特異性針對mlaa-34的引物對和探針及熒光定量rt-pcr試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異性檢測MLAA?34的熒光定量RT?PCR試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒中包括特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA?34的引物對和探針，以及檢測急性單核細胞白血病分子標志物MLAA?34所需內參基因ABL的引物對及探針；分子標志物MLAA?34的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示。利用本發(fā)明提供的快速簡便、檢測結果好的試劑盒，對單核細胞白血病患者體內MLAA?34基因表達水平進行監(jiān)測，填補WHO在M5分子診斷及分型的空白并為疾病的預后提供參考。
【專利說明】
特異性針對MLAA-34的引物對和探針及黃光定量RT-PCR試劑 盒和檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學和生物技術領域，設及一種巧光定量RT-PC時式劑盒，具體設 及一種特異性針對MLAA-34的引物對和探針及巧光定量RT-PCR試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 急性白血病為一種惡性血液系統疾病。2001年，WHO提倡對白血病進行MICM分型 (即根據細胞形態(tài)學、免疫學、遺傳學、分子生物學特征分型）,MICM分型除了更深入細致地 分析白血病細胞形態(tài)學和免疫學特征外，著重提出了急性白血病中非隨機染色體異常及其 分子改變與特定亞型的臨床表現和生物學特性之間的密切聯系，強調分子診斷的重要性； 并已在某些白血病類型中確定了特異基因，如急性早幼粒細胞白血病的PMkRARa基因、M2 的AMLl-ETO基因等。根據特異基因表達、特異染色體將急性非淋己細胞白血病分為低危、中 危、高危組，不同組別應用不同方案治療;并分別應用WTl基因、PMkRARa基因、BCR-ABL基因 對急性白血病、M3、慢性粒細胞性白血病進行分子診斷、祀向治療、判斷復發(fā)及預后等。運一 現象也反映了細胞遺傳一分子一臨床病理之間的密切聯系，為臨床診斷、療效監(jiān)測和微小 殘留病變(MRD)檢測提供了可靠的指標。
[0003] 急性單核細胞白血病(M5)是急性髓性白血病(41山中較常見的類型，在我國，M5發(fā) 病率僅次于M2,占 AML的23.2%-26.9%，明顯高于西方國家報道的8%，大多數M5患者臨床 上突出表現為髓外浸潤、高白細胞計數、不良染色體核型比例高、完全緩解率(CR)低、易復 發(fā)、無病存活時間短。M5的異質性和復雜性決定其尚缺乏分子診斷和祀向治療的特異性腫 瘤標志物。
[0004] 急性單核細胞白血病新型分子標志物MLAA-34是
【申請人】課題組實驗人員鑒定出的 具有特異性抗體、陽性率高的M5抗原新基因，克隆出的其基因全長CDNA序列已在GenBank登 錄，序列編號為AY288977.2,通過生物信息學分析發(fā)現：MLAA-34基因是功能未知基因 CAB3化的一個新的剪接變體;應用RNAi技術研究發(fā)現MLAA-34基因是和急性單核細胞白血 病發(fā)生相關的新的抗調亡分子，慢病毒介導的過表達MLAA-34的U937細胞可顯著抑制細胞 調亡，并增加潛在的致瘤性。免疫共沉淀，鳥槍法測序和生物信息學分析示7巧巾蛋白質設及 細胞調亡或增殖的生物過程和信號通路，
【申請人】課題組已應用SYBR Green I巧光染料法的 實時巧光定量RT-PCR及Western Blot技術對急性單核細胞白血病組、非M5白血病組及正常 健康組的外周血單個核細胞（PBMNCs)中mRNA表達情況進行了檢測，發(fā)現MLAA-34基因的 mRNA及蛋白水平在AML-M5型白血病細胞中都是特異性高表達的，在非M5白血病組及正常健 康組中為低表達或不表達。
[0005] 白血病M畑的殘留白血病細胞數量少，一般方法難W檢測，因此需要應用敏感度高 的方法檢測。目前，可通過檢測已確定的特異分子標記物的基因表達對某些類型白血病進 行分子診斷及病情監(jiān)測，其特異性強、敏感度高，是MRD檢測的理想分子標志。近幾年發(fā)展起 來的實時巧光定量PCR技術顯著提高了PCR產物定量的準確性，且操作簡單，在M畑檢測中顯 示巨大的作用。實時巧光定量PCR在PCR擴增的同時檢測PCR產物，因此確保在PCR擴增的指 數期準確定量，且PCR后無須再對樣本進行操作，極大地減少了PCR產物的污染機會。目前， 臨床上已廣泛應用實時巧光定量PCR技術檢測白血病標志分子BCR-A化(慢性粒細胞白血 ?。?、MLl-ETO(急性粒細胞白血病部分分化型）、PML-RARa (急性早幼粒細胞白血?。0X11 (T細胞性急性淋己細胞白血病)等W進行相應類型白血病的分子診斷、療效判斷及M畑檢測 等。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性檢測急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34 的巧光定量RT-PC時式劑盒及其檢測方法，該試劑盒特異性好，靈敏度高，能夠準確的檢測人 體中特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的表達水平;檢測方法簡單、易操 作。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術方案來實現：
[0008] 一種特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的引物對和探針，特異 性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009] 一種特異性檢測MLAA-34的巧光定量RT-PCR試劑盒，包括特異性針對急性單核細 胞白血病分子標志物MLAA-34的引物對和探針，W及檢測急性單核細胞白血病分子標志物 MLAA-34所需內參基因 A化的引物對及探針;其中：
[0010] 特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示；
[0011] 內參基因 A化的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 5 所示，探針序列如SEQ ID NO.6所示。
[0012 ]試劑盒內包括:1)待檢測標本;2)陰性對照品；3)陽性參考品；
[001引 4)分子標志物MLAA-34反應液;5)內參基因 ABL反應液;6) 2 X Mix;試劑盒中的試劑 量滿足20人份測試使用。
[0014] 1人份測試用量的目的基因巧光定量PCR反應體系包括：
[0015] cDNA 模板 5ul;
[0016] MLAA-34 反應液 7ul;
[0017] 2XMix 13ul；
[001引其中，cDNA模板為提取的待檢測標本逆轉錄反應產物；
[0019] MLAA-34反應液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及Iul探針。
[0020] 1人份測試用量的內參基因反應體包括：
[0021] cDNA 模板 加1;
[0022] 內參基因A化反應液 7ul;
[0023] 2 XMix 13ul；
[0024] 其中，cDNA模板為提取的待檢測標本逆轉錄反應產物；
[0025] 內參基因反應液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及Iul探針。
[0026] 所述的陰性對照品采用工藝用水；所述的陽性參考品采用質?；旌弦海↖X 1〇2~I X 1〇6拷貝的MLAA-34參考品，W及I X 1〇2~I X 1〇6拷貝的ABL參考品。
[0027] 利用上述特異性檢測MLAA-34的巧光定量RT-PCR試劑盒進行檢測的方法，包括W 下步驟：
[002引1)采集人體骨髓或外周血1.5~2ml，邸TA抗凝，低溫冷藏備用；
[0029] 2)將采集的血液標本在化內用化izol法及經典氯仿法抽提單核細胞RNA，DEPC水 溶解，-80°C保存；
[0030] 3)采用商用試劑盒對步驟2)獲得的樣本RNA進行逆轉錄反應，得到CDNA模板；
[0031] 4)將CDNA模板、MLAA-34反應液及2 XMiX混合后，組成反應體系，同時，CDNA模板、 內參基因 A化反應液及2XMix混合后，組成該樣本的內參反應體系;再制作標準曲線，然后 采用巧光定量PCR法檢測樣本骨髓或外周血中的分子標志物MLAA-34的相對表達量。
[0032] 巧光定量PCR反應條件為:94°C預變性3min，94°C變性15s，60°C退火延伸Imin,共 45個循環(huán)。
[0033] 與現有技術相比，本發(fā)明具有W下有益的技術效果：
[0034] 本發(fā)明將利用化qMan探針，分別擴增目標基因和管家基因 ABL，W管家基因作為內 標對目標基因的定量結果進行校正，消除反轉錄W及樣品制備過程產生的人為差異對定量 結果的影響，建立巧光定量RT-PCR方法檢測MLAA-34基因表達水平的方法。利用本發(fā)明提供 的快速簡便、檢測結果可靠、敏感的試劑盒，對單核細胞白血病患者體內MLAA-34基因表達 水平進行監(jiān)測，敏感度、特異性均較高，且操作方法簡單，無需跑凝膠電泳，能為急性單核細 胞白血病的輔助診斷及后續(xù)治療結果的判定提供依據。
【附圖說明】
[0035] 圖1為樣本RNA完整度測定結果；
[0036] 圖2為6例樣本及標準品PCR擴增曲線；
[0037] 圖3為MLAA-34與內參基因標準曲線。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0039] 本發(fā)明的特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的引物對如SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO.2所示，探針如沈Q ID NO.3所示。
[0040] 具體的引物、探針信息如下：
[0041 ] MLAA-34F:5 '-GCAAGCTGTGGTTGATCAGTG-3 '
[0042] MLAA-34R:5 '-GATGAAGTAGCCTTTATCGTC-3 '
[004；3] MLAA-34P: FAM-5 ' -ACAACTTCTAAGGAGGCAACCTC-3-TAMRA;
[0044] 檢測分子標志物MLAA-34所需的內參基因 ABL，其特異性引物對如SEQ ID NO.4， 沈Q ID NO.5所示，探針如沈Q ID NO.6所示。
[0045] 具體的引物、探針信息如下：
[0046] A化 F:5'-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3'
[0047] ABL R:5'-GCCTTGGCCATTTTGGTT-3'
[0048] A化 P:FM5'-TGGTGTGAAGCCC-3'TMRA。
[0049] 所述試劑盒的統一濃度及I人份測試用量的統一標準為：
[(K)加]
[0化1 ]
[0052] 該巧光定量RT-PCR檢測方法包括如下步驟：
[0053] 1)血液標本的收集:采集人體骨髓或外周血1.5-2ml，邸TA抗凝，低溫冷藏；
[0054] 2)標本RNA的提取:標本采集后化內用化izol法及經典氯仿法抽提單核細胞RNA， DEPC水溶解，-80°C保存；
[0055] 3)逆轉錄反應:采用商用試劑盒對步驟2)獲得的樣本RNA進行逆轉錄反應，得到 CDNA模板，具體每個樣本RNA用量為IOul，按照試劑盒說明書進行；
[0056] 4)巧光定量PCR法檢測樣本骨髓或外周血中新型分子標志物MLAA-34的相對表達 量。
[0化7] 5)統計分析:檢測599例樣本，包括骨髓血樣本385例(初發(fā)M5 42例、初發(fā)M4 31例、 初發(fā)AML 44例、初發(fā)ALL 32例、其他惡性腫瘤36例、其他非腫瘤疾病41例、完全緩解M5 33 例、復發(fā)M5 27例，完全緩解M4 32例、完全緩解其他類型AML 34例、完全緩解ALL33例)及外 周血樣本214例（初發(fā)M5 32例、完全緩解M5 30例，復發(fā)M5 22例，初發(fā)M4 34例、初發(fā)其他類 型AML 31例、初發(fā)ALL 34例、其他非腫瘤疾病31例）后對檢測結果行ROC曲線分析后發(fā)現對 于骨髓標本，當MLAA-34相對表達量含1.27E-3時，可診斷為初發(fā)M5,此時診斷的敏感度為1， 特異度為0.815;當骨髓單個核細胞MLAA-34表達量^ 2. Ol祀-5時，可判斷為為M5CR，此時診 斷的敏感度為0.833，特異度為0.733;當骨髓單個核細胞MLAA-34表達量含2.53祀-3時，可 診斷為M5復發(fā)，此時診斷的敏感度為0.929，特異度為0.918，診斷準確度較高。對于外周血 標本，當單核細胞MLAA-34相對表達量含1.26祀-3時，可診斷為初發(fā)M5，此時該檢驗方法的 敏感度為0.917，特異度為0.8;當患者外周血單個核細胞MLAA-34表達量< 2.014E-5時，可 診斷為M5CR，診斷的敏感度為0.833，特異度為0.725;當患者外周血單核細胞MLAA-34相對 表達量^ 2.41化-3時，可診斷為M5復發(fā)，此時診斷試劑盒的敏感度為0.96，特異度為0.88。
[0058] 具體的，巧光定量PCR反應體系：
[0059] 特異性針對急性單核細胞白血病新型分子標志物MLAA-34的巧光定量PCR反應體 系及內參基因 ABL反應體系均為：
[0060] 取步驟3)所述的逆轉錄反應產物加，2XMixl3ul，上下游引物各3ul(加 M)，探針 Iul (5uM)，體系共25ul，另取濃度分別為1 X 100拷貝All、1 X 1000拷貝All、1 X 10000拷貝/ UiaxiOOOOO拷貝AiUl X 1000000拷貝All的MLAA-：M標準品加，2 XMixl3ul，上下游引物 各3ul (5uM)，探針I(yè)ul (5uM)，體系共25ul，分別加樣進行PCR反應，內參基因反應體系同上。
[0061] 取如下各種反應液及Mix,室溫融化并震蕩混勻后，短暫離屯、數秒。MLAA-34反應 液、內參反應液體系I人份均按表1所示，各反應液成分如表2所示。
[0062]表1擴增試劑需求表 「nnw
[0070] 基線的確定：
[0071] 軟件默認設定3-15個循環(huán)的平均巧光信號為基線。在實驗中，一般選擇曲線波動 較小，較穩(wěn)定的那段作為基線，可根據實際情況自行酌情調整。起點要避開開始幾個循環(huán)由 于高溫導致的信號增高，設在信號已經降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方，終點要避免覆 蓋信號已經有明顯增長的地方。根據實驗曲線走勢的不同，一般start值可選擇在3-8之間； stop值選擇W起點與終點之間最好能間隔8個循環(huán)W上為原則，W更好滿足統計基線標準 偏差的數學要求。闊值的確定:在陰性對照物擴增的情況下，闊值設定在無擴增曲線樣本的 最高點，即高于無擴增增長曲線（即在結果分析"Component"欄中無拐點出現)的最高點，切 陰性對照未檢出為原則，確定起始闊值。
[0072] 結果判定：
[0073] 陽性參考品1-5在MLAA-34和內參反應中分別設定為：1 X 1〇6,1 X 1〇5,1 X 1〇4,1 X IO3，1 X IO2，在擴增結束后，用獲得的相應兩條標準曲線，分別得到各標本MLAA-34的檢測濃 度(A)和內參基因 AMj勺檢測濃度(B)，報告為MLAA-34的檢測濃度(A)和內參基因的檢測濃 度(B)的比值即(A/B) X 100%。
[0074] 實施例1
[0075] 本實施例中提供特異性針對單核細胞白血病新型分子標志物MLAA-34檢測試劑盒 用于檢測患者骨髓血或外周血6例未知樣本的操作步驟。
[0076] 1、試劑準備：
[0077] 根據待測樣本數量，取11份（6人份待測樣本+5份MLAA-34陽性標準品）X 7ul (77ul )MLAA-34反應液與 11 人份 X 13ul 2 XMIX液（143ul)充分預混成PCR-mixl (220ul)，同 理11份(6人份待測樣本巧份內參標準品）X 7ul (77ul)內參反應液與11人份X 13ul 2 X MIX 液（143ul)充分預混成PCR-mix2(220ul)，分別瞬時離屯、后備用。
[0078] 2、樣本處理和加樣：
[0079] 1)采集20人份骨髓或外周血1.5-2ml，邸TA抗凝，低溫冷藏；
[0080] 2)化izol法提取樣本中單核細胞RNA:取和樣本等體積的冷藏淋己細胞分離液加 入離屯、管靜置至室溫，緩慢小屯、吸取骨髓/外周血標本距離淋己細胞分離液液面Icm高度緩 慢滴加，注意上下液面勿混勻；220化pm離屯、20min;小屯、吸取中間的白膜層于EP管中；加入 足量的PBS液吹打混勻，120化pm離屯、5min，棄去上清液，重復此步驟2-3遍;加入1血Trizol 吹打混勻后于-80°C保存；
[0081 ] 3)取上述-80°c保存的RNA提取液IOOul，加入300U1RNA抽提液用力徹底混勻，加入 200-400U1氯仿，混勻，室溫放置5分鐘。15000巧m離屯、10分鐘，離屯、后吸取無色上清液200-300ul，并轉移到1.5ml離屯、管中。在上述裝有上清液的1.5ml離屯、管中加入1-1.5倍體積預 冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻后室溫放置10分鐘。ISOOOrpm離屯、10分鐘，吸棄上清;在上述離 屯、管中，加入700ul預冷的無水乙醇，ISOOOrpm離屯、10分鐘，吸棄上清。室溫10分鐘，使乙醇 揮發(fā)。加入50ul DEPC-dd出0混勻溶解，W此作為相關PCR反應的模板；
[0082] 4)將上述樣本RNA經紫外分光光度計檢測，結果如表4所示，所測A260/280比值均 在1.8到2.0之間，表示RNA純度良好，無明顯有機溶劑及蛋白質、DNA殘留。
[0083] 用化OZil試劑經典法提取的樣本RNA經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，漠化乙錠染色后 電泳產物28s 18s 5s條帶清楚無彌散，28s/18s約等于2:1，最上方無 DNA污染條帶，RNA完整 性良好，無明顯降解及DNA污染，如圖1所示。
[0084] 表4樣本RNA純度測定表
[n0R5l Luubo」 4 j聯上還FUK化應候恢iUui，按化巧巧巧刑晶^閣于上巧概苛生物巧化巧限公巧； 說明書進行逆轉錄反應；
[0087] 5)分別取上述同一逆轉錄反應產物5ul/人份加入2個不同PCR反應管中，取重組 MLAA-34陽性標準品及標準品（濃度梯度依次為1 X IO2~1 X IO6拷貝All)各加1分別加入 5個不同PCR反應管中，取陰性對照物加 1加入2個PCR反應管中，靜置IOmin;
[0088] 6)將上述兩管相同逆轉錄反應產物PCR反應管及陰性對照物PCR反應管中分別加 入20ul PCR-mixl與PCR-mix2，同理在MLAA-34陽性標準品及A化標準品反應管中分別加入 20ul PCR-mixl與PCR-mix2,吸打混勻2-3次，蓋上管蓋(去除氣泡），2000巧m離屯、30s。
[0089] 3、在巧光定量PCR儀上進行PCR擴增：
[0090] 1)將PCR反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設置待測樣本名稱；
[0091] 2)巧光檢測通道選擇:選擇FAM通道(Repor ter: FAM，如encher: None)檢測MLAA-34 與A化表達量;參比巧光設置為none;
[0092] 3)巧光定量PCR反應條件為：
[0093] 94°C預變性3min，94°C變性15s，60°C退火延伸Imin,共45個循環(huán)；
[0094] 4)結果分析：
[00%]反應結束后，儀器自動保存結果，可W利用儀器自帶的軟件進行自動分析(也可W 手動調芐基線的開始值、結束值W及闊值線進行分析），然后記錄樣本Ct值和定值結果。擴 增曲線和闊值線的交點，稱為Ct值（即cycle t虹eshold，指PCR反應管內的巧光信號達到設 定的闊值時所經歷的循環(huán)數），擴增曲線如圖2所示，標準曲線如圖3所示。
[0096] 使用儀器自帶的軟件分別對MLAA-34與內參基因 A化的標準品繪制標準曲線，同時 計算樣本MLAA-34與ABL基因表達量并導出到EXCEL表格中，MLAA-34表達量設為a，ABL表達 量設為b，計算a/b值，結果設為C，即為樣本MLAA-34相對表達量，結果如表5所示。
[0097] 表5樣本MLAA-34相對表達量測定
[00981
[0099] 對所測之值進行如下判定：
[0100] 對于骨髓標本，樣本1目的基因相對表達量含1.27E-3，可診斷為初發(fā)或復發(fā)M5，樣 本2、3、4、5、6均為非]?5。
[0101] 本發(fā)明通過化qman探針巧光定量PCR法對人體內單核細胞白血病新型分子標志物 MLAA-34表達水平進行檢測，對于骨髓血標本，當此試劑盒用于M5臨床診斷時，診斷的敏感 度為1，特異度為0.815 ;當此試劑盒用于判斷M5療效時，診斷的敏感度為0.833,特異度為 0.733;當此試劑盒用于判斷M5復發(fā)時診斷的敏感度為0.929，特異度為0.918，診斷準確度 較高。對于外周血標本，當此試劑盒用于M5臨床診斷時，該檢驗方法的敏感度為0.917,特異 度為0.8;當此試劑盒用于判斷M5療效時，診斷的敏感度為0.833，特異度為0.725;當此試劑 盒用于判斷M5復發(fā)時，診斷的敏感度為0.96,特異度為0.88。此試劑盒檢測敏感度、特異度 較高且操作方法簡單，能為急性單核細胞白血病的輔助診斷及后續(xù)治療結果的判定提供依 據。
【主權項】
1. 一種特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的引物對和探針，其特征 在于，特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1 所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示。2. -種特異性檢測MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，包括特異性針對急 性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的引物對和探針，以及檢測急性單核細胞白血病分 子標志物MLAA-34所需內參基因 ABL的引物對及探針;其中： 特異性針對急性單核細胞白血病分子標志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1 所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示； 內參基因 ABL的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5所示， 探針序列如SEQ ID NO.6所示。3. 如權利要求2所述的特異性檢測MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，試 劑盒內包括：1)待檢測標本;2)陰性對照品；3)陽性參考品；4)分子標志物MLAA-34反應液； 5)內參基因 ABL反應液;6) 2 X Mix;試劑盒中的試劑量滿足20人份測試使用。4. 如權利要求3所述的特異性檢測MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，1人 份測試用量的目的基因熒光定量PCR反應體系包括： cDNA模板 5ul; MLAA-34反應液 7ul; 2XMix 13ul； 其中，cDNA模板為提取的待檢測標本逆轉錄反應產物； MLAA-34反應液中包含3u 1上游引物、3u 1下游引物及l(fā)u 1探針。5. 如權利要求3所述的特異性檢測MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，1人 份測試用量的內參基因反應體包括： cDNA模板 5ul; 內參基因ABL反應液 7ul; 2XMix 13ul； 其中，cDNA模板為提取的待檢測標本逆轉錄反應產物； 內參基因 ABL反應液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及l(fā)ul探針。6. 如權利要求3所述的特異性檢測MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，所 述的陰性對照品采用工藝用水;所述的陽性參考品采用質?；旌弦?，包括IX 1〇2~IX 1〇6拷 貝的MLAA-34參考品，以及1 X 102~1 X 106拷貝的ABL參考品。7. 利用權利要求3~6中任意一項所述的特異性檢測MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒 進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取采集的人體骨髓或外周血1.5~2ml，用EDTA抗凝，低溫冷藏備用； 2) 將采集的血液標本在2h內用Trizol法及經典氯仿法抽提單核細胞RNA，DEPC水溶 解，-80 °C保存； 3) 采用商用試劑盒對步驟2)獲得的樣本RNA進行逆轉錄反應，得到cDNA模板； 4) 將cDNA模板、MLAA-34反應液及2 XMix混合后，組成反應體系，同時，cDNA模板、內參 基因 ABL反應液及2 XMix混合后，組成該樣本的內參反應體系；再制作標準曲線，然后采用 熒光定量PCR法檢測樣本骨髓或外周血中的分子標志物MLAA-34的相對表達量。8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，熒光定量PCR反應條件為:94°C預變性 3min，94°C變性15s，60°C退火延伸lmin，共45個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861720SQ201610368148
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】何愛麗, 楊云, 白菊, 陳娜, 王劍利, 王芳俠, 張鵬宇, 張王剛, 王佰言, 陳紅利, 王夏曼, 沈瑩, 蒙昕
【申請人】西安交通大學