專利名稱：鐵還原叢毛單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新菌種篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種鐵還原叢毛單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Fe(III)和腐殖質(zhì)是土壤中大量存在的兩種組分。Fe(III)主要以難溶性氧化鐵形式存在，在地殼中平均含量約為5.6％，是厭氧土壤中自然豐度最高的電子受體。腐殖質(zhì)是富含醌基的、非均相的天然有機(jī)混合物，是土壤有機(jī)質(zhì)的主體，約占有機(jī)碳總量的60～80％，在土壤肥力、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)等方面都具有重要作用。
腐殖質(zhì)還原又稱為腐殖質(zhì)呼吸，是指微生物通過呼吸作用，將電子轉(zhuǎn)移至土壤中的腐殖質(zhì)，將氧化態(tài)的腐殖質(zhì)還原成還原態(tài)腐殖質(zhì)，菌體在代謝過程中獲得能量的過程；近年的研究表明，腐殖質(zhì)可在厭氧環(huán)境中充當(dāng)有機(jī)物礦化的電子受體，加速有機(jī)污染物的降解。Fe(III)還原又稱Fe(III)呼吸，是指微生物通過呼吸作用將電子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外的鐵氧化物表面，將Fe(III)還原成Fe(II)，并從這一過程中獲得能量的過程。腐殖質(zhì)和Fe(III)呼吸的直接后果是將氧化態(tài)腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化為還原態(tài)，將Fe(III)轉(zhuǎn)化為Fe(II)，為有機(jī)物礦化與污染物還原修復(fù)提供基本驅(qū)動(dòng)力。據(jù)估計(jì)，在某些淹水土壤與淡水沉積物中，F(xiàn)e(III)/腐殖質(zhì)呼吸直接導(dǎo)致了80％以上的有機(jī)碳礦化，其貢獻(xiàn)超過硝酸鹽呼吸、硫酸鹽呼吸、產(chǎn)甲烷作用等其它厭氧代謝方式的總和。腐殖質(zhì)與Fe(III)還原條件下的污染物原位生物修復(fù)技術(shù)已成為國(guó)際熱點(diǎn)領(lǐng)域。
腐殖質(zhì)與Fe(III)還原是由特定微生物介導(dǎo)的酶促反應(yīng)，具有腐殖質(zhì)與Fe(III)還原活性的細(xì)菌是反應(yīng)得以進(jìn)行的關(guān)鍵。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腐殖質(zhì)與Fe(III)還原細(xì)菌100多株，主要分布于地桿菌屬(Geobactersp.)、希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)、脫硫桿菌屬(Desulfitobacteriumsp.)、脫硫弧菌屬(Desulfomicrobium sp.)等幾個(gè)屬。這些菌株尚存在以下缺陷1)大多數(shù)菌株只能在嚴(yán)格厭氧環(huán)境中生存，不利于大規(guī)模生產(chǎn)與實(shí)際應(yīng)用；2)菌株的電子供體利用譜較窄，只能利用乙酸、乳酸等小分子量有機(jī)物作為電子供體，不能利用葡萄糖、蔗糖等分子量較大的有機(jī)物，對(duì)實(shí)際應(yīng)用的環(huán)境要求相對(duì)較高。至今尚未發(fā)現(xiàn)具有腐殖質(zhì)還原或Fe(III)還原活性的叢毛單胞菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供具有腐殖質(zhì)還原和鐵還原活性的鐵還原叢毛單胞菌。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述鐵還原叢毛單胞菌在腐殖質(zhì)還原或三價(jià)鐵還原中的應(yīng)用。
本發(fā)明分離篩選所得的鐵還原叢毛單胞菌(Comamonasferrireducens)CY01為革蘭氏陰性菌，長(zhǎng)桿狀，于2007年3月12日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCC 1968。
一、菌種的分離、純化取5g古森林土壤樣品于100mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為(g/L)AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)0.0412g，乙酸鈉1.36g，NaHCO32.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，維生素溶液10.0mL(每升維生素溶液含生物素2.0mg，葉酸2.0mg，維生素B610.0mg，核黃素5.0mg，維生素B150mg，煙酸5.0mg，泛酸5.0mg，維生素B120.1mg，硫辛酸5.0mg)，微量元素溶液10.0mL(每升微量元素溶液中含氨三乙酸1.5g，MgSO4·7H2O 3.0g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.1g，CaCl20.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.01g，AlKSO4·12H2O 0.01g，H3BO30.01g，Na2M0O40.01g，NiCl2·6H2O 0.024g)，pH 5.0～5.5。接種前向培養(yǎng)液中鼓充高純混合氣體(N2/CO2＝80/20)≥1小時(shí)，鋁蓋密封，培養(yǎng)液置于厭氧工作站(N2/CO2＝80/20)，30℃靜置培養(yǎng)，檢測(cè)還原態(tài)腐殖質(zhì)模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)產(chǎn)率的同時(shí)觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況。當(dāng)還原態(tài)AQDS的產(chǎn)量不斷增加時(shí)，培養(yǎng)液從無色變?yōu)辄S色，顏色逐漸加深。當(dāng)培養(yǎng)液顏色穩(wěn)定不再變化時(shí)，以10％的接種量富集培養(yǎng)三次，然后稀釋，均勻涂布于固體培養(yǎng)基上(每升培養(yǎng)液加16克瓊脂，其它成分同上述液體培養(yǎng)基)，置于厭氧工作站(N2/CO2＝80/20)30℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行分離、純化。
二、本發(fā)明菌株具有如下形態(tài)和生理、生化特性(1)菌體形態(tài)特性采用常規(guī)細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，該菌株為革蘭氏陰性菌，長(zhǎng)桿狀，大小為1.2～1.5×0.3～0.4μm，具有運(yùn)動(dòng)性。
(2)菌落形態(tài)特性在牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基平板上好氧培養(yǎng)24小時(shí)后，菌落形態(tài)為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，淡粉色，菌落大小(d)為1～2mm；在上述培養(yǎng)基上好氧培養(yǎng)48小時(shí)后，菌落形態(tài)為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，黃色，菌落大小(d)為3～4mm。
(3)主要的生理、生化特性在好氧條件下氧化酶反應(yīng)為陽性，不產(chǎn)氣，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陽性。具有兼性厭氧生長(zhǎng)的能力；在好氧條件下，用BIOLOG鑒定后發(fā)現(xiàn)，在96種不同碳源中，該菌能利用其中的38種。在厭氧條件下能氧化的電子供體有丙三醇、葡萄糖、蔗糖；利用上述電子供體，該菌能還原檸檬酸鐵、氫氧化鐵、水鐵礦、針鐵礦等三價(jià)鐵，也能還原腐殖質(zhì)與腐殖質(zhì)模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)。
(4)分子生物學(xué)特性采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比24∶1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物F8和R1542擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA，在1500bp附近出現(xiàn)明顯的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測(cè)定，將獲得的DNA序列輸入GenBank，以Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)合上述的生理生化特性、16S rDNA序列的結(jié)果，該菌株應(yīng)歸屬于叢毛單胞菌屬，命名為鐵還原叢毛單胞菌(Comamonas ferrireducens)CY01。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，篩選出了鐵還原叢毛單胞菌，其具有腐殖質(zhì)還原和鐵還原活性。此菌能還原檸檬酸鐵、氫氧化鐵、水鐵礦、針鐵礦等三價(jià)鐵；也能還原腐殖質(zhì)與腐殖質(zhì)模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)。鐵還原叢毛單胞菌兼性厭氧，電子供體利用譜較廣，此菌能在厭氧條件下能氧化的電子供體有丙三醇、葡萄糖、蔗糖。


圖1為Comamonas ferrireducens CY01的掃描電鏡圖片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1菌種的分離、純化取5g古森林土壤樣品于100mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為(g/L)AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)0.0412g，乙酸鈉1.36g，NaHCO32.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，維生素溶液10.0mL(每升維生素溶液含生物素2.0mg，葉酸2.0mg，維生素B610.0mg，核黃素5.0mg，維生素B150mg，煙酸5.0mg，泛酸5.0mg，維生素B120.1mg，硫辛酸5.0mg)，微量元素溶液10.0mL(每升微量元素溶液中含氨三乙酸1.5g，MgSO4·7H2O 3.0g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.1g，CaCl20.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.01g，AlKSO4·12H2O 0.01g，H3BO30.01g，Na2M0O40.01g，NiCl2·6H2O 0.024g)，pH 5.0～5.5。接種前往培養(yǎng)液中鼓充高純混合氣體(N2/CO2-80/20)≥1小時(shí)，鋁蓋密封，培養(yǎng)液置于厭氧工作站(N2/CO2＝80/20)，30℃靜置培養(yǎng)，檢測(cè)還原態(tài)腐殖質(zhì)模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)產(chǎn)率的同時(shí)觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況。當(dāng)還原態(tài)AQDS的產(chǎn)量不斷增加時(shí)，培養(yǎng)液從無色變?yōu)辄S色，顏色逐漸加深。當(dāng)培養(yǎng)液顏色穩(wěn)定不再變化時(shí)，以10％的接種量富集培養(yǎng)三次，然后稀釋，均勻涂布于固體培養(yǎng)基上(每升培養(yǎng)液加16克瓊脂，其它成分同上述液體培養(yǎng)基)，置于厭氧工作站(N2/CO2＝80/20)30℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行分離、純化。
實(shí)施例2菌種的鑒定(1)生理生化性質(zhì)的測(cè)定表1.CY01菌株的生理生化特性

注+表示可以利用；-表示不能利用(2)分子生物學(xué)鑒定采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比24∶1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物F8和R1542擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA，在1500bp附近出現(xiàn)明顯的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測(cè)定，將獲得的DNA序列輸入GenBank，以Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析。結(jié)合上述的生理生化特性、16S rDNA序列的結(jié)果，該菌株應(yīng)歸屬于叢毛單胞菌屬，命名為鐵還原叢毛單胞菌(Comamonas ferrireducens)CY01。
實(shí)施例3還原活性的鑒定電子供體為葡萄糖，電子受體為水鐵礦培養(yǎng)基配方每升去離子水中含水鐵礦10g，NaHCO32.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，葡萄糖0.9008g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實(shí)施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃滅菌20分鐘，滅菌時(shí)葡萄糖和其它成分分開，滅菌后將葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2＝80/20)≥1小時(shí)，接種C.ferrireducens CY01細(xì)菌懸浮液，使其菌數(shù)達(dá)到108/mL，于30℃靜置厭氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加菌的對(duì)照。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔5天取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分振蕩1.5小時(shí)。鄰菲羅林法測(cè)定Fe(II)的含量，計(jì)算Fe(III)還原率。Fe(III)還原率＝Fe(II)濃度/Fe(III)起始濃度×100％。
表2以葡萄糖為電子供體，水鐵礦為電子受體，驗(yàn)證了C.ferrireducens CY01菌株的鐵還原能力。
表2.不同培養(yǎng)時(shí)間下的Fe(III)還原率(％)

實(shí)施例4還原活性的鑒定電子供體為葡萄糖，電子受體為針鐵礦培養(yǎng)基配方每升去離子水中含針鐵礦9g，NaHCO32.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，葡萄糖0.9008g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實(shí)施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃滅菌20分鐘，滅菌時(shí)葡萄糖和其它成分分開，滅菌后將葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2＝80/20)≥1小時(shí)，接種C.ferrireducens CY01細(xì)菌懸浮液，使其菌數(shù)達(dá)到108/mL，于30℃靜置厭氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加菌的對(duì)照。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔10天取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分振蕩1.5小時(shí)。鄰菲羅林法測(cè)定Fe(II)的含量，計(jì)算Fe(III)還原率。Fe(III)還原率＝Fe(II)濃度/Fe(III)起始濃度×100％。
表3以葡萄糖為電子供體，針鐵礦為電子受體，驗(yàn)證了C.ferrireducens CY01菌株的鐵還原能力。
表3.不同培養(yǎng)時(shí)間下的Fe(III)還原率(％)

實(shí)施例5還原活性的鑒定電子供體為蔗糖，電子受體為水鐵礦培養(yǎng)基配方每升去離子水中含水鐵礦10g，NaHCO32.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO42H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(配方同實(shí)施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃滅菌20分鐘，滅菌時(shí)蔗糖和其它成分分開，滅菌后將蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2＝80/20)≥1小時(shí)，接種C.ferrireducens CY01細(xì)菌懸浮液，使其菌數(shù)達(dá)到108/mL，于30℃靜置厭氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加菌的對(duì)照。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔5天取4mL培養(yǎng)液于16mL 0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分振蕩1.5小時(shí)。鄰菲羅林法測(cè)定Fe(II)的含量，計(jì)算Fe(III)還原率。Fe(III)還原率＝Fe(II)濃度/Fe(III)起始濃度×100％。
表4以蔗糖為電子供體，水鐵礦為電子受體，驗(yàn)證了C.ferrireducens CY01菌株的鐵還原能力。
表4.不同培養(yǎng)時(shí)間下的Fe(III)還原率(％)

實(shí)施例6還原活性的鑒定電子供體為蔗糖，電子受體為針鐵礦培養(yǎng)基配方每升去離子水中含針鐵礦9g，NaHCO32.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實(shí)施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃滅菌20分鐘，滅菌時(shí)蔗糖和其它成分分開，滅菌后將蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2＝80/20)≥1小時(shí)，接種C.ferrireducens CY01細(xì)菌懸浮液，使其菌數(shù)達(dá)到108/mL，于30℃靜置厭氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加菌的對(duì)照。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔5天取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分振蕩1.5小時(shí)。鄰菲羅林法測(cè)定Fe(II)的含量，計(jì)算Fe(III)還原率。Fe(III)還原率＝Fe(II)濃度/Fe(III)起始濃度×100％。
表5以葡萄糖為電子供體，水鐵礦為電子受體，驗(yàn)證了C.ferrireducens CY01菌株的鐵還原能力。
表5.不同培養(yǎng)時(shí)間下的Fe(III)還原率(％)

實(shí)施例7還原活性的鑒定電子供體為葡萄糖，電子受體為腐殖質(zhì)模型物AQDS
培養(yǎng)基配方每升去離子水中含AQDS 0.0412g，NaHCO32.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實(shí)施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃條件下滅菌20分鐘，滅菌時(shí)葡萄糖和其它成分分開，滅菌后將葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2＝80/20)≥1小時(shí)，接種C.ferrireducens CY01細(xì)菌懸浮液，使其菌數(shù)達(dá)到108/mL，于30℃靜置厭氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加菌的對(duì)照。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔1天取培養(yǎng)液用0.22μm細(xì)菌濾器把菌體等沉淀濾掉，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定還原型AQDS的含量，計(jì)算AQDS的還原率。AQDS還原率＝還原態(tài)AQDS濃度/AQDS起始濃度×100％。
表6以葡萄糖為電子供體，AQDS為電子受體，驗(yàn)證了C.ferrireducens CY01菌株的腐殖質(zhì)還原能力。
表6.不同培養(yǎng)時(shí)間下的AQDS還原率(％)

實(shí)施例8還原活性的鑒定電子供體為蔗糖，電子受體為腐殖質(zhì)(購(gòu)自美國(guó)Aldrich公司)培養(yǎng)基配方每升去離子水中含腐殖質(zhì)0.5g，NaHCO32.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實(shí)施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃滅菌20分鐘，滅菌時(shí)蔗糖和其它成分分開，滅菌后將蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2＝80/20)≥1小時(shí)，接種C.ferrireducens CY01細(xì)菌懸浮液，使其菌數(shù)達(dá)到108/mL，于30℃靜置厭氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加菌的對(duì)照。每隔1天取培養(yǎng)液用0.22μm細(xì)菌濾器把菌體等沉淀濾掉，測(cè)定還原態(tài)腐殖質(zhì)含量，計(jì)算腐殖質(zhì)的還原率。腐殖質(zhì)還原率＝還原態(tài)腐殖質(zhì)濃度/腐殖質(zhì)起始濃度×100％。
表7以蔗糖為電子供體，腐殖質(zhì)為電子受體，驗(yàn)證了C.ferrireducens CY01菌株的腐殖質(zhì)還原能力。
表7.不同培養(yǎng)時(shí)間下的腐殖質(zhì)還原率(％)

權(quán)利要求
1.一種鐵還原叢毛單胞菌，其特征在于其為革蘭氏陰性菌，長(zhǎng)桿狀，于2007年3月12日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCC1968。
2.權(quán)利要求1所述鐵還原叢毛單胞菌在腐殖質(zhì)還原或三價(jià)鐵還原中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鐵還原叢毛單胞菌及其應(yīng)用。發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，篩選出了鐵還原叢毛單胞菌，其具有腐殖質(zhì)還原和鐵還原活性。此菌能還原檸檬酸鐵、氫氧化鐵、水鐵礦、針鐵礦等三價(jià)鐵；也能還原腐殖質(zhì)與腐殖質(zhì)模型物AQDS(蒽醌－2，6－二磺酸)。鐵還原叢毛單胞菌兼性厭氧，電子供體利用譜較廣，此菌在厭氧條件下能氧化的電子供體有丙三醇、葡萄糖、蔗糖。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101070528SQ20071002838
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者周順桂, 武春媛, 王弋博, 李芳柏 申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所