診斷試劑盒，其特征在于所述hsa_circRNA_002143的正 向引物如SEQ ID N0.1 所示，hsa_circRNA_002143的反向引物如SEQ ID N0.2**;hsa_ circRNA_103636的正向引物如SEQ ID N0.3所示，hsa_circRNA_103636的反向引物如SEQ ID N0.4所示;hsa_circRNA_100679的正向引物如SEQ ID N0.5所示hsa_circRNA_100679的 反向引物如SEQIDN0.6所示;hsa_circRNA_104953的正向引物如SEQIDN0.7所示，hsa_ circRNA_104953的反向引物如SEQIDN0.8所示 ； 所述hsa_circRNA_002143的探針序列如SEQ ID勵(lì).9所示；1183_(^代1?祖_103636的探 針序列如SEQIDN0.10所示;hsa_circRNA_100679的探針序列如SEQIDN0.11所示 ;hsa_ circRNA_104953的探針序列如SEQIDN0.12所示。5. -種抑郁癥診斷基因芯片，其特征在于包括探針和固相支持物，所述探針序列如SEQ ID NO.9~12所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜或 聚苯乙烯膜。6. -種用于評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的circRNA標(biāo)志物，所述標(biāo)記物為hsa_circRNA_ 103636。7. -種用于評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的試劑盒，其特征在于能夠測(cè)定血液中hsa_ circRNA_103636 的含量。8. 如權(quán)利要求7所述的評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有 hsa_circRNA_103636 的引物和探針。9. 如權(quán)利要求8所述的評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的試劑盒，其特征在于所述hsa_ circRNA_100364的正向引物如SEQ ID N0·3所示；hsa_circRNA_100364的反向引物如SEQ ID NO.4所示； 所述hsa_circRNA_100364的探針序列如SEQIDN0.10所示。10. -種評(píng)估抗抑郁癥藥物療效的基因芯片，其特征在于包括探針和固相支持物，所述 探針序列如SEQ ID NO. 10所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素 膜、尼龍膜或聚苯乙烯膜。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105861716SQ201610349579
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月24日
【發(fā)明人】張理義
【申請(qǐng)人】張理義